유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)유래 한 근생 선조는 근 이영양증을 치료하는 세포 치료 전략에 대한 유망한 후보입니다. 이 프로토콜은 급성 및 만성 근육 재생의 마우스 모델에서 iPSC 유래 메소포아세포(근육 선조의 일종)의 이식 및 분화를 평가하는 데 필요한 이식 및 기능측정을 설명합니다.
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방법 논문
근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
환자 유래 iPSC는 미래의 자가 세포 치료 프로토콜을 위한 세포의 귀중한 근원일 수 있었습니다. iPSC 유래 근생 줄기/전구세포는 pericyte 유래 메소포아세포(iPSC 유래 메산지오블라스트와 같은 줄기/선조 세포: IDEM)와 유사한 근간이 영양증의 다른 형태에 의해 영향을 받는 환자로부터 생성된 iPSC에서 확립될 수 있다. 환자 별 IDEM은 다른전략(예: 렌즈피바이러스 벡터, 인간 인공 염색체)으로 유전적으로 교정될 수 있으며 근추행성 조절기 MyoD의 과발현시 근생 분화 가능성을 향상시킬 수 있다. 이 근생 잠재력은 그 때 특정 분화 분석과 시험관 내 평가되고 면역 형광에 의해 분석됩니다. IDEM의 재생 잠재력은 급성 및 만성 근육 재생을 표시하는 두 개의 대표적인 마우스 모델에서 근육 내 및 동맥 이식시 생체 내에서더 평가됩니다. 숙주 골격 근육에 IDEM의 기여는 이식 된 마우스에서 다른 기능 테스트에 의해 확인됩니다. 특히, 동물의 운동 능력의 개량은 러닝머신 테스트와 함께 연구된다. 세포 이식 및 분화는 이식된 근육에 대한 다수의 조직학적 및 면역형분석서에 의해 평가된다. 전반적으로, 본 논문은 현재 IDEM의 분화 능력을 평가하기 위해 활용되고 있는 분석 및 도구를 설명하며, 이식 방법과 세포 이식의 효능을 분석하기 위한 후속 결과 측정에 초점을 맞추고 있다.
서론
중안지오블라스트(MABs)는 복막1-3의하위 집합에서 유래된 혈관 관련 근육 전구체이다. 위성 세포 와 같은 표준 근육 전조를 통해 MABs의 주요 장점은4 동맥 내 전달 될 때 혈관 벽을 교차하는 능력에 상주하므로 세포 치료 프로토콜에서 골격 근 재생에 기여합니다. 이 기능은 근육 이영양증1,5,6의뮤린 및 개 모델 모두에서 평가및 확인되었습니다. 이러한 전임상 연구는 듀첸 근 위축증을 가진 아이들에 있는 기증자 HLA 동일 MABs의 동맥 이식에 근거를 둔 첫번째 인맨 단계 I/II 임상 시험을 위한 기초를 건설했습니다 (EudraCT No. 2011-000176-33; 현재 밀라노의 산 라파엘레 병원에서 가고 있습니다). 세포 치료 접근의 주요 장애물 중 하나, 세포의 수십억 전신의 근육을 치료 하는 데 필요한, "약용 제품"의 제한 된 증식 잠재력 (세포). 더욱이 최근에는 사지 거들 근이영양증 2D(LGMD2D)에서 발생하기 때문에 일부 형태의 근이영양증에 의해 영향을 받는 환자로부터 MAB를 얻을 수 없다는 것이 입증되었습니다. 오마이걸 #608099)7.
이러한 한계를 극복하기 위해 인간 및 뮤린 iPSC로부터 MAB와 같은 줄기/전구 세포를 유도하기 ....
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프로토콜
1. 근생 및 이식 잠재력 평가
-
시험관 내: MyoD 유도 분화
- 타목시펜 유도할 수 없는 MyoD-ER 렌티바이러스 벡터로 유도된 IDEMs의 안정적인 세포줄을 생성하여 감염의 복합성을 적시(MOI; 예를 들어, 1, 5 및 50) 1.1.9(MyHC)에 기재된 염색을 절차의 효율의 결과로 사용한다.
