방법 논문

유발, 자발적, 미니어처 시냅틱 활동을하는 동안 FM 염료를 사용하여 시냅틱 소포 재활용의 시험

20.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50557

⸱

2014년 3월 31일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Biology & Biochemistry, University of Bath

이 논문에서

요약

우리는 기능적 신경 말단에서 화상 시냅스 소포 재활용 스티 릴 FM 염료의 사용을 설명한다. 이 프로토콜은 없습니다 만 유발하는 것이 아니라 또한 자연과 소형 시냅스 활동에 적용 할 수 있습니다. 프로토콜은 효과적으로 평가할 수 시냅스 이벤트의 다양한 확장한다.

초록

기능 신경 말단에서 시냅스 소포는 세포 외 유출 및 엔도 시토 시스를 받고있다. 이 시냅스 소포 재활용 효과적으로 막 매출을 공개 스티 FM 염료를 사용하여 분석 할 수 있습니다. FM 염료의 사용을위한 종래의 프로토콜이 자극 (유발) 시냅스 활성 다음 뉴런을 분석을 위해 설계되었다. 최근 프로토콜은 자연 또는 소형 시냅스 이벤트와 같은 약한 시냅스 활동을 함께 FM 신호 분석을위한 유효하게되었다. FM 신호의 이러한 작은 변화의 분석 영상 시스템은 강도의 작은 변화를 감지하기에 충분히 민감하다, 그러나 큰 진폭의 인공적인 변화가 억제되어 있어야합니다. 여기서 우리는, 유발 자발 및 미니어처 시냅스 활동, 예를 들어 배양 된 해마 뉴런을 사용하여 적용 할 수있는 프로토콜을 설명한다. 이것은 중요하다으로서이 프로토콜은 또한, FM 염료의 광표백의 속도를 평가하는 수단을 포함강도의 작은 변화 이미징 유물의 소스.

서론

시냅스 소포의 기능은 시냅스 전달의 중요한 결정 요인이다. 그들은 시냅스 세포막 (세포 외 유출)와 융합 할 때이 소포는 신경 전달 물질을 방출, 그들은 세포막 (엔도 사이토 시스)에서 재생과 신경 전달 물질로 다시로드 된 후 릴리스의 또 다른 사이클에 대한 준비가되어 있습니다. 의 역학과 시냅스 소포 재활용을 기본 메커니즘에 대한 연구는 크게 스티 FM 염료 (1)의 도입에 의해 가속화되었다. 긍정적으로 (그림 1A, 그림 1B의 FM1-43 stereoview에서 여러 염료) 친수성 머리 그룹과 소수성 꼬리가 청구 한이 양친 매성 분자는 가역적으로 입력을 침투하지 않고 지질 세포막을 종료 할 수 있습니다. FM 염료의 그룹들이 방출하는 빛의 범위에 영향을 미치는 유사한 기능을 공유 할 수 있습니다. 예를 들어, FM2-10, FM1-43, 및 FM1-84는 두 개의 고리 형 화합물과 슈 사이에 하나의 이중 결합이w 녹색 방출. 그들 사이의 차이는 소수성을 결정하고, 따라서 멤브레인으로부터 출구의 비율 (departitioning) 소수성 꼬리의 길이이다. FM5-95 및 FM4-64의 경우, 세 개의 이중 결합 사이 클릭 화합물을 연결, 그들은 적색 발광을 보여줍니다. 이 염료는 친수성 ​​부분에 대한 차이가 있습니다. 그들은 인해 친수성 ​​환경 소수성 환경 상대 양자 수율 증가, 생체막에 삽입 될 때 모든 FM 염료에서, 형광 강도가 증가한다. 따라서 FM 강도의 변화는 막 회전율의 변화를 나타냅니다. 다른 색 (발광 스펙트럼)과 hydrophobicities는 FM이 시냅스 소포 재활용의 다양한 연구 도구 염료합니다.

이러한 기능을 바탕으로, FM 염료는 대부분 시냅스 소포 재활용 분석을 다음과 같은 방식 (그림 2)에 따라 사용됩니다. 신경그들은 엔도 시토 시스 (염색)을 통해 형태로의는 시냅스 소포 (의 SV)에 채택되기에 가능, FM 염료를 포함하는 세포 외 용액에 목욕을합니다. 염료는 염료가없는 세포 외 용액을인가함으로써 세척하고, 이것은 즉 만 활발히 진행 엔도 시토 시스는 염료 (도 2 하단)으로로드 된 시냅스 소포의 클러스터를 포함 할 기능적 신경 말단을 보여준다. 이후의 세포 외 유출은 세포 외 공간으로 FM 염료의 손실과 형광의 수반하는 손실로 연결 (destaining; 인해 친수성 ​​환경에 departitioning 멀리 세포 외 유출의 사이트에서 확산 둘 다). 따라서 FM의 형광 강도의 변화는 시냅스 소포 엑소와 엔도 사이토 시스의 지표입니다.

FM 염료는 다양한 생물과 준비 2,3에있는 시냅스 소포를 얼룩 destain하는 데 사용되었습니다. 예를 들면 포유류 neur 포함ONAL 문화 4-9, 포유류의 뇌 조각 10, 11, 신경 근육 접합부 (12, 13), 망막 바이폴라 뉴런 14, 15, 및 16 달팽이관의 유모 세포.

