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방법 논문

CA의 역할을 평가하기위한 영상 분석을 라이브

11.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50531

⸱

2013년 8월 25일

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

이 논문에서

요약

친 유성 염료 FM1-43에 노출 된 세포의 라이브 영상은 기공 형성 독소는 세포막에서 제거되는 반응 속도의 정밀한 결정을 허용한다. 이것은 CA에 대한 요구 사항이 +, sphingomyelinase 및 세포막 수리 및 다른 인자를 평가하는 데 사용될 수있는 민감한 분석이다.

초록

세포막 손상은 빈번한 이벤트이며, 상처는 빠르게 세포의 생존을 보장하기 위해 복구해야 할. 칼슘 2 +의 유입은 30 초 ~ 내의 세포막에 기계적인 상처의 수리를 트리거 키 신호 이벤트입니다. 최근의 연구는 포유 동물 세포는 또한 기공은 기공 엔도 시토 시스 뒤에 리소좀 효소 산 sphingomyelinase의 세포 외 유출을 포함하는 칼슘 2 +에 의존하는 과정에서 독소를 형성하는 permeabilization 후 자신의 세포막을 봉인 것으로 나타났다. 여기, 우리는 독소 streptolysin의 O에 의해 permeabilized 세포의 재 밀봉이 칼슘 2 + 유입에도 신속하고 종속이 있음을 입증하는 데 사용되는 방법을 설명합니다. 분석 설계는 허용 부상 이벤트의 동기화 및 촬상하여 세포막 무결성을 복원하고 liphophilic 염료 FM1-43 세포의 세포막에 도달하는 정도를 정량화하는 세포의 능력의 정확한 운동 측정. 이 라이브 분석 ALSO는 외생의 능력의 중요한 평가들이 세포막을 복구하는 세포의 능력을 반영 FM1-43의 유입을 억제하는 등 sphingomyelinase 같은 가용성 인자를 첨가한다. 이 분석은 우리가 효소의 세포 또한이 칼슘 2 +의 부재에서 permeabilized 세포의 재 밀봉을 촉진하기 때문에 sphingomyelinase, 캘리포니아 2 +에 의존하는 세포 외 유출의 하류 역할을하는 것이 처음으로 보여줄 수있었습니다.

서론

그것은 기계적인 손상 후 세포막 수리 칼슘 2 +에 의존하는 프로세스 1,2 것을 수십 년 동안 알려져있다. 나중에 연구는 상처를 통해 칼슘 2 +의 유입이 3,4 재 밀봉에 필요한 부상의 사이트에서 세포 내 소포의 세포 외 유출의 활발한 프로세스를 트리거 것으로 나타났다. 세포의 세포질에로드 형광 염료의 손실의 비율은 수리의 속도를 평가하는 데 사용하고, 재 밀봉이 손상 후 5 <30 초 이내에 완료되었다는 결론을 내렸다. 두 모델은 처음에 플라즈마 막 수리의 세포 외 유출에 대한 요구 사항을 설명하기 위해 제안했다 : 병변을 통해 칼슘 2 + 유입이 큰 "패치"를 형성, 세포 내 소포의 초기 호모 융합을 트리거 것을 제안 1) "패치"모델을하는 것 그 다음 상처 6 및 그 막 Adde 5의 제안 2) 장력 감소 모델을 봉인하는 세포막에 적용될상처의 근처에서 칼슘 2 + 의존성 세포 외 유출 d 개의 이중층 (7)의 재 밀봉을 용이하게 세포막 의욕을 감소시킬 것이다. 세포막 수리 칼슘 2 + 트리거 세포 외 유출의 역할은 상기 리소좀가 손상균 그들의 세포 외 유출 및 세포막 보수를 용이 칼슘 2 + 센서 분자 synaptotagmin VII 포함될 것을 보여주는 연구에 의해 보강되었다 8,9,10,11 .