- 3.5cm 접시에 1ml의 5ml의 트리겔을 코팅하고 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 3.5cm 조직 배양접시에서 중간, 종자 1 x 105 MyoD-ER 변환 된 IDEM으로 접시를 두 번 세척하고 성장 배지에서 37 °C에서 배양하십시오.
- 세포가 1~2일 만에 합류에 도달한 다음 1μM 4OH-타목시펜을 성장 배지(1st dose)에 추가할 것으로 예상합니다.
- 24 시간 후, 1 μM 4OH-타목시펜 (2nd 및 마지막 복용량)으로 보충 된 분화 매체로 성장 배지를 교체하십시오.
- 매체의 절반을 매일 신선한 분화 매체로 교체하십시오.
- 매일 myotube 형성문화를 살펴본다.
- 1 주일 후 (분화 매체에서 5 일), PBS로 부....
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결과
보고된 대표적인 결과는 그림 1의워크플로우에 묘사된 시험관 내/생체 내 어비보 어서션의 주요 결과를 따릅니다. 48 시간 후 4OH-타목시펜 투여 후 MyoD 양성 핵은 문화권에서 MyoD-ER 변환 된 IDEM 내에서 식별 할 수 있습니다(도 2A). 그런 다음 세포가 융합되어 다핵된 심포우(그림2B)로분화한다. 급성 근육 손상의 뮤린 모델로 근육내 이식시, I뎀은 조직 재생에기여(도 3). 근육 이영양증의 뮤린 모델에 대한 유전자 및 세포 치료 설정에서 IDEM의 효능은 러닝머신 운동 내성 시험에 의해 평가되었다: 도 4는 야생형 MIDEM을 Sgca-null/scid/베이지 마우스로 이식한 후 얻은 결과를 나타내며, 처리된마우스7에서운동 용량의 개량화를 나타낸다. 이식된 근육의 Ex vivo 분석은 숙주 조직으로 IDEM의.......
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토론
iPSC는 자기 갱신 잠재력을 보존하면서 무기한 으로 확장될 수 있으므로 광범위한 세포계보(12)로분화하도록 지시될 수 있다. 이와 다른 이유로 iPSC 유래 줄기/전구 세포는 자가 유전자 및 세포 치료에 대한 유망한 원천으로간주됩니다(13)접근한다. 저자로부터 이전에 출판 된 작품은 백혈구 유래 MABs (IDEM)의 것과 유사한 표현형을 가진 iPSCs에서 마우스와 인간 근생 성 전조자의 생성과 근육 이영양증7의마우스 모델에서 근육 재생에 대한 효율적인 기여를보고했다.
IDEM 근생 전위를 최대화하기 위한 전제 조건은 세포내 근생인 묘드의 발현이다. 타목시펜유도할 수 없는 MyoD-ER 카세트와의 트랜스포션은 전체 배양에서의 활성화를 동기화하고 그 이후 생체 내에서 활성화할 수 있는 이점으로 표현식에대한 정확한 시간적 제어를 가능하게 했다. 근육당 세포의 단일 투여에 기초한 이식 전략(또는 대퇴동맥당).......
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공개 사항
F.S.T.는 국제 특허 출원을 출원했습니다(아니요. PCT/GB2013/050112) 이 문서에 설명 된 전략의 일부를 포함. 그는 자신의 연구를 위해 Promimetic 및 DWC 주식 회사에 의해 자금을 받았다.
