방법 논문

비정상적인 유사 분열과 관련된 세포의 죽음은 라이브 암 세포의 공 촛점 이미징에 의해 관찰

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DOI:

10.3791/50568

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2013년 8월 21일

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1Cancer Research Center, Sheba Medical Center, 2The Neufeld Cardiac Research Institute, Tel-Aviv University, 3Department of Physiology and Pharmacology, Tel-Aviv University, 4Imaging Unit, Sackler Faculty of Medicine, Tel-Aviv University, 5Biotechnology and Cell Signaling, Ecole Superieure de Biotechnologie Strasbourg, 6Department of Human Molecular Genetics and Biochemistry, Tel-Aviv University

이 논문에서

요약

유사 분열을 겪고있는 암 세포에있는 phenanthridine PJ-34의 세포 독성 활동은 라이브 공 촛점 이미징 실시간으로 기록되었다. PJ-34 근절 인간의 유방암 MDA-MB-231 세포의 유사 분열에 여분의 중심체를 숨겨 세포. 정상 이중 초점 유사 분열과는 달리, 여분 중심체는 PJ-34의 존재에있는 두 개의 스핀들 극에 클러스터되지 않았습니다.

초록

강력한 PARP1 억제제 역할을 페난 트렌 유도체 유사 분열의 멀티 centrosomal 인간의 암 세포에있는 여분 중심체의 이중 초점 클러스터링을 막았다. phenanthridine PJ-34은 가장 강력한 분자이다. 여분 중심체의 Declustering 멀티 centrosomal 세포에서 유사 분열 장애 및 세포 죽음을 발생합니다. 대부분의 고체 인간의 암은 여분 중심체의 높은 발생했습니다. PJ-34의 활동은 살아있는 인간의 유방암 중심체에 매우 풍부 형광 γ-tubulin의를 위해 인코딩 벡터에과 형광 히스톤 H2B 선물로 형질 전환 된 MDA-MB-231 세포의 공 촛점 이미징에 의해 실시간으로 기록되었다 염색체. 비정상적인 염색체 배열 및 declustered 중심체를 나타내는 데 클러스터 γ-tubulin의 병소는 PJ-34 치료 후 형질 전환 MDA-MB-231 세포에서 발견되었다. 두 개의 스핀들 극 유엔 클러스터 여분 중심체는 세포의 죽음을 앞에. 이러한 결과는 FO를 연결R 처음 여분 중심체 유사 분열에 드 클러스터링 및 세포 사망에 이르는 세포 분열 장애를 가진 인간의 암 세포에있는 PJ-34의 최근 발견 독점 세포 독성 활동. 두 개의 중심체와 이중 초점 스핀들과 분열을 겪고 정상 세포를 저해하지 않고 고정 된 세포 다 중심체와 PJ-34 전용 근절 암 세포의 공 촛점 이미징에 의해 관찰 이전의 연구 결과에 따르면. PJ-34이 세포 독성 활성이 다른 강력한 PARP1 억제제에 의해 공유되지 않은, 그리고 PARP1 억제의 독립성을 제안, PARP1 부족 MEF 숨겨 extracentrosomes에서 관찰되었다. 공 촛점 이미징을 살고 유사 분열 동안 세포를 근절 새로운 분자를 식별하기위한 유용한 도구를 제공했다.

서론

페난 트렌는, PJ-34 등 PARP1 억제제, 파생 스트레스 조건 (뇌졸중이나 심근 경색 1)에 따라 에너지 소비 PARP1 매개 DNA 수선에 의해 유도 된 세포 사멸 세포 사멸에서 정지 세포를 보호하도록 설계되었습니다. 그러나 최근 우리는 PJ-34, 그 유도 PARP1 억제보다 두 배 높은 농도에서 독점적으로 인간의 암 세포 2,3에서 세포 죽음을 일으킬 수 있다는 것을 발견. 세포의 더 급속한 확산이었다, 세포의보다 효과적인 근절했다. PJ-34의 세포 독성 활동은 여분 중심체 유사 분열 2 드 클러스터링에 기인 하였다. 사람의 암세포 항구는 4,5 multicentrosomes. 효율적으로 유사 분열에서 두 개의 중심체를 숨겨 정지 세포 또는 일부 양성 증식 세포를 저해하지 않고 72-96 시간 이내에 세포를 박멸 20 μM PJ-34와 여분 중심체를 항구 인간의 유방암 세포 MDA-MB-231의 배양 2,3. 양성 세포는 인간의 흉선에서 준비 MCF-10 인간 유방 상피 세포, 인간 내피 세포 (HUVEC) 및 기본 간엽 세포가 포함되어 있습니다. 이러한 세포는 PJ-34의 세포 독성에 저항했다. PJ-34 96 시간 배양 동안 자신의 세포주기 방해하거나 자신의 중심체와 이중 초점 스핀들 형성 2,3에 영향을 미치지 않았다.