그러나, 추가 증거만으로는 세포 외 유출이 세포막의 복구를 촉진하기에 충분하지이라고 지적했다. 원형질막에 기계적 눈물 이외에, 세포 상해의 빈번한 형태는 박테리아 12,13 또는 14,15 면역 세포에 의해 생성 된 기공 형성 독소 permeabilization이다. 기계적 눈물 달리 기공 형성 단백질은 세포막은 막을 "패치"를 적용함으로써 또는 현상 감소하여 단순히 재 밀봉 할 수없는 안정한 단백질 늘어선 기공 형성에 자신을 삽입막 긴장을 보내고. 흥미롭게 연구는 포유 동물 세포는 기공 형성 단백질과 permeabilization 후 자신의 세포막을 복구하는 효율적인 메커니즘을 가지고 있고,이 프로세스는 또한 세포 외 칼슘 2 + (12)의 존재를 필요로 것으로 나타났다. 기계적인 상처 (5)와 관찰이 발견은 세포 표면에서 횡단 기공 제거도 빠른 처리 여부의 문제를 제기했다. 과정은 칼슘 2 + 세포 필요로하고, 30 초 ~ 이내에 완료된다 놀랍게도, 우리의 최근의 연구는 기공 형성 독소 permeabilized 세포의 재 밀봉 기계적인 상처의 수리와 매우 유사한 특성을 가지고 것으로 나타났습니다. 이 과정을 자세히 조사하고, 우리는 최근 리소좀의 칼슘 2 + 규제 세포 외 유출뿐만 아니라, 세포막 수리 산 sphingomyelinase (ASM)을 효소 리소좀의 릴리스에 의해 트리거 필수입니다 엔도 사이토 시스의 빠른 형태를 포함 것을 알게 뿐만 아니라 일에 대한횡단 모공 전자의 제거뿐만 아니라, 기계적인 상처 (16)의 수리.

기공 형성 단백질과 permeabilization 후 세포 재 밀봉의 반응 속도를 결정하기 위해, 우리의 실험실에서 우리는 레이저 부상 고립 된 근육 섬유 (17)의 재 밀봉을 평가하기 위해 이전에 사용했던 라이브 영상 방법론을 적용. 이 분석은 안정적으로 형광 강도가 증가하고 지질 이중층의 외부 전단지에 인 인터 친 유성 염료 FM1-43의 특성에 의존한다. 세포막 이중층은 세포막의 손상을 감지하고 18,16,19,20를 복구하는 중요한 분석을 제공, 세포 내 세포막 세포 염료 이익 액세스 중단됩니다. 기공 형성 단백질과 permeabilization 후 세포 재 밀봉의 평가에이 분석을 적용하기 위해, 우리는 막 콜레스테롤 (21)에 결합하는 세균성 독소 streptolysin의 O (SLO), 4 ° C에서 세포를 미리 배양 하였다. 동기 셀permeabilization 후 쉽게 기공 형성을 횡단하는 형태의 리드 올리고머 및 변경을 활성화하는 가열 현미경 스테이지에서 매체 가온 얼음에서 세포를 이동시킴으로써 달성 될 수있다. 이 방법의 장점은, 레이저 상흔을 사용 이전에 발행 된 분석법을 통해, 셀들의 많은 수는 세포 집단의 더 나은 샘플링을 제공 현미경 분야에서 동시에 분석 될 수 있다는 점이다. 기공 형성 독소 기계적 손상과 permeabilization 후 본 셀 재 밀봉 공정의 기계적인 유사성을 감안할 때, 우리가 여기서 설명하는 분석은 세포막 수리의 기본 과정에 참여 요인을 해부에 매우 다양하고 강력한 방법을 제공한다. 예로서, 우리는 복구 프로세스의 칼슘 2 + 종속 독립 단계를 식별하는이 분석을 사용하는 것이 가능하다는 것을 보여준다.

