방법 논문

임의 Microseed 매트릭스 심사에 의해 단백질 결정화의 성공률을 향상

DOI:

10.3791/50548

⸱

2013년 8월 31일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biochemistry, University of Bristol, 2Douglas Instruments

이 논문에서

요약

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여기에서 우리는 무작위 microseed 매트릭스 심사하는 일반적인 방법에 대해 설명합니다. 이 기술은 크게, 단백질 결정화 스크리닝 실험의 성공률을 높일 최적화에 대한 필요성을 감소시키고, 데이터 수집 및 리간드 침지 실험에 대한 결정의 안정적인 공급을 제공하기 위해 도시된다.

초록

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랜덤 microseed 매트릭스 스크리닝 (rMMS)는 종 결정은 임의의 화면에 추가되는 단백질 결정화 기술이다. 결정이 단백질의 상태도의 준 안정 영역에서 성장할 가능성을 증가시켜, 여분 결정화 리드 종종 생성 된 결정의 질이 향상 될 수 있고, 수득되며, 데이터 수집 및 침지 실험 결정체가 잘 공급이 제공된다. 여기에서 우리는 손으로 또는 96 - 웰 또는 24 웰 트레이 형식으로, 액체 처리 로봇을 사용하거나 설정 드롭 앉거나 매달려 드롭 증기 확산 실험 중 하나에 적용 할 수있다 rMMS에 대한 일반적인 방법을 설명합니다.

서론

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페루 츠, Kendrew 및 구조 게놈 컨소시엄의 현대 높은 처리량 자동화 된 파이프 라인에, 헤모글로빈과 미오글로빈의 구조를 결정하는 동료에 의해 초기 응용 프로그램에서 고분자 X-선 결정학은 우리에게 단백질의 세계에 전례가없는 구조 살짝 여유있다 . 이 기술은 원자에서 단백질 구조의 직접적인 시각화를 허용하는 가장 널리 적용 실험 방법 유지하거나 (즉, 1-3 Å 범위) 해상도 원자 근처. 단백질에인가하는 X-선 회절을위한 전제 조건은 우선 결정화되어야한다는이며 회절 방법 1, 2에 의한 구조 분석에서 단일 최대 속도 - 제한 단계 유지 프로세스의이 단계이다. 트립 단백질 결정화 과정의 이해 및 결정화 화면의 품질 및 유용성에 큰 개선에 상당한 발전에도 불구하고,트레이 및 관련 기술, 그것을 확실하게 결정화 성공 3의 가능성을 예측하는 것은 여전히 불가능하다. 생화학 및 생물 물리학 적 방법이 관심을 표시하는 단백질은 결정 핵 생성과 성장에 유리한 특성, 즉, 잘 접힌, 균질, 단 분산 등의 여부를 평가하기 위해 적용 할 수 있습니다, 그러나, 어떠한 방식으로 이러한 분석은 결정의 최종적인 예측을 제공 성향.

시드는 오랫동안 존재 결정 또는 결정 성 물질 ....

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프로토콜

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1. 전략적 고려 사항

  1. microseeding 실험에 사용되는 종자 결정의 선택은 실험의 목적에 따라 달라질 수 있습니다. 프로젝트의 시작 부분에 크리스탈 최적화를 위해 다른 시작 지점을 제공 할 수있는 몇 가지 결정 히트를 찾기 위해 도움이됩니다. 상질 결정 교란 다음 또는 시스템이 평형 상태로 복귀 핵화 곳 영역 즉 상태도의 준 안정 영역에서 성장할 가능성이 있으므로 rMMS 크게 결정 최적화의 필요성을 감소시킨다. 따라서 우리는 첫 번째 결정이 (즉시 최초의 결정이 성장 정지로, 더 정확하게, 또는) 얻을 수있다로 정기적으로 즉시 rMMS을 사용하는 것이 좋습니다.
  2. rMMS의 초기 라운드, 시드 콘텐츠는 극력 결정질 재료로 만들어 져야한다. 하나의 잘 사용할 수있는 경우 그 결정을 포함, 또는 결정이 작은 경우, 다수의 반복을 설정하는 것이 도움이 될 수 있습니다결정의 공급을 증가하는 (시드 제외) 원본 히트. 그러나, 여러 가지 히트를 얻을 수 있으며, 경우, 종자 결정은 몇 가지 조건에서 수확과 함께 혼합 할 수 있습니다.
  3. 상 분리를 방지하기 위해, 높은 염 조​​건에서 성장 된 결정을 높은 PEG 조건에서 성장 된 결정 별도로 수확한다. 여러 우물에서 결정이 혼합되어있는 경우, 소금 결정을 줄 가능성이 적습니....