일반적으로 실험, 염색 및 destaining 모두 광범위 뉴런 (유발 활동을) 자극에 의​​해 트리거됩니다. 외부 자극 (자연과 소형 시냅스 활동) 9,17-19의 부재에서 재활용을 가지고 최근에, 그러나, 약한 자극에 대한 응답으로 시냅스 소포 재활용도 분석하고있다. 자연과 소형 시냅스 활동은 활동 전위의 자연 발화 (그림 3)을 포함하는 이전에, 외부 자극의 부재에서 발생하는 것과 같이 정의된다. 이러한 약한 시냅스 활동은 다양한 자극에 의​​해 트리거보다 FM 신호의 작은 변화와 관련되어있다. 측정을 요구하는 FM의 fluoresc의 변화줬어 강도는 정확하게 시냅스 소포 세포 외 유출 또는 엔도 시토 시스하지만 강도 인공적하지 않은 변경 사항을 반영합니다. 이슈의 원인 중 하나는 FM 염료에 의한 세포막의 비특이적 염색의 존재이다. 이 구성 요소의 점진적 유실이 잘못 시냅스 활동에 기인한다 측정 된 형광 강도의 점진적인 변화로 이어질 것입니다. 이 계수는 (프로토콜 참조) 적절한 방법에 의해 감소​​ 될 수있다. 이슈의 가장 주목할만한 원인은 시냅스 소포 내에 유지 FM 염료의 광표백입니다. FM 강도 광표백 관련된 변화를 측정하는 생물 (시냅스)의 변화에​​ 비해 작아야한다. 민감한 카메라의 최근의 개발은, 예를 들면 전자 승산 전하 결합 소자 (EMCCD) 카메라가 가능한 노광 시간을 단축하고 형광체를 여기 시키는데 사용되는 빛의 강도를 약화 photobleaching에 의해 최소화 할 수있다. 이슈의 또 다른 원인은 드리프트의 iN 광학 현미경의 초점 수준. 촬상 세션 동안 포커스 드리프트는 기계적 또는 열 효과에 의해 야기 될 수 있고, 잘못 측정 된 형광 강도의 변화로 이어질 것이다.

여기에서 우리는 가능한 특히, 소형 시냅스 활성, 약한 또는 전혀 자극의 컨텍스트에서 시냅스 소포 재활용을 분석하는 FM 염료를 사용할 수 있도록 프로토콜 및 장비를 설명한다. 우리는 배양 된 쥐의 해마 신경 세포를 사용하고 destaining 단계 이미징, 유발과 자발적인 시냅스 이벤트 기간 동안 소포의 염색과 destaining의 예를 보여줍니다. 또한 인하여 시냅스 활동에 대한 FM 염료 손실의 부재에서, FM 염료 광표백의 정도를 평가하는 방법을 설명한다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. 포유류의 뇌에서 뉴런의 차 문화

본 연구에서 수행 된 모든 동물의 절차는 아이오와 대학의 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인됩니다.

  1. 출생 후 0-1 일 (19, 20)에 CA3-CA1 쥐에서 해마의 영역 또는 쥐의 해리 세포 배양을 준비합니다. 24 잘 접시에 쥐 아교 공급 층으로 미리 설정 12 mm의 coverslips는 (두께 번호 0)에 12,000 세포 / 웰의 밀도로 해마 세포를 접시.
  2. 문화 기능 신경 터미널까지 8 일 동안 해마의 신경 세포는 21을 개발. 각각의 신경 말단이 훨씬 클러스터링하지 않고 상대적으로 고립 된 경우 우리는 시험 관내 11 내지 14에 날에 신경을 사용합니다. 신경 세포는 체외 예 Willig 등. 22 Nosyreva 및 Kavalali (23)에 대한 21~28일까지 실험에 사용 할 수 있습니다.
  3. 에기능 연구, 투과광 현미경 (10-20X의 배율 예를 들어 위상 콘트라스트 광학)를 사용하여 건강한 뉴런의 지표에 대해 (염색 전) 커버 슬립을 평가. 건강의 지표는 다음과 같습니다 균일 아교 세포 층, 신경 주위에 명확한 세포 마진, 파란색 구조없이 확장 수상 돌기, 클러스터 인 somata의 부족, 그리고 번들 신경 돌기의 부족.