양극성 중심체 어셈블리는 유사 분열 4,5 양극성 스핀들 형성에 매우 중요합니다. 따라서 두 개 이상의 중심체를 가진 세포는 두 개의 기둥 4-9에서 자신의 별도의 중심체를 클러스터링, 거의 이해하지 분자 메커니즘을 개발했습니다. 자신의 중심체의 양극 어셈블리의 실패 체포 G2 / M 정지의 세포주기 및 세포 죽음에 이르게 4,5 유사 분열 장애에 기인하는 다극 왜곡 스핀들 및 탈선 염색체 분리가 발생할 수 있습니다. 여분 중심체 드 클러스터링을 기본 분자 메커니즘을 집중적으로 조사하는 <> 10을 먹다. 건강한 조직 5,10을 살려주는 동안이 죽음의 메커니즘을 이해하는 것은 암 세포의 독점적 인 박멸을 가능하게 할 것이다.

따라서, 유사 분열 재앙 세포 죽음을 활성화 화합물은 공 촛점 이미징 여분 중심체 클러스터링에 영향을 미치는 분자를 식별하는 데 사용할 수있는 것이 좋습니다 인간의 고체 cancers.Our 결과의 넓은 범위에서 효율적일 수 있습니다 선택적 암 치료의 새로운 모드를 제공 유사 분열 2,3, 약물 후보를 대상으로 이들 화합물의 암을 렌더링합니다.

우리는 고정 살아있는 인간의 암 세포 (유사 분열의 여분 중심체의 높은 발생에) 대 정상 세포를 스캔하여 phenanthridine PJ-34의 세포 독성 활성을 기록했다. 단계별로 인간의 암 세포 PJ-34의 세포 독성 활동을 식별하는 데 사용되는 이미징 절차의 단계 설명은 아래에 포함되어 있습니다.

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프로토콜

1. 세포 배양 준비

MDA-MB-231 세포는 ATCC (미국 유형 문화 수집)에서 구입하여 액체 질소에 보관 하였다.

  1. Dulbeco 수정 이글 중간 (DMEM), 10 % 말 혈청, 1 % L-글루타민, 1 % Penstrep-Amphotericine B를 포함하는 10 ML 완전 배지 92 mm 직경 페트리 접시에 씨앗 10 6 MDA-MB-231 세포는 세포를 허용 80 ~ 100 % 정도의 합류로 증식한다.
  2. 요리에서 배지를 제거하고 폐기합니다.
  3. 0.25 % 혈청의 모든 흔적을 제거하는 (W / V) 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 짧게 세포 층을 씻으십시오.
  4. 세포 층 (보통 5 - 15 분 이내) 분산 될 때까지 거꾸로 현미경으로 세포를 접시 관찰 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션의 2.0 ML를 추가합니다.
  5. 18 ML 전체 성장 매체를 추가하고 부드럽게 피펫으로 세포를 대기음. 튜브에 전송할 수 있습니다.
  6. 1,200 rpm으로 세포 현탁액을 원심 분리기.
  7. CU의 24 ML에 세포 펠렛을 다시 일시 중지매체를 lture.
  8. 35mm 유리 바닥 요리 (25 % 합류에 대한) 및 인큐베이터의 장소 (5 % CO 2, 37 ° C)에 세포 현탁액 2 ㎖를 추가합니다.
  9. 솔루션 :
    1. 세포 증식을위한 완벽한 매체 : 10 % FBS와 DMEM, 1 % 항생제 (100 단위 / ML 페니실린 G, 100 ㎍ / ㎖ 스트렙토 마이신, 펜 연쇄상-Ampho 솔루션), 2 mM의 L-글루타민.
    2. 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함하는 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션.
  10. 요리 :
    92mm 직경 페트리 접시.
    35mm 직경 폴리 - D - 라이신 코팅 유리 바닥 문화 요리.