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프로토콜

1. ASM의 전사 침묵

  1. 시드 1.5 X 10 DMEM 성장 매체의 2 ml 중 5 HeLa 세포 35mm 유리 바닥 접시에 (MatTek) (DMEM 높은 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 2 ㎜의 L-글루타민, 1 % 펜-Strep의 가진 글루코오스) 및 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 밤새 품어.
  2. 다음 날, 성장 미디어 대기음 및 siRNA의 형질 혼합물을 추가하기 전에 2 ㎖의 DMEM 감소 혈청 배지 (4 % FBS와 DMEM), 최소 1 시간으로 대체.
  3. siRNA를 올리고 형질 혼합물 4 튜브를 준비합니다. 튜브 및 C에서, 형질 전환되는 35mm 접시 당 250 μL의 티멤 감소 혈청과 4 ㎕의 리포 펙 타민 RNAiMax를 추가합니다. 관 B에서 티멤 250 μL가 형질 전환되는 35mm 접시 당, 제어 매체 GC 콘텐츠 올리고 (컨트롤의 siRNA)의 혈청과 8 μL (160 pmole의)를 감소 추가합니다. 관 D에서 추가 티멤 250 μL는 35mm 접시 t 당 SMPD1 올리고 (siASM)의 혈청과 8 μL (160 pmole의)을 감소오 형질 전환 될 수있다. 5 분간 실온에서 튜브를 배양한다.
  4. 형질 전환 제어의 siRNA에 대한 복잡하고 ASM의 siRNA에 대한 관 C와 D를 형성하는 관 A와 B를 결합합니다. 20 분 동안 실온에서 반응을 배양한다.
  5. 각각의 35-mm의 유리 바닥 요리에 컨트롤의 siRNA와 ASM siRNA의 형질 반응 천천히 혼합물, 적하, 추가 37 ° C / 5 % CO 2에서 품어. 24 시간 후 형질 전환에서 부드럽게 미디어를 대기음 신선한 DMEM 성장 용지로 교체합니다. 효율적인 ASM의 최저를 들어, 요리는 더 라이브 영상까지 약 31 시간 (총 55 시간) 동안 37 ° C / 5 % CO 2에서 배양해야한다.

2. 라이브 현미경 용 시약의 조제

  1. 칼슘 2 + 및 Mg를 2 +없이 차가운 1X PBS 100 NG / μL의 농도로 재조합 기공 형성 독소 Streptolysin O (SLO)의 솔루션을 준비합니다. 이러한 분석에 사용 SLO는 constitutivel이며친절 박사로드 Twete​​n, 오클라호마 대학교에서 제공하는 활동에 대한 환원제를 필요로하지 않는 Y 활성 시스테인 돌연변이. 독소는 E. 발현되었다 대장균 BL21 DE3 이전 16 바와 같이, 네이티브 조건에서 정제 하였다.
  2. FM1-43 원액을 준비 DMSO에 재현 탁 FM1-43 동결 건조 분말은 25 밀리미터 솔루션을 만들 수 있습니다.
  3. 솔루션을 준비 : 4 μM (1.5 ㎖를 MatTek 요리마다 필요한)의 최종 농도로 칼슘 2 +와 차가운 DMEM에서 FM1-43 원액을 희석하고 필요할 때까지 얼음에 저장합니다.
  4. 솔루션 B를 준비 4 μM (MatTek 요리에 필요한이 1.5 ㎖)의 최종 농도로 칼슘 2 + 10 mM의 EGTA (칼슘 2 + 무료 DMEM)없이 차가운 DMEM에서 FM1-43 원액을 희석 할 때까지 얼음에 저장 필요.
  5. 사전 따뜻한 (37 ° C) 에펜 도르프 튜브에 용액 A와 용액 B 1 ㎖ 분량 씩.
  6. 칼슘 2 +, 그리고 C와 DMEM의 얼음 솔루션을 유지2 +가없는 DMEM.