2. FM 염료와 시냅틱 소포 (염색을)로드

  1. 때문에 전기장 자극에 의​​해 유발 된 시냅스 활동에 염색 (활동 전위를 포함한다)
    1. HEPES 기반의 염료 무료 솔루션에 FM 염료를 추가하여 용액 1을 염색 준비, 예를 들어 타이로드의 솔루션 (자세한 내용은 솔루션을 참조하십시오). FM 염료의 농도는 10 μM FM1-43, 2.5 μM FM4-64입니다. 일반적인 농도 범위는 다음과 같습니다 : 2-15 μm의 FM1-43, 또는 2.5-20 μM FM4-64 3,6. 재발의 억제를 요구하는 실험글루타메이트 시냅스 활동과 시냅스 가소성의 유도는, 더 이온 성 글루타메이트 수용체의 길항제를 추가 AMPA 수용체 (예를 들어, 10 μM CNQX)와 NMDA 수용체 (예를 들어, 50 μM AP5).
    2. 배지에서 일반 타이로드의 솔루션으로 채워져 이미징 챔버에 세포와 커버 슬립을 전송합니다. 우리는 측벽 (백금 와이어가 6.3 mm, RC-21BRFS으로 구분)에 부착 된 자극 전극 촬상 챔버를 사용한다. 이 챔버는 ~ 200 μL의 목욕 볼륨, 폐쇄 이미징 챔버로 설계하지만, 우리는 (상단 커버 슬립이없는 예) 오픈 챔버로 사용된다. 전송하는 동안 공기에 배양 된 세포를 노출하고, 핀셋 (중심 부근의 coverslip의 경계에서 최대가 아닌 선택)로 배양 된 세포를 곤란하게 피하지 않는다.
    3. 실내 온도 (23-25​​ ℃)에서 일반 타이로드의 솔루션으로 이미징 챔버를 Perfuse.
    4. 공동으로 솔루션 1 염색 적용nstant 관류.
    5. 전기 펄스를 적용하여 시냅스 활동을 보여주고 있습니다. 해마 신경 세포의 시냅스 소포의 총 재활용 풀의 최대 염색의 경우, 60 ~ 120 초 (24) 10 Hz에서 문화를 자극한다. 필드 자극의 최대 효율을 달성하려고 할 때 마음에 몇 가지 기능을 유지합니다. 뉴런을 유지하고 완전히) 살아있는 뉴런을 계속하고 균일 한 전기장을 얻기 위해 타이로드의 용액 (의 얇은 층에 침지 전극을 자극하고있는 동안 1) 욕 용액 높이는 가능한 한 낮아야한다. 2) 현재 강도와 지속 시간은, 예를 들어, 형광 칼슘 2 + 영상 신경 흥분의 지표를 사용하여 최적화되어야한다 우리의 경우, 30mA 강도와 1 밀리 초 기간의 일정한 전류가 신뢰할 수있는 결과를 제공합니다. 3) 목욕 솔루션을 자극하는 동안 일정한 흐름에 적용되어야하며, 전기 자극은 양성자의 원인이 전기 리드 (H +) 적극적으로 청구 양극과 정적 목욕 빠르게 감소 양극 근처의 pH에서 축적한다. 산도 표시기 (페놀 레드 등 행크스 '균형 소금 솔루션)이 포함 된 솔루션을 통해 백 개 이상의 몇 가지 펄스를 전달하여 별도의 실험에서 산성화를 확인합니다.
    6. 포스트 자극 엔도 시토 시스 (25)를 완료 할 수 있도록 필드 자극이 종결 된 후 추가로 60 초 동안 염색 액 (1)에 신경을 둡니다.
    7. (세척 용액 1, 염료 무료 타이로드의 솔루션 플러스 AMPA 수용체와 NMDA 수용체 (섹션 2.1.1 참조)의 길항제 및 전압 의존 나 + 채널 차단제로 관류하여 이미징 챔버 밖으로 염색 액을 씻어 예를 들어, 0.5 μM의 테트로도톡신, TTX). 차단제의 조합은 자발적의 시냅스 활성을 통해 FM 염료의 손실을 억제 할 것이다. 세척 효율을 최대화하기 위해 관류 비율 (<증가EM> 예를 들어, 최대 1-2 분, 그리고 피펫을 사용하여 수동으로 열려있는 영상 실에 직접 솔루션을 세척 1의 알약 (예를 들어, 1 ㎖)를 추가 할 경우) 5 ~ 6 ㎖ / 분이다. 배양 된 뉴런을 방해하지 않도록, 수동 주입의 강도와 방향을 제어합니다.
  2. 때문에 높은 K + 솔루션에 의해 유발 된 시냅스 활동에 염색 (활동 전위를 포함하지 않습니다.)
    1. 하이-K + 타이로드의 솔루션에 FM 염료를 추가하여 솔루션이 염색 준비합니다. 특히, NaCl을위한의 KCl의 몰 치환, 45 mM의 KCl을 함께 수정 된 타이로드의 솔루션을 준비합니다. 필요한 경우, AMPA와 NMDA 수용체의 길항제를 추가합니다. 이러한 높은-K + 용액을 연속적 뉴런을 탈분극 신경 말단으로 칼슘 2 + 유입을 가능하게하고, 최대 26 정도에 시냅스 소포 세포 외 유출을 개시 할 것이다. 높은 농도 (70 ~ 90 밀리미터)도 예 Klingauf 등. 27 다른 보고서에 사용 된D 리차드 등. 28
    2. 배지에서 일반 타이로드의 솔루션으로 채워져 이미징 챔버로 배양 된 뉴런의 coverslip을 전송합니다.
    3. 일정한 관류에 염색 용액 (2)을 도포 또는 피펫 (26, 28)를 사용하여 1 ~ 2 분 동안 실온에서 뉴런 얼룩. 후자의 경우, 최종 염료 농도는 염료 용액의 자유 알려진 부피의 염색 용액 (2)의 공지 된 양을 추가로 제어한다.
    4. 섹션 2.1.7에 설명 된대로 이미징 챔버 밖으로 염색 솔루션을 씻으십시오.
  3. 자연과 소형 시냅스 활동으로 인해 염색.
    1. 60 분 동안 문화 인큐베이터에 배치하여 37 ° C에 Prewarm 중탄산 기반 솔루션 (예 : 최소 필수 중간, MEM).
    2. 자연 시냅스 활동을 기반으로 염색의 경우, MEM에 FM 염료를 첨가하여 염색 액 3를 준비합니다. 염색을위한 M에 근거시냅스 활동 iniature, 염색 액 3 TTX를 추가하여 염색 액 4를 준비합니다.
    3. 해결 방법 3 또는 4를 염색하는 배지에서 배양 된 뉴런 coverslip에 전송하고, 10 분 동안 37 ° C에서 같은 염색 용액을 떠나으로 얼룩 신경.
    4. 솔루션 세척 1에 간략하게 커버 슬립을 씻어.
    5. 영상 실에서 솔루션 세척 1에 커버 슬립을 전송합니다. 마음에 다음과 같은 사항을주의해야합니다. 1) 세포를 공기에 노출되지 않도록, 필요에 따라, 세척없이 촬상 챔버에 직접 커버 슬립을 전송. 2) 뉴런 HEPES 계 용액으로 염색 용액 3 또는 4로 대체하여 실온에서 염색 할 수있다. 3) 뉴런 염색 용액이 함께 염색 용액 3 또는 4를 대체하고, 실온에서의 나머지 단계를 수행하여,이 방법을 사용하여 하이-K + 용액의 맥락에서 유발 된 시냅스 행위 얼룩이 질 수있다.
    6. 영상 밖으로 염색 액을 씻어섹션 2.1.7에 설명 된 챔버로.