2. 라이브 공 촛점 이미징 세포의 준비

  1. 시드 2 × 10 제 1 항에서 언급 한 2 ㎖ 완전 배지에서 유리 바닥 문화 요리 5 MDA-MB-231 세포. 세포 배양은 60 % ~ 70 %의 합류 (접시 당 3-4 × 10 5 세포에 대한)에 도달하면, 형질 진행합니다.
  2. 두 개의 플라스미드는 엔코딩으로 세포를 형질제조 프로토콜에 따라 리포솜의 transfection 시약 제트-PI를 사용하여 융합 단백질 γ-tubulin의-GFP (중심체의 형광 검출)와 히스톤-RED (H2B-RED, 염색체의 형광 검출을) ING. 간단히, 100 ㎕의 염화나트륨 (150 ㎜)과 관의 각 플라스미드의 2 μg을 혼합한다. 두 번째 튜브에 100 ㎕의 염화나트륨 (150 밀리미터)로 형질 시약 (100 μL)를 혼합하고 실온 (RT)에서 5 분 알을 품다. 다음 두 가지 솔루션, 혼합 (약한 소용돌이를 사용하여) 결합 스핀 다운. RT에서 30 분 알을 품다.
  3. 형질 혼합물의 배양 기간 동안 PBS로 두 번 세포를 씻으없이 보충 따뜻한 DMEM 2 ㎖ (37 ° C)로 세포 매체를 교체하십시오.
  4. 부드럽게 DMEM에 세포의 transfection 혼합물을 추가하고 8 시간 동안 (37 ° C, 5 % CO 2) 배양기에 세포를 반환합니다.
  5. 24 시간 동안 배양 8 시간 후 2 ㎖ 완전 배지와 DMEM를 교체하고 인큐베이터에서 세포를 배양시간.
  6. 24 시간 형질 전환 한 후 2 ㎖ 완전 배지는 20 μM PJ-34를 포함하여 세포의 매체를 교체하십시오.
  7. 추가 18 시간 (37 ° C, 5 % CO 2)에 대한 세포를 품어.
  8. 5 % CO 2, 37 ℃에서 세포를 유지 이미징 챔버에 적어도 16 시간 동안 공 촛점 이미징을 살 수있는 대상 세포
  9. 병렬로, 다음과 같이 형광 현미경을 사용하여 형질 효능 36 시간 게시물 형질을 검사 :
    1. 시드 2 × 10 1 coverslip에 잘 당 2 ㎖ 완전한 매체를 포함하는 6 - 잘 접시에 5 MDA-MB-231 세포.
    2. 섹션 2.2-2.5에서 언급 한 세포를 형질.
    3. 36 시간 포스트 transfection에 차가운 메탄올에 부화하여 coverslip을에 장착 된 형질 전환 세포 수정 : 아세톤 (1:1) 용액, 7 분, -20 ° C.
    4. 고정 솔루션을 기음과 화학 후드에서 건조 장착 세포와 coverslip을 보자.
    5. DAPI와 골드 antifade 시약을 연장하고 일을하게 적용전자 coverslip에 6 시간 동안 어둠 속에서 건조.
    6. 형광 현미경 슬라이드를 검사하고 세포의 전체 인구 (DAPI에 의한 DNA의 얼룩)에서 형질 세포 (적색 및 녹색 신호)의 비율을 계산합니다. 100-200 세포가 계산 될 때 원하는 형질의 비율이 20-40 %이다.