3. FM1-43의 치료 SLO에 유입 처리하지 않은 세포의 라이브 셀 이미징

  1. , 얼음 조각과 함께 중간 크기 얕은 금속 컨테이너를 채우기 얼음과 큰 유리 용기에 반전, 노출 된 금속 용기 만 바닥면을 떠나 추가로 얼음을 추가합니다. 심지어는 열 전달이 가능하도록 노출 된 금속 바닥에 젖은 종이 타월을 놓습니다.
  2. 하나의 제어 siRNA를 처리 MatTek 요리 (샘플 1)를 타고 차가운 젖은 종이 타월 위에 놓습니다. 부드럽게 모든 미디어를 대기음 차가운 칼슘 2 + 무료 DMEM으로 배를 세척한다. 마지막 세척 후, 접시에 모든 미디어를 대기음.
  3. 이미지 세포 관련 FM1-43 없음 SLO의 상흔 칼슘의 존재 (샘플 1)과 세포에서 +, 35-mm의 유리 바닥 접시의 중심 유리 coverslip에 추위 솔루션 B의 180 μl를 추가하고 5 알을 품다 분 얼음에 (표 1).
  4. 37 ° C로 가열하고, (온도, 습도, CO 2 수준을 유지) 환경 챔버가 장착 된 공 초점 현미경의 무대에 MatTek 요리를 놓습니다. 40X NA 1.3 목적 (니콘)을보고 이미지를 만들 세포의 필드를 찾을 수 있습니다. 가능한 경우, 온도 드리프트 보정하기 위해 PerfectFocus 또는 이와 유사한 장치를 켭니다.
  5. 부드럽게 35-mm 접시의 측면에 데워진 솔루션 1 ML을 추가하고 환경 챔버 (표 1)의 커버를 교체합니다.
  6. (UltraView 복스 퍼킨 엘머 회전 디스크 공 촛점 현미경 시스템에 Volocity) 적절한 이미징 소프트웨어를 사용하여 3 초마다 1 프레임에서 4 분 동안 이미지를 획득. FM1-43의 여자는 488 nm의 밴드 패스와 다이크로 익 필터를 사용하여 488 nm의 레이저 라인으로 수행하고, 배출 차별은 527 (W55) 방출 필터의 사용을 통해 달성된다. 레이저 전력 레벨 및 카메라 민감도는 100 밀리의 화상 노광을 달성하기 위해 설정된다.
  7. 반복 3.2 3.6에 그 단계 3.5 솔루션 B에 (표 1)를 추가해야합니다 제외하고, 칼슘 2 +의 부재에 SLO의 상흔 (샘플 2)로 제어 siRNA를 처리 한 세포에서 FM1-43를 검출하는 단계를 반복합니다.
  8. 존재 (샘플 3) 또는 칼슘 2 +의 부재 (샘플 4)의 중심 유리 커버 슬립에 SLO를 포함하는 차가운 솔루션 B의 180 μl를 추가로 하나 SLO로 부상 제어 siRNA를 처리 한 세포로 FM1-43의 유입을 측정하려면 35-mm 유리 바닥 요리와 단계 3.3에서와 같이 얼음에 5 분 동안 품어. 반복 3.6을 통해 3.2 단계, 3.5 단계 (표 1)에서 솔루션 또는 솔루션 B 중 하나를 추가 조정합니다.
  9. 세포막 수리 ASM의 역할을 확인하려면, 반복 모든 조건 (예제 5-8) (표 1)에 대해 ASM의 siRNA를 처리 한 세포를 사용하여 3.2-3.6 단계를 반복합니다.
  10. 세포에 재조합 sphingomyelinase (SM)의 역할을 결정하기 위해(FM1-43 유입의 억제에 의해 반사) 세포막 수리의 반응 속도는 (샘플 9 ~ 10), SM은 추가 단계 3.5 (0 ~ 50 μU)에 대한 해결 방법 중 하나 또는 솔루션 B 다음 라이브 세포 중 세포에 추가 1 ml의 (표 1)의 총 부피에서 촬상.

4. 세포에 FM1-43의 유입의 정량화

  1. 영화를 구입 한 후, 이미지 분석 소프트웨어 (Volocity 스위트, 퍼킨 엘머)를 사용하여 FM1-43의 세포 내 형광 강도를 측정한다. 필드에있는 각 셀의 세포질 영역에서 관심 영역을 그리고 비디오의 모든 프레임에 걸쳐 평균 FM1 -​​ 43 형광 강도를 결정하는 소프트웨어 도구를 적용합니다.
  2. 초기 FM1 -​​ 43 염색의 변화를 조정하기 위해 각 비디오의 데이터는 시간이 지남에 따라 형광 강도의 배 증가로 표현, 각각 다른 조건을 꾸몄다. 당 각 평가시기의 형광 배 증가셀은 F T는 특정 평가시기의 평균 형광이다 F T / F 0으로 계산되며, F 0 t = 0 (그림 1-2)에서의 평균 형광입니다.