3. FM 염료를 세척

  1. 상술 한 방법 (섹션 2.1.7) 중 어느 신경 염색 및 초기 세정 후, 실온에서 50-10 분 동안 용액으로 세척 1 촬상 챔버 perfuse 계속. 이것은 세포막 및 세포 외 용액으로부터 FM 염료를 제거한다. 우리 촬상 챔버의 경우, 목욕 관류 속도는 600-1,200 μL / 분이다. 세탁 인해 시냅스 활동 (17)에 FM 염료 손실을 억제하기 위해 세포 외 칼슘 2 +의 부재 하에서 수행 될 수있다. 세척은 Advasep-7 세포막 29-31에서 FM 염료 소제로서의 개질 사이클로 덱스트린의 간단한 애플리케이션에 의해 강화 될 수있다. 그것은 모두 FM의 puncta에 (31)의 강도를 줄이고 혜를 손상시키지 않도록 (단일 층 문화의 경우에 예를 들면 5 초) 모든 Advasep-7 노출 짧은을 유지하기 위해 매우 중요합니다셀 LTH. 원형질막에 FM1-43에서 형광도 시냅스 소포 (32)을 입력하지 않는 소광 sulforhodamine 101 (50-100 μM)의 응용 프로그램에 의해 억제 될 수있다.

4. 세탁시 최적의 이미지 필드를 검색

  1. 이미지에 표시 할 필드의 세포는 높은 배율과 높은 수치 조리개 대물 렌즈 (예를 들면 40 배)로 전송 광학 현미경을 사용하여, 건강한 있는지 확인합니다. 이 섹션에서, 우리는 위상차 또는 미분 간섭 대비 광학 장착 거꾸로 현미경 (이클립스 티, 니콘)을 계속 사용합니다. 이 현미경은 현미경의 초점 드리프트를 극복 연속, 실시간 초점 보정을 가능 완벽한 초점 시스템 (PFS)을 갖추고있다. 이 기능은 동일한 초점 평면과 destaining 동안 시간 경과 영상을 위해 필수적이다.
  2. 그 염색 형광 광학계를 사용하여, 효과가 확인한다. AVFM의 puncta에의 OID 집계 개별 BOUTONS 분별하기 어려울 것이기 때문에 그들은 연구의 대상이 아니라면. FM의 puncta에의 모양에주의 : 스테인드 BOUTONS의 대부분은 원형 구슬의 문자열로 표시하는 경우, 그들은 건강에 해로운 신경 터미널을 나타낼 수 있습니다. 광표백을 피하기 위하여 강한 형광 여기에 뉴런의 노출을 최소화한다.

5. 시냅틱 소포에서 FM 염료를 언로드 (Destaining)