3. 라이브 공 촛점 이미징 스캐너 설정의 기술적 인 매개 변수

  1. ScanMode XYZT; 구멍 [통풍] 1.00, 줌 3.5, 해상도 8 비트, 레이저 DPSS 561 nm의, 아르곤, 가시 레이저 488 nm의, 레이저 그 / 네 눈에 보이는 633 nm의, 목표 HCX PL APO CS 63X 1.40 OIL UV, 수치 조리개 1.4; 굴절률 1.52, 속도 700 Hz에서 검색합니다.
  2. 이미지를 3 차원 프레 젠 테이션 IMARIS 이미징 소프트웨어 7.0으로 제조 하였다.

4. 고정 된 세포의 유사 분열의 공 촛점 이미징

  1. 시드 2 × 10 5 MDA-MB-231 유방암 세포 (ATCC), 정상 마우스 배아 섬유 아세포 (MEF) 또는 PARP1 부족 ME2 ㎖ 완전 배지에서 6 - 잘 접시에 유리 coverslips는에 F (박사 프랑소와 Dantzer에 의해 제조 PARP - - /). 의 coverslips는 2 시간 건조하고, 6 - 잘 접시의 각 우물에 배치 멸균 DD 물로 세척하여 다음, 96 % 에탄올로 세척 하였다.
  2. 매체에 PJ-34 (10-30 μM)를 추가하고 필요한 기간 (일반적으로 최대 96 시간)에 대한 세포를 품어.
  3. PBS로 한 번 coverslips를 세척 (인산염 완충 식염수), 그리고 얼음처럼 차가운 메탄올에서 배양하여 세포를 고정 : 아세톤 (1:1) 용액, 7 분, -20 ° C.
  4. 고정 솔루션을 기음과 coverslips를 화학 후드에서 건조하자 (이 단계에서, coverslips를 여러 주 동안 -20 ° C에 보관 될 수 있습니다).
  5. 세포막을 permeabilize 및 RT에서 1 시간 PBST 10 % NDS (정상 당나귀 혈청) ( '차단 솔루션')로 세포를 차단하는 PBST (PBS 0.1 % 트윈 - 20과 보충) 한 번 coverslips를 씻으십시오.
  6. 기본 antibodi와 투과 고정 된 세포를 배양RT에서 2 시간 동안 ES (스핀들 및 중심체 염색 용). 반대로 α 튜 블린 (1:250 희석) 및 안티-γ 튜 블린 (1:200 희석) : 항체는 것과 같이 따른다 차단 용액에 희석됩니다. 일차 항체는 다음과 같이 적용됩니다 : 6 잘 플레이트 커버 (덮개가 거꾸로) 각 coverslip에 대한 솔루션을 차단하는 항체의 혼합물 100 μL를 (드롭) 적용됩니다. 부드럽게 항체 드롭 coverslip을 넣어 시드 셀의 드롭에 직면. 실온에서 2 시간 동안 항체를 직면 coverslips를 품어.
  7. 우물에 다시 coverslips를 배치하고 PBST로 세포를 3 회 세척한다. 다음 형광 차 항체의 coverslips에서 세포를 라벨링 4.6에서 설명한 동일한 절차를 사용합니다. 어둠 속에서, 1 시간, RT에 대한 보조 항체의 coverslips에서 세포를 품어. 항체는 다음과 같은 차단 솔루션에 희석되어 있고, 알렉사 플 루어 568 (1:1,000 희석 알렉사 플 루어 488 (녹색 1:1,000 희석)빨간색).
  8. 를 사용하여 coverslips를이 DAPI (염색체의 염색을 위해)와 금 antifade 시약을 연장하고 건조 어둠 속에서 RT에서 밤새 배양 마운트합니다.
  9. 공 초점 현미경으로 커버 전표를 확인합니다.

5. 세포 생존율은 ATP 생산에 의해 측정

ATP 생산은 발광 ATP 탐지 분석 장비로 측정됩니다.

  1. 96 - 웰 플레이트 각 well에 800 ㎕의 중간에있는 약 20,000 세포의 씨앗 세포를. 세 빈 우물 매체의 배경 발광 측정을 위해 사용되어야한다.
  2. 약 10 μM에서 100 μM의 ATP 표준 희석 시리즈를 준비하고 얼음에 보관하십시오.
  3. 각 웰에 세제의 50 μl를 추가하고 궤도 셰이커, 700 rpm으로 5 분 동안 접시를 흔들.
  4. 키트 '기질 버퍼'의 5 mL로 '동결 건조 된 기질'의 재구성 각각의 병.
  5. 우물에 재구성 기질 용액 50 μl를 추가하고 흔들어궤도 셰이커, 700 RPM에서 5 분 판.
  6. 10 분 동안 어둠 속에서 판을 보관하십시오.
  7. ELISA 마이크로 플레이트 리더 서로 잘 luminiscence을 측정합니다.

