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방법 논문

말초 신경 손상 후 기능 회복을 평가하기 위해 후각 Ensheathing 세포의 이식

11.6K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50590

⸱

2014년 2월 23일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UPRES EA3830, Institute for Research and Innovation in Biomedicine, University of Rouen, 2Neuroscience, Karolinska Institutet, 3Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery Department, Rouen University Hospital, 4Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery Department, Amiens University Hospital

이 논문에서

요약

후각 ensheathing 세포 (OECs)는 기본 후각 신경 세포의 성장을 허용 신경 능선 세포입니다. 이 특정 속성은 세포 이식에 사용할 수 있습니다. 우리는 여기에서 후두 신경 손상 모델에서 OECs의 사용을 기반 셀룰러 이식 모델을 제시한다.

초록

후각 ensheathing 세포 (OECs)는 기본 후각 신경 세포의 성장과 재성장을 허용 신경 능선 세포입니다. 사실, 기본 후각 시스템은 심지어 성인 동물에서 새로운 신경 세포에 상승을 제공 할 수있는 기능이 특징입니다. 이 특별한 기능은 신경의 유리한 미세 환경을 만들 OECs의 존재에 부분적으로 기인한다. OECs이 속성은 척수 손상 모델에서와 같이 세포의 이식에 사용되었습니다. 말초 신경계는 중추 신경계 이상의 신경 손상 후 재생하는 더 큰 용량을 가지고 있지만, 완전한 섹션은 후두 신경 절개의 얼굴 후 특히 축삭 재성장 동안 misrouting을 유도한다. 특히, 재발 후두 신경 (RLN)의 전체 단면은 성대의 synkinesis의 결과로 탈선 축삭 재성장을 유도한다. 이 특정 모델에서, 우리는 OECs 이식을 효율적으로 축삭의 재성장을 증가 시킨다는 것을 보여 주었다. ve_content "> OECs가 후각 점막 (OM-OECs) 및 후각 전구 (OB-OECs) 모두에 존재하는 여러 소집단으로 구성되어있다. 우리는 여기에서 OECs의 서로 다른 모집단의 사용을 기반으로 세포 이식의 모델을 제시 RLN 부상 모델.이 패러다임을 사용하여이, OB-OECs과 OM-OECs의 차 문화가 RLN의 부와 문합 후 리겔에 이식했다. 두 달 수술 후, 우리는 videolaryngoscopy에 따라 상호 보완적인 분석에 의해 이식 된 동물을 평가, 근전도 (EMG) , 조직 학적 연구. 첫째, videolaryngoscopy 특히 근육 cocontractions 현상이. 그런 다음, EMG 입증 풍요 로움과 근육 활동의 동기를 분석한다. 마지막으로, 톨루이딘 블루 염색에 따라 조직 학적 연구는 번호와 프로파일의 정량화를 허용, 우리는 후두의 기능을 평가할 수 유수의 섬유.

모두 함께, 우리는, 문화, IDE에게 분리하는 방법을 여기에 설명OM와 OB에서 ntify 이식 OECs RLN 섹션 - 문합 방법 축삭 재성장 및 후두 기능에 대한 이러한 이식 세포의 효율성을 평가하고 분석하는 후.

서론

후각 점막 (OM) 중추 신경계 및 말초 신경계 후각 망울 (OB)에서, 일차 후각 시스템은 별개의 두 부분으로 구성된다. 주요 후각 시스템은 포유류 종의 삶을 통해 자기 갱신에 대한 기본 후각 뉴런 (PON)의 용량을 특징으로한다. 이러한 능력으로 인해 OM의 신경 줄기 세포의 존재를 가능하게한다. OM에서 OB에 PON의 성장과 재성장은 후각 ensheathing 세포라는 전문 glial 세포 (OECs)에 의해 촉진된다. OECs 1 OB하는 OM에서 PON의 신경에 유리한 미세 환경을 만드는 신경 능선 세포입니다. 이것에 의해, OECs 세포 2,3의 다른 모집단을 구성하는 OM와 OB에서 찾을 수 있습니다. OECs의 다른 특성은 여러 가지 신경계 병변 패러다임 4 세포 이식을 위해 그들을 사용하는 리드 과학자가있다. 사실, OECs 생산 성장 요인, 홍보, 아교 퇴치 용을 감소오모테 축삭 재성장, 자유롭게 성상 세포의 5,6로 뒤섞다 수 있습니다. 그러나, 이러한 연구의 대부분은 척수 손상 (SCI) 기준, 그들 중 몇몇은 말초 신경 손상 (PNI) 7,8 후 OECs를 사용했습니다.