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결과

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rMMS 실험 (A) 예

rMMS 검사의 효과를 입증하기 위해 우리는 암탉의 달걀 흰자위 라이소자임 (HEWL)과 소 간 카탈라제 (BLC)의 결정화에이 방법을 적용했다. 이 효소는 저명 결정화하고 구조적으로 잘 대상 (15, 16)를 특징으로 두. 등 모두 rMMS로 달성 향상된 결정화 성공률을 설명하기 위해 우수한 시험 과목을 제공하기 때문에. 결정화 실험은 96 - 웰 액체 처리 로봇을 사용하여 드롭 트레이 형식 앉아 년에 설립되었다. HEWL 및 BLC의 솔루션은 각각 100 ㎖ ㎎ / 20 ㎎ / ㎖의 최종 농도 20 mM 트리스 - 염산, 150 mM의 염화나트륨, pH를 7.5, 각각의 동결 건조 분말을 용해하여 제조 하였다. 각 단백질 세 96 조건 결정화 화면이 사용되었다; JCSG, PACT와 모피어스. microseeding없이 결정화 심사는 저수지 50 μL의 볼륨 및 2 μl를 사용하여 실시 하였다단백질 용액 1 μL 및 저장 솔루션 1 .......

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토론

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본 논문에서 우리는 rMMS 단백질 결정화 검사에 대한 일반적인 방법을 설명했다. 우리는이 방법을 사용하여 두 개의 테스트 단백질 결정화 성공률에 상당한 향상을 사용하여 증명하고있다. rMMS 비 rMMS 방법을 사용하여 생성 된 결정의 서브 세트의 방사광을 사용하여 회절 분석은 이전의 저자는 좋은 품질 결정 rMMS 실험 11에서 성장할 가능성이있는 것으로보고되었지만, 방법을 사용하여 성장 결정 사이 회절 품질의 변동이 적고 밝혀 13. 그들은 결정화 비정상적으로 쉽기 때문에 HEWL 및 BLC는 전형적인 결과를 주어진 수 있습니다. 또한 rMMS 실험에 사용되는 크리스탈 시드 주식의 농도를 최적화의 중요성을 설명하고,이 회절 품질 결정의 최적의 수는 제조되는 것을 보장하기 위해 희석에 의해 조절 될 수있는 방법을 보여준다.

rMMS 높게, 심플, 높은 스루풋이며전통적인 스크리닝 방법을 보완하는 데 사용할 수있는 확.......

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공개 사항

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우리는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 BBSRC (BB/1006478/1)에 의해 부분적으로 투자되었다. PRR은 왕립 학회 대학 연​​구 활동의받는 사람입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
MRC 96 웰 결정화 트레이Molecular Dimensions LtdMD11-00-100Non-UV compatible, 로봇
ClearView 밀봉 시트Molecular Dimensions LtdMD6-01S
암탉 달걀 흰자 lyzozymeSigma-AldrichL6876~95% 순도
소 간 카틸라제Sigma-AldrichC9322 95% 순도
XylanaseHampton ResearchHR7-104
Thaumatococcus danielliiSigma-AldrichT7630
Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokkoSigma-AldrichP1512
JCSG plus HT-96 screenMolecular Dimensions LtdMD1-40
PACT premier HT-96에 의해 설정된 스크린 스크린Molecular Dimensions LtdMD1-36
Morpheus HT-96Molecular Dimensions LtdMD1-47에 의해 설정된 스크린
; nix 액체 처리 시스템Art Robbins Instruments602-0001-10
Seed bead kitHampton ResearchHR2-320
쌍안 스테레오 현미경LeicaM165C
메스 블레이드Sigma-AldrichS2646-100EA
ErgoOne 0.1-2.5 μ l 피펫StarlabS7100-0125
ErgoOne 2-20 μ l 피펫StarlabS7100-0221
ErgoOne 100-1000 μ l 피펫StarlabS7100-1000
JCSG-plus screenMolecular Dimensions LtdMD1-37손으로 설정 한 화면
PACT 프리미어 화면Molecular Dimensions LtdMD1-29손으로 설정 한 화면
Morpheus 화면Molecular Dimensions LtdMD1-46손으로 설정 한 화면
셋Sigma-AldrichT5415-1EA
CrystalClene coverslips 18 mmMolecular Dimensions LtdMD4-17
2 ml 유리 파스퇴르 피펫Sigma-AldrichZ722669
Vortex mixerFisher Scientific02-215-360
24 well XRL crystallization trayMolecular Dimensions LimitedMD3-11손으로
만든 스크린용30%(w/v) PEG 8000, 0.2M 황산암모늄, 0.1M 카코딜산나트륨 pH 6.5
20%(w/v) PEG 8000, 0.2M 마그네슘 아세테이트, 0.1M 카코딜레이트 나트륨 pH 6.5
20%(w/v) PEG 6000, 100mM 구연산 pH 5.0
에 의해 설정된 스크린용 로봇 로봇 에 의해 설정된 스크린 로봇 Crystal Ph– 핀

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bergfors, T. Protein Crystallization. IUL Biotechnology Series. , 2nd, (2009).
  2. Rupp, B. Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , Garland Science. (2010).
  3. Babnigg, G., Joachimiak, A.

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재인쇄 및 허가

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