  1. 전기장 자극에 의​​해 유발 된 시냅스의 활동으로 인해 Destaining.
    1. 세척 TTX (솔루션 세척 1 등 만 TTX없이 동일) 세정 용액 2 광범위하게 신경을 관류에 의해. 필드의 자극에 의해 유도 된 세포 내 칼슘 2 + 과도 + 영상, 또는 볼트의 패치 클램프 녹음에 의해 형광 칼슘에 의해 예를 들어 같은 세정 매개 변수 (관류 속도와 지속 시간)을 사용하여, 별도의 실험에서 TTX 유실의 유효성을 확인나이에 따라 나 + 전류.
    2. FM 염료 이미징 시작합니다. FM1-43 또는 FM4-64 이미징의 경우, 520 나노 미터 또는 650 nm의 긴 패스를 방출 필터, 각각 및 490 nm의 여기 필터를 사용합니다. 짧은 노출 시간 (예 : 10 ~ 20 밀리 초), 약한 자극 강도 (예 : LED 전력의 5 ~ 10 %), 높은 감도 (예 : EM 게인)을 사용하여, 이미지마다 1 ~ 2 초를 취득. 노출 시간 및 형광 흥분의 강도를 감소시킴으로써 FM 염료의 광표백 최소화. 완벽한 초점 시스템을 설정하여 현미경 초점 드리프트를 최소화합니다.
    3. (120 초 동안 10 Hz에서 예) 현장 자극을 사용하여, 20 솔루션 2 세척에 신경을 자극한다.
    4. FM 염료의 모든 재활용 시냅스 소포를 고갈, 1 ~ 2 분의 중간 휴식 시간에, 자극의 여러 라운드를 적용합니다. 일에 FM 염료로 염색 된 시냅스 소포의 총 재활용 풀의 크기를 평가할 때 중요하다전자 이전 상태 20,33.
  2. 인해 시냅스 활동 Destaining은 활동 전위의 부재에서 유발.
    1. FM 염료 이미징 시작합니다.
    2. 솔루션 1 또는 2를 세척에 용해 자극 시약을 적용합니다. 이러한 시약은 다음을 포함한다 : CA 2 + 세포 외 용액으로부터 셀에 유입, 사용 예에서 허용함으로써 세포 내 칼슘 이온 농도를 높여 (칼슘 2 + 이온 운반체 이오 노마 이신의 KCl (하이-K + 솔루션, 예를 들어 45 MM) 26, 5 μM) 20,34, 자당 (쉽게 탈착 가능한 수영장, 500 ㎜로 사용 예) (35, 36)에서 시냅스 소포의 방출을 자극 고장 성 솔루션을 제공합니다. 워너 악기 37, 또는 Y-튜브 시스템 38-40의에서 SF-77B 시스템 예를 들면, 시약을 적용 신뢰할 수있는 시간적 제어를위한 고속, 지역 관류 시스템을 사용합니다.
  3. 로 인해 Destaining 자연과 분시냅스 활동을 iature.
    1. 때문에 자발적인 시냅스 활동에 destaining를 들어, 솔루션 2를 세척하여, (5.1.1) 이상으로 TTX을 세척 할 것. 용액이 세정과 뉴런을 관류하면서 FM 염료 이미징 시작. 솔루션 1 (TTX로)을 세정에 신경을 perfuse 계속하다가 미니 시냅스 활동 destaining를 들어, FM 염료 이미징 시작합니다.
    2. 자발적 또는 축소하거나 활동을 기반으로 destaining 후 유발 시냅스 활동을 통해 destaining하여 기능 신경 터미널을 식별합니다. 활성은 전술 한 절차에 의해 유발 될 수있다. 더러워 구조 기능적 신경 말단 (예 서서히 엔도 솜 또는 성상 세포 소낭 리사이클)과이 과정에서 유발 된 활성 에이즈 destaining 다량 이외 해당 될 수 있기 때문 식별 프로세스가 필요하다.

6. FM 염료의 광표백 평가 평가

  1. 알데히드 - 고칠 FM 염료 (예를 들어, FM1 - 43FX, FM4-64FX)와 신경 말단을 얼룩. 이것은 상술 유발, 자발적 또는 미니어처 염색법을 사용하여 수행하고, 정착 FM 염료와 FM 염료를 대체하여있다.
  2. 섹션 2.1.7에 설명 된대로 고칠 FM 염료를 세척 할 것.
  3. 화학적으로 정착 솔루션에 커버 슬립을 전송하여 신경 세포를 고정 : 4 ℃에서 30 분 동안 타이로드의 용액에 4 % 파라 포름 알데히드 4 %의 자당 고칠 FM 염료의 형광 강도는 화학 고정 후 유지됩니다.
  4. 두 번 신선한 타이로드의 솔루션으로 커버 슬립을 전송하여, 타이로드의 용액에 10 분 동안 정착을 세척 할 것.
  5. 영상 실에서 신선한 타이로드의 솔루션으로 커버 슬립을 전송합니다.
  6. 라이브 뉴런으로 이미징 파라미터들의 동일한 세트를 사용하여 정착 FM 염료 이미징 시작. 그것은, 어떤 화학적으로 고정 된 표본을 사용 후 잘 이미징 챔버를 씻어하는 것이 중요하기 때문에나머지 정착액은 동일한 챔버에서 수행 후속 라이브 세포 이미징 실험에 영향을 미칠 수있다. 또는 고정 된 세포 이미징, 스테인드 살아있는 세포는 광표백 속도를 평가하기위한 몇 군데 있습니다. 그러나, 그것이 심하게 미니어처 시냅스 활성을 차단하는 것은 어렵다는 것을 명심 가치가, 예를 들어, 소형 활동의 빈도는 세포 외 칼슘 2 + (23)을 제거하여 50 % ~로 감소 될 수 있지만 완전하지 봉쇄.
  7. 각 촬상 세션의 끝에, FM의 형광 강도의 절대 값을 평가하기위한 배경 화상을 취득. FM의 puncta에의 강도는 신경 말단에서 FM 염료에서 진정한 신호뿐만 아니라, 신경 세포의 단일 층 문화, 2) 커버 슬립 및 광학 요소 (예를 들어 대물 렌즈, 필터 등을 기초 1) glial 세포에서 배경 잡음뿐만 아니라 나타냅니다 거울), 3) 검출기 (EMCCD 카메라). 배경 잡음은 ASSE입니다영상화 된 필드의 nonstained 지역에서 ssed. 이러한 영역들은 강도 공간 또는 이종에 한정되는 경우가 이상적인 방법은 아니지만, 카메라 셔터가 닫힌 이미지로 대체하고 검출기로부터 소음을 취득. 동일한 촬상 파라미터를 이용하여 약 10 개 이미지를 획득.