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결과

PJ-34 phenanthridine 1 용해 안정적인 물 (그림 1)입니다. 우리의 이전 결과 세포의 죽음을 발표하고 PJ-34로 치료했다 고정 멀티 centrosomal 암 세포의 여러 유형의 엑스트라 중심체를 드 클러스터. 대조적으로, 일반적인 증식 세포는 2,3 손상되지 않았다. 중심체는 고정 여분 centrosomal 세포 2 centrine1 및 γ-tubulin에 대한 항체를 가진 두 배 레테르를 붙이기에 의해 확인되었다.

여기 PJ-34의 세포 독성 활동은 라이브 공 촛점 현미경을 사용하여 실시간으로이 라이브 여분 centrosomal 세포에서 기록되었다. 인간의 유방암 여분 중심체 4,5의 높은 발생 (> 50 %)이 MDA-MB-231 세포를 라이브 γ-tubulin의-GFP (와 형질 세포에 초점을 맞춘 공 촛점 이미징에 의해 적어도 16 시간...

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토론

공 촛점 이미징 유사 분열 동안 라이브 멀티 centrosomal 세포 (그림 3 및 보충 정보)의 PJ-34의 세포 독성 효과를 실시간으로 문서를 제공 살고 있습니다. 이 PJ-34 5-9으로 유사 분열 재해 세포 사멸의 유도를 제안, 여분의 중심체 드 클러스터링 및 세포 죽음에 인간의 암 세포에있는 PJ-34의 세포 독성을 돌리는 최초의 살아있는 문서이다. 대조적으로, 최고 numerary 중심체의 이중 초점 클러스터링 양방향 focali 클러스터 추가 중심체 (그림 2, 보충 정보)와 일반 유사 분열을 겪고 라이브 치료 MDA-MB-231 세포에서 관찰되었다.

이러한 결과에 따르면, 형질 세포의 공 촛점 이미징 유사 분열 5,9,15,16 동안 형질 전환 세포의 여분 중심체 클러스터링에 연루 단백질의 전위를 감지하는 데 유용 할 수 있습니다 살고 있습니다. 멀티 centr...

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공개 사항

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

이 연구의 자금 출처 : 텔 아비브 대학의 기술 이전 회사 라모트와 시바 - 메디컬 센터 (M. CA 및 SI.) ICRF의 공동 기금 - 이스라엘 암 연구 재단 (M. CA.)와 이스라엘 과학 재단 ( SI).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
REAGENTS
DMEMInvitrogen (GIBCO)41965 
FBS (소 태아 혈청)인비트로젠 (GIBCO)12657 
Pen-Strep-Ampho 솔루션Biological Industries, 이스라엘03-033-1B 
L-글루타민인비트로겐 (GIBCO)25030-024 
0.25% 트립신-EDTA인비트로젠(GIBCO)25200 
92mm 페트리 접시Nunc, Thermo scientific150350 
35mm 폴리-D-라이신 코팅된 유리 바닥 문화 접시MatTek Corporation, USAP35GC-0-14-C 
발광 ATP 검출 분석 키트Abcamab113849 
NDS (노멀 당나귀 혈청)잭슨 면역연구소017-000-121 
안티 &-튜불린 항체SigmaT90261:250 dilution (IF)
Anti γ-tubulin 항체SigmaT51921:200 dilution (IF)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgGInvitrogenA-110171:1,000 dilution (IF)
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgGInvitrogenA-100421:1,000 dilution (IF)
ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting)InvitrogenP36935 
JetPEI (리포솜 형질주입 시약)Polyplus101-10 
EQUIPMENT
Confocal microscopeLeica (독일 만하임)TCS SP5II 

참고문헌

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PJ 34H2bPARP1MDA MB 231

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