말초 신경계는 신경 손상 후 재생하는 좋은 능력을 가지고 있지만, 완전한 절 탈선 축삭의 재성장을 유도한다. 사실, (RLN) 얼굴 또는 재발하는 후두 신경의 완전한 transections 후 잘못 전달 축삭 synkinesis라는 근육 cocontractions의 원인이됩니다. 그 때문에 축삭 재성장을 정량화 할뿐만 아니라 근육 수축의 효율성을 평가하는 PNI의 모델을 제안하는 가장 중요하다. 문헌에 기재된 대부분의 일반적인 모델은 안면 신경 병변 9,10에 기초한다. 이 모델에서 기능적 평가는 턱 (10)의 움직임에 기초하여 복구된다. 그러나 그것은 MOV의 효율성을 설명하기 복잡ements 및 근육 cocontractions 현상을 구별합니다. 우리는 여기에 RLN 병변을 기반으로 모델을 제안한다. 이 모델은 축삭 재성장과 성대의 움직임뿐만 아니라 세포 이식 (11, 12) 이후이 운동의 효율성과 기능뿐만 아니라의 평가를 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 RLN 섹션 / 문합 모델 OM와 OB에서 문화와 이식 OECs에 단계 절차에 의해 단계를 제공하고 수술 후 동물을 평가.

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프로토콜

1. 후각 점막과 후각 전구의 차 문화

  1. 해부하기 전에
    1. 44 ㎖를 첨가하여, 50 ㎖에 대한 매체 확인 칼슘없는 둘 베코 변형 이글 / 태아 혈청 (FBS) 5 ㎖ 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 1 ㎖로 보충 한 햄스 F12 배지 (DMEM/F12).
    2. 코트 75cm 폴리-L-라이신 (50 ㎍ / ㎖, 1.5 ㎍ / cm 2), 실온에서 1 시간 2 플라스크.
    3. PBS 1X로 플라스크를 씻어.
    4. 최대 1 주 동안 냉장고에 코팅 된 플라스크를 저장합니다.
  2. 해부
    1. 안락사의 방법은 기관의 동물 관리 및 사용위원회의 사전 승인과 자격을 갖춘 기술자 만 수행해야합니다.
    2. 이러한 피셔 쥐와 같은 근친 쥐를 선택합니다.
    3. 래트는 나트륨 펜토 바르 비탈이나 케타민 / 자일 라진과 같은 마취 주사 가능한 다른 형태의 깊은 마취를 입력 한 것이 확인 된 후에, 그와 R을 참살피부를 emove.
    4. 전방에서 후방 부분에 두개골을 엽니 다.
    5. 수막을 방지하기 위해 OB 복용 치료를 제거합니다.
    6. 같은 쥐에서 비강 sagittaly를 엽니 다.
    7. OM은 호흡기 점막을 방지하기 위해주의하면서 제거합니다. OM 상피 쉽게 그 노란 색으로 식별 할 수 있습니다.
    8. OM의 해부에 대한 더 자세한 프로토콜은 이전에 발견 할 수 있습니다 J. 비스. 특급 . 출판 13.
  3. 문화
    1. 37 ℃에서 45 분 동안 0.1 % 트립신을 포함하는 행크의 버퍼 소금 솔루션 (HBSS)에서 OB를 배치
    2. 37 ℃에서 45 분 동안 0.05 % 콜라게나 제를 포함 HBSS에 OM 배치
    3. 따뜻한 매체의 2 ㎖를 첨가하여 소화 효소를 중지합니다.
    4. 배지로 세포를 세척하고 3 분 300 XG에이를 원심 분리.
    5. 2 씹다 샘플균질 한 세포 현탁액을 얻을 때까지 P1000 피펫을 사용하여 매체의 ML.
    6. 따뜻한 매체의 25 ㎖로 프리 코트 플라스크 (5 ~ 10 × 10 6 세포 / 플라스크)에있는 세포를 접시.
    7. 5 % CO 2와 37 ° C에서 세포를 품어 문화.
    8. 2 일마다 배지의 절반을 변경합니다.
    9. 체외 6-8 일 후, 작은 세포 샘플에 P75 양성 세포의 비율을 확인, 세포 계측법 또는 면역 세포 화학 흐름에 의해, 설치류에 OECs로 가정. 이러한 분석을 위해, 다른 마커는 GFAP 및 S100β으로 공부하실 수 있습니다.
  4. 유동 세포 계측법 분석
    1. "세포 이식"(아래의 제 2 조 2 항)에 설명 된대로 세포를 수집합니다.
    2. 4 ℃에서 15 분 동안 P75 차 항체 (1:100)로 품어
    3. PBS-EDTA 2 ㎖로 세포를 세척하고 3 분 300 XG에이를 원심 분리.
    4. 15시 PE 복합 항 마우스 이차 항체와 세포를 품어(1:200) 어둠 속에서 4 ° C에서 분.
    5. PBS-EDTA 2 ㎖로 세포를 세척하고 3 분 300 XG에이를 원심 분리.
    6. PBS-EDTA의 500 μL의 세포를 Resuspend.
    7. 유동 세포 계수기와 10 ~ 30 × 10 3 세포를 분석 할 수 있습니다.
  5. 면역 세포 화학 분석
    1. "문화"(섹션 아래 1.1.2)에 설명 된대로 48 시간 동안 프리 코트 6 - 웰 플레이트에 세포를 접시.
    2. PBS로 세포를 씻으십시오.
    3. 실온에서 15 분 동안 PFA 4 %로 세포를 고정합니다.
    4. PBS로 세포를 씻으십시오.
    5. 실온에서 15 분 동안 PBS / 트리톤 (Triton) X100 (0.1 %)로 세포를 품어.
    6. PBS로 세포를 씻으십시오.
    7. 차 항체 (1:200)와 세포를 품어 : 하룻밤 4 ℃에서 P75, S100β 및 GFAP
    8. PBS로 세포를 씻으십시오.
    9. 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 차 항체 (1:500)와 세포를 품어.
    10. PBS로 세포를 씻으십시오.
    11. R에서 훽스트 10 분에 세포를 품어어둠 속에서 T.
    12. PBS로 세포를 씻으십시오.
    13. 형광 현미경을 사용하여 세포를 분석 할 수 있습니다.
  6. GFP 라벨 세포
    1. 닷새 이식하기 전에, 강화 GFP (:​​ 20 감염의 다중성을) 숨겨 렌티 바이러스 벡터로 하룻밤 OB와 OM 문화를 감염.
    2. 작은 샘플 "문화"(1.1 절)에서 전술 한 바와 같이 유동 세포 계측법에 의해 GFP 양성 세포의 비율에 이식 확인하기 전에.