7. 이미지 분석

  1. 시계열 이미지의 스택과 이미지 분석 소프트웨어로 수집 된 데이터를 가져옵니다. 우리는 ImageJ에 (WS Rasband, NIH) 및 관련 플러그인을 사용하여, 예를 들어, 이미지 안정제 플러그인 (강 리) FM의 puncta에 사이에 운동의 작은 정도를 보정하고, 시계열 분석 V2.0 (발라지 Jayaprakash) 분석을위한 시계열.
  2. 시리즈 (ΔFM)의 시작과 끝에서 FM 강도의 변화를 계산한다. 이를 위해 destaining의 개시전 및 destaining (예 5 이미지 프레임 당)의 종료 후 이미지를 평균 및 subtractin하여 차분 화상을 생성G 그들.
  3. 차분 영상에 강도 임계치를 적용함으로써 잠재적으로 기능적 신경 말단을 식별하고, 그 농도 임계 값보다 높은 화소를 검출한다. 임계 값을 설정하는 방법 중 하나는 상기 베어 커버 슬립 영역으로부터 얻어진 배경 강도의 표준 편차를 선택하는 것이다.
  4. 감지하고 그 크기 기준 (연속성에있는 픽셀의 최소 및 최대 수를) 충족 된 인접 픽셀로 고립 된, 기능 신경 터미널을 확인합니다. 이 프로세스는 배경 잡음 및 분석에서 집계 신경 말단을 제거한다.
  5. (각각의 클러스터는 각각의 신경 말단에 대응) 검출 된 픽셀 클러스터에서 지역 수준의 관심 (로아)을 지정합니다. (ΔFM를) destaining 동안 강도의 변화량 분석의 전형적인 매개 변수입니다. 이것은 유발 자발적 또는 소형 시냅스 활동의 누적 양을 나타냅니다. 는 다음과 같은 문제를 나타내는 경우의 ROI를 제외실험의 목적에 따라 강도의 변화 : 촬영하는 동안 증가, 자극 전에 갑자기 감소, 또는 자극 후 긴 대기 시간.
  6. 이미지 분석 소프트웨어로 취득한 시계열 데이터를 가져와 광표백의 비율을 평가. (닫힌 셔터 예) 배경 이미지를 평균 및 개별 이미지에서 뺍니다. 상상 속으로 신경 말단에 해당 FM의 puncta에로의 ROI를 지정하고 시간이 지남에 따라 투자 수익 (ROI) 강도의 변화를 측정한다.

솔루션

  1. 타이로드의 솔루션
    • (mm 단위) 구성 : 125 염화나트륨, 2의 KCl, 2 염화칼슘, 2 MgCl2를 30 포도당, 25 HEPES, 310 mOsm, 산도 7.4.
  2. 염색 액 (1)
    • 타이로드의 솔루션 플러스 FM 염료.
    • 이 용액을 전기 자극에 의​​해 유발 된 시냅스 활동을 기반으로, 염색에 사용된다.
    • AMPA 수용체와 NMDA 길항제의 추가 receptoRS 필요한 경우.
  3. 염색 솔루션 2
    • 하이-K + 타이로드의 솔루션 플러스 FM 염료.
    • 이 수정 타이로드의 솔루션은 염화나트륨을위한의 KCl의 몰 치환, 45 mm로의 KCl의 농도를 증가시켜 제조한다.
    • 이 용액을 연속 탈분극에 의해 유발 된 시냅스 활동을 기반으로, 염색에 사용된다.
    • 필요하면 AMPA 수용체와 NMDA 수용체의 길항제를 추가합니다.
  4. 염색 액 3
    • MEM 솔루션 플러스 FM 염료.
    • 이 용액을 자발 시냅스 활동을 기반으로, 염색에 사용된다.
  5. 염색 액 4
    • MEM 용액 플러스 FM 염료 및 TTX.
    • 이 용액 미니어처 시냅스 활성에 기초 염색에 사용된다.
  6. 솔루션 세척 1
    • 타이로드의 용액 플러스 AMPA 수용체와 NMDA 수용체의 길항제 및 TTX.
  7. 솔루션 2 헹굼
    • 타이로드의 용액 플러스 AMPA 수용체와 NMDA 수용체의 길항제 만 TTX없이.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

예를 들어, 우리는 시냅스 소포의 destaining 시간 코스 (그림 4)에 대한 대표적인 결과를 보여줍니다. 배양 된 해마의 신경 세포가 자발적 시냅스 활동 (단계 2.3)를 사용하여 FM4-64로 염색 및 염료 무료 솔루션 (솔루션 2 린스)로 세척 하였다. 영상은 자발적인 활동 (단계 5.3) (연속 라인의 초기 부분, 그림 4A)를 사용하여 초기 destaining 시간의 과정을 보여줍니다. 이것은 120 초 동안 10 Hz에서 자극 필드 각각 (단계 5.1)로 유발 된 활성의 3 라운드를 사용 destaining 시간 코스 따른다. 유발 destaining의 양을 측정하는 방법 중 하나는 소포의 전체 리사이클 풀의 크기에 대응 양두 화살표 (ΔFM 유발)으로 설명된다.