감사의 글
저자는 줄리오 코스수, 마르티나 라가지와 도움이 되는 토론과 지원을 위한 전체 실험실, 그리고 제프 체임벌린에게 MyoD-ER 벡터를 친절하게 제공한 것에 대해 감사드립니다. 살아있는 동물과 관련된 모든 실험은 모든 관련 규제 및 기관 기관, 규정 및 지침에 따라 완료되었습니다. 저자 실험실에서 작업은 영국 의학 연구 위원회에 의해 지원됩니다, 유럽 지역 사회 7 프레임 워크 프로젝트 Optistem 및 바이오 디자인과 이탈리아 Duchenne 부모 프로젝트.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| MegaCell DMEM | 시그마 | M3942 | |
| DMEM | 시그마 | D5671 | |
| IMDM | 시그마 | I3390 | |
| 호스 세럼 | 유로클론 | ECS0090L | |
| 태아 소 세럼 | Lonza | DE14801F | |
| PBS 칼슘/마그네슘 프리 | 론자 | BE17-516F | |
| L-글루타민 | 시그마 | G7513 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 시그마 | P0781 | |
| 2-메르캅토에탄올 | Gibco | 31350-010 | |
| ITS (인슐린-트랜스페린-셀레늄) | Gibco | 51500-056 | |
| 비필수 아미노산 솔루션 | Sigma | M7145 | |
| 페르-인-솔 | 미드 존슨 | ||
| 페를릭시트 | 아벤티스 | ||
| 올레산 | 시그마 | 01257-10 mg | |
| 리놀레산 | 시그마 | L5900-10 mg | |
| 인간 bFGF | Gibco | AA 10-155 | |
| 성장 요인 감소 Matrigel | Becton Dickinson | 356230 | |
| 트립신 | 시그마 | T3924 | |
| 나트륨 헤파린 | Mayne Pharma | ||
| Trypan 블루 솔루션 | Sigma | T8154 | HARMFUL |
| 특허 블루 염료 | Sigma | 19, 821-8 | |
| EDTA | 시그마 | E-4884 | |
| 파라포름알데히드 | TAAB | P001 | 유해한 |
| 타목시펜 | 시그마 | T5648 | |
| 4-OH 타목시펜 | 시그마 | H7904 | |
| pLv-CMV-MyoD-ER(T) | 애드진 | 26809 | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9759 | 유해한 |
| 포비돈 요오드 | |||
| Tragachant 껌 | MP Biomedicals | 104792 | |
| 이소펜탄 | VWR | 24,872,323 | |
| 티슈텍 OCT | 사쿠라 | 4583 | |
| 설탕 | VWR | 27,480,294 | |
| 편광 유리 슬라이드 | Thermo | J1800AMNZ | |
| 에오신 Y | 시그마 | E4382 | |
| 헤마톡실린 | 시그마 | HHS32 | |
| Masson's 트리크롬 | Bio-Optica | 04-010802 | |
| 마우스 안티 미오신 중쇄 항체 | DSHB | MF20 | |
| 마우스 안티 라민 A/C 항체 | Novocastra | NLC-LAM-A/C |   |
| Hoechst 33342 | 시그마 Fluka | B2261 | |
| 토끼 안티 라미닌 항체 | 시그마 | L9393 | |
| MATERIALS AND EQUIPMENT | |||
| Adsorbable antibacterial suture 4-0 | Ethicon | vcp310h | |
| 30 G 바늘 주사기 | BD | 324826 | |
| 트레드밀 | 콜럼버스 악기 | ||
| 스테로현미경 | 니콘 | SMZ800 | |
| 도립 현미경 | Leica | DMIL LED | |
| Isoflurane 유닛 | Harvad 장치 | ||
| 광섬유 | Euromecs (네덜란드) | EK1 | |
| 가열 패드 | Vet Tech | C17A1 | |
| 메스 | Swann-Morton | 11REF050 | |
| 수술용 집게 | 파인 사이언티픽 도구 | 5/45 | |
| 고온 소작기 | Bovie Medical | AA01 | |
| MEDIA COMPOSITION | |||
| 미디어 구성은 아래에 자세히 설명되어 있습니다. HIDEMs 성장 배지:
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표 1. 시약, 재료, 장비 및 매체 목록. |
참고문헌
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat. Cell Biol. 9, 255-267 (2007).
- Minasi, M. G., et al.
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