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결과

리소좀 산 sphingomyelinase 고갈 세포에서 세균 sphingomyelinase (SM) 구조 세포막 보수 저농도.

FM1-43 영상 분석을 사용하여, 우리는 이전에 칼슘 2 +의 존재에 부상 리소좀 효소 ASM에 대한 결핍과 SLO에 노출 된 세포는 세포막의 결함이 재조합 인간 효소 (19)의 외 추가로 구출되는 것을 보여 주었다. 인간의 리소좀 ASM은 낮은 pH의 최적를 가지고 있기 때문에, 우리는 재 밀봉하는 것도 중성 pH에서 완전히 활성화되기 바실러스 세레 우스 (Bacillus cereus) (시그마)에서 정제 SM을 추가 복원 할 수 있는지 여부를 조사했다. 칼슘의 부재에서 컨트롤의 siRNA 또는 ASM의 siRNA 올리고 처리 및 SLO에 노출로 이전에 보여, 세포 + (수리 관대하지 조건)을 동일하게하는 ASM 고갈이 독소 (그림 1A에

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토론

기계 손상 및 세포막 수리에 대한 이전 연구는 유리 구슬, micropipetting, 전단, 긁거나 긁는을 삭제에 이르기까지, 손상 세포의 다양한 메커니즘에 의존했다. 이러한 분석법의 판독 오히려 정량보다 질적이고, 수리기구의 동역학에 정확한 정보를 제공하지 않았다. 부상 이러한 형태 후 자신의 원형질막을 봉인하는 세포의 능력은 세포막 투과성 염료, 세포질 효소 ATP 수준 또는 장기의 손실의 세포질 침투 세포 외액에 첨가 트레이서의 존재 또는 부재에 의해 측정했다 세포의 생존. 이러한 분석의 몇 가지 정량적으로 수행 할 수 있지만 빠른 속도로 단일 세포 수준에서 재 밀봉의 동력학을 평가하면서,이 연구에서 하나의 주요 장애물은, 상처를 입는 이벤트를 동기화의 어려움이었다.

근육 섬유의 UV-레이저 부상의 개발 및 사용 FOLLO친 유성 염료 FM1-43의 유입의 검출에 의해 결혼이 연구 17, 20의 주요 사전이었다. 대신 벗기거나 부상 유사한 기계적 수...

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공개 사항

저자는 더 경쟁 재정적 이해가없는 선언합니다.

감사의 글

이 작품은 우리가 SLO 발현 플라스미드 오클라호마 대학에서 박사 R. Twete​​n 감사 NWA에 NIH 보조금 R37 AI34867 및 R01 GM064625에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Reagent
strong>HeLa 229 세포주ATCCCCL2-1
DMEM High Glucose Invitrogen11965
DMEM High Glucose No CalciumInvitrogen20168
FM1-43InvitrogenT3163
Optimem Reduced SerumInvitrogen31985
Lipofectamine RNAiMaxInvitrogen13778
Control medium GC content RNAi oligoInvitrogen12935300
SMPD1 RNAi oligoInvitrogenHSS143988
Fetal bovine Serum 열 비활성화Gemini-Bioproducts100-106
Bacillus cereusSigma
35mm 유리 바닥 접시MatTekP35G-0-14
Material
Inverted microscopeNikonEclipse Ti
CameraHamamatsu PhotonicsC9100-50
Spinning disk confocal microscopePerkinElmerUltraViewVoX
Software analysis 소프트웨어PerkinElmerVolocity Suite
환경 챔버병리학 장치, LiveCell 시스템 챔버
S7651의 스핑고미엘린 : , , ,

참고문헌

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