첫 번째 자극이 주어지기 전에, (그림 (b)에 확대) FM 강도의 점진적 감소가 발생했...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

우리는 자연과 소형 시냅스 활동을 유발하고, destaining 단계에서 이미징에 대한 응답으로 시냅스 소포를 염색하고 destaining을위한 프로토콜을 설명했다. 기존 프로토콜 이외에, 우리는 미니어처 시냅스 활성에 근거 FM의 destaining 관찰의 새로운 프로토콜을 포함했다. 이러한 프로토콜을 사용하여, 우리는 이전에 운동 장애 근긴장의 마우스 모델에서 배양 된 신경 세포의 이상을 확인했다. 높은 활성 (20)에 의해 자극 될 때, 야생형 마우스에서 그들의 대응에 비해, 이들 뉴런은 칼슘 2 + 의존적으로 시냅스 소포 세포 외 유출을 가속화 받았다. 신경 전달 물질 방출 (19)의 패치 클램프 전기 생리학 기록에 의해 확인 된 이들 뉴런은 또한, 더 자주 소형 시냅스 활성을 나타내었다.

이러한 분석에서 FM 염료를 사용하기위한 프로토콜의 중요한 측면은 ASS...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

감사의 글

저자는이 작업을 실행하는 동안 도움이 토론의 Harata 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 미국 심장 협회 (American Heart Association), 근긴장 의학 연구 재단, 에드워드 말린 크로, 주니어 재단, 국립 과학 재단 (National Science Foundation), 그리고 NCH에 화이트 홀 재단의 교부금에 의해 투자되었다

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
펄스 발생기AMPIMaster-8
절연 자극기figure-materials-1 DigitimerDS3
도립 현미경NikonEclipse TS100저배율에서 세포 형태를 평가하는 데 사용한다.
도립 현미경NikonEclipse TiE초점 드리프트를 최소화하여 고해상도 형광 및 투과광 이미징에 사용한다.
대물렌즈Nikon수침 렌즈를 권장한다. 이미징 구조가 커버슬립 표면으로부터 깊은 곳에 있지 않은 한(예: >10 μm) 유침 렌즈를 사용할 수 있다.
필터 큐브Nikon77032509FM1-43용 490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em
필터 큐브Nikon77032809FM4-64용 490/420 nm ex, 510 nm dclp, 650 nm LP em. 
EMCCD 카메라Andor TechnologyiXon EM+ DU-860이 EMCCD 카메라는 형광의 고감도 검출에 사용한다.
액체 재순환 냉각기Solid State Cooling SystemsOasis 160카메라에 냉각수를 지속적으로 순환시켜 -80°C의 온도를 유지함으로써 노이즈를 감소시키는 데 사용한다.
LEDCoolLED-Custom Interconnect490 nm이 광원은 형광 여기의 신속한 온/오프 제어에 사용한다.
이미지 획득 소프트웨어Andor TechnologySolis
이미징 챔버Warner InstrumentsRC-21BRFS
고속 관류 시스템Warner InstrumentsSF-77B
CNQXTocris Bioscience1045
D,L-AP5Tocris Bioscience0106
테트로도톡신Tocris Bioscience1069주의: 독성 시약. 취급 시 주의하십시오.
FM1-43InvitrogenT35356
알데히드 고정 가능 FM1-43 (FM1-43FX)InvitrogenF35355
FM4-64InvitrogenT13320
알데히드 고정 가능 FM4-64 (FM4-64FX)InvitrogenF34653
이오노마이신Sigma-AldrichI0634
Hanks’ 균형 염 용액Sigma-AldrichH2387
최소 필수 배지Invitrogen51200-038이 용액은 형광 이미징을 방해하는 페놀 레드(phenol red)를 포함하지 않는다.
파라포름알데히드Electron Microscopy Sciences15710주의: 독성 시약. 취급 시 주의하십시오.
수크로스Sigma-AldrichS7903

참고문헌

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
  2. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat. Protoc. 1, 2916-2921 (2006).
  3. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. , Cold Spring Harb Protoc. 77-83 (2012).
  4. Newton, J., Murthy, V. Measuring exocytosis in neurons using FM labeling. J. Vis. Exp. , (2006).
  5. Evans, G. J., Cousin, M. A. Simultaneous monitoring of three key neuronal functions in primary neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 160, 197-205 (2007).
  6. Cousin, M. A. Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function. Curr. Protoc. Neurosci. 2, (2008).
  7. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. J. Neurosci. Methods. 185, 76-81 (2009).
  8. Cheung, G., Cousin, M. A. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM dyes. J. Vis. Exp. , (2011).
  9. Welzel, O., Tischbirek, C. H., Kornhuber, J., Groemer, T. W. Pool-independent labelling of synaptic vesicle exocytosis with single vesicle resolution in rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 205, 258-264 (2012).
  10. Winterer, J., Stanton, P. K., Muller, W. Direct monitoring of vesicular release and uptake in brain slices by multiphoton excitation of the styryl FM 1-43. Biotechniques. 40, 343-351 (2006).
  11. Kay, A. R. Imaging FM dyes in brain slices. Cold Spring Harb. Protoc. , (2007).
  12. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol. Biol. 440, 349-369 (2008).
  13. Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol. Biol. 689, 137-148 (2011).
  14. Guatimosim, C., von Gersdorff, H. Optical monitoring of synaptic vesicle trafficking in ribbon synapses. Neurochem. Int. 41, 307-312 (2002).
  15. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J. Vis. Exp. , 1305(2009).
  16. Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
  17. Sara, Y., Virmani, T., Deak, F., Liu, X. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
  18. Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nat. Neurosci. 13, 1454-1456 (2010).
  19. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  20. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
  23. Nosyreva, E., Kavalali, E. T. Activity-dependent augmentation of spontaneous neurotransmission during endoplasmic reticulum stress. J. Neurosci. 30, 7358-7368 (2010).
  24. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14, 983-989 (1995).
  25. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5567-5571 (1996).
  26. Harata, N., et al. Limited numbers of recycling vesicles in small CNS nerve terminals: implications for neural signaling and vesicular cycling. Trends Neurosci. 24, 637-643 (2001).
  27. Klingauf, J., Kavalali, E. T., Tsien, R. W. Kinetics and regulation of fast endocytosis at hippocampal synapses. Nature. 394, 581-585 (1998).
  28. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J. Cell Biol. 168, 929-939 (2005).
  29. Kay, A. R., et al. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 809-817 (1999).
  30. Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. An ultrastructural readout of fluorescence recovery after photobleaching using correlative light and electron. 1, 988-994 (2006).
  31. Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Benz, A. M., Mennerick, S. Presynaptically silent synapses studied with light microscopy. J. Vis. Exp. , (2010).
  32. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of synaptic activity in hippocampal slices with FM1-43 enabled by fluorescence quenching. Neuron. 24, 803-808 (1999).
  33. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  34. Piedras-Renteria, E. S., et al. Presynaptic homeostasis at CNS nerve terminals compensates for lack of a key Ca2+ entry pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 3609-3614 (2004).
  35. Rosenmund, C., Stevens, C. F. Definition of the readily releasable pool of vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 16, 1197-1207 (1996).
  36. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Piedras-Renteria, E. S., Tsien, R. W. Rapid reuse of readily releasable pool vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 28, 221-231 (2000).
  37. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS ONE. 8, (2012).
  38. Harata, N., Katayama, J., Takeshita, Y., Murai, Y., Akaike, N. Two components of metabotropic glutamate responses in acutely dissociated CA3 pyramidal neurons of the rat. Brain Res. 711, 223-233 (1996).
  39. Kira, T., Harata, N., Sakata, T., Akaike, N. Kinetics of sevoflurane action on GABA- and glycine-induced currents in acutely dissociated rat hippocampal neurons. Neuroscience. 85, 383-394 (1998).
  40. Harata, N., Katayama, J., Akaike, N. Excitatory amino acid responses in relay neurons of the rat lateral geniculate nucleus. Neuroscience. 89, 109-125 (1999).
  41. Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, e2146(2008).
  42. Neves, G., Lagnado, L. The kinetics of exocytosis and endocytosis in the synaptic terminal of goldfish retinal bipolar cells. J. Physiol. 515, 181-202 (1999).
  43. Mazzone, S. B., et al. Fluorescent styryl dyes FM1-43 and FM2-10 are muscarinic receptor antagonists: intravital visualization of receptor occupancy. J. Physiol. 575, 23-35 (2006).
  44. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. J. Neurosci. 21, 7013-7025 (2001).
  45. Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21960-21965 (2009).
  46. Crumling, M. A., et al. P2X antagonists inhibit styryl dye entry into hair cells. Neuroscience. 161, 1144-1153 (2009).
  47. Zhu, Y., Stevens, C. F. Probing synaptic vesicle fusion by altering mechanical properties of the neuronal surface membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 18018-18022 (2008).
  48. Thiagarajan, T. C., Lindskog, M., Tsien, R. W. Adaptation to synaptic inactivity in hippocampal neurons. Neuron. 47, 725-737 (2005).
  49. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  50. Li, H., et al. Concurrent imaging of synaptic vesicle recycling and calcium dynamics. Front. Mol. Neurosci. 4, 34(2011).
  51. Raingo, J., et al. VAMP4 directs synaptic vesicles to a pool that selectively maintains asynchronous neurotransmission. Nat. Neurosci. 15, 738-745 (2012).
  52. Martens, H., et al. Unique luminal localization of VGAT-C terminus allows for selective labeling of active cortical GABAergic synapses. J. Neurosci. 28, 13125-13131 (2008).
  53. Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nat. Neurosci. 13, 1451-1453 (2010).
  54. Hua, Y., et al. A readily retrievable pool of synaptic vesicles. Nat. Neurosci. 14, 833-839 (2011).
  55. Groemer, T. W., Klingauf, J. Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same vesicle. 10, 145-147 (2007).
  56. Moulder, K. L., et al. A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing. J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).
  57. Crawford, D. C., Jiang, X., Taylor, A., Moulder, K. L., Mennerick, S. Differential requirement for protein synthesis in presynaptic unmuting and muting in hippocampal glutamate terminals. PLoS ONE. 7, (2012).
  58. Henkel, A. W., Lubke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1918-1923 (1996).
  59. Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM 1- 43 photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 12748-12753 (2001).
  60. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes. J. Vis. Exp. , (2010).
  61. Schikorski, T. Monitoring rapid endocytosis in the electron microscope via photoconversion of vesicles fluorescently labeled with FM1-43. Methods Mol. Biol. 657, 329-346 (2010).
  62. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. FM dye photoconversion for visualizing synaptic vesicles by electron microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2012, 84-86 (2012).
  63. Schote, U., Seelig, J. Interaction of the neuronal marker dye FM1-43 with lipid membranes. Thermodynamics and lipid ordering. Biochim. Biophys. Acta. 1415, 135-146 (1998).
  64. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J. Neurochem. 97, 1546-1570 (2006).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

FMStyryl FM

관련 논문