2. 수술과 이식

  1. 재발 성 신경 문합
    1. 동물의 모든 실험은 기관의 동물 관리 및 사용위원회의 사전 승인과 자격을 갖춘 기술자 만 수행해야합니다.
    2. 수술 전에 오토 클레이브에 모든 악기와는 외과 적 치료를 통해 불임을 유지한다.
    3. 케타민을 하이드로 클로라이드의 복강 내 주사 (12.5 ㎎ / ㎏)과 클로르 프로 마진 염산염 (가 쥐를 마취0.625 ㎎ / kg). 수술 전에 발가락 핀치에 의해 마취의 적합성을 평가합니다.
    4. 지느러미 욕창에 쥐를 놓습니다.
    5. 메스 2cm 세로 매체 자궁 경부 피부 절개를 수행합니다.
    6. 중간 흰색 선 다음 infrahyoid 근육의 수직 절개를 수행합니다.
    7. infrahyoid 근육 사이에 자동 고정 견인기를 사용하여 후두를 노출합니다.
    8. RLN 노출.
    9. 미세한 컨트롤에서 일곱 번째 기관 고리의 수준에서 microscissors으로 완전히 신경을 잘라.
    10. 미세한 제어 11.0 봉합의 한 지점을 사용하여 문합을 수행합니다. 이 수술은 후두의 특정 모터 탈 신경에 이르게한다.
  2. 세포 이식
    1. 그냥 이식하기 전에, 37 ℃에서 5 분 동안 0.05 % 트립신 EDTA를 사용하여 요리에서 세포를 제거
    2. 따뜻한 매체의 2 ㎖를 첨가하여 소화 효소를 중지합니다.
    3. 3 분 300 XG에 원심 분리기.
    4. 현미경 하에서 혈구를 사용하여 세포를 세고 특정 프로토콜에 따라 세포의 농도를 조정. 이 모델에서, 원하는 농도는 DMEM/F12 30 μL 6 10 × 1.2-6 사이의 세포했다.
    5. 이식 전에 1.5 ML 튜브에 DMEM/F12-Matrige 리터의 1시 2분 혼합 (이 실험에서 30 ~ 60 μL)와 휴대 준비를하고 얼음에 놓습니다. , 비특이적 효과를 피하기 마트 리겔을 감소 성장 인자를 사용한다.
    6. 그냥 이식하기 전에 마트 리겔 매체 믹스를 따뜻하게하는 몇 초 동안 당신의 손에 튜브를 개최합니다.
    7. 피펫을 사용하여 문 합부에 믹스를 면직하고 부상당한 신경의 혼합물의 자기 조립 될 때까지 기다립니다.
    8. 4.0 봉합사로 근육과 피부를 닫습니다.
    9. 집 쥐 개별적으로 24 시간 동안 가열 램프 아래에 유지.

3. 평가

  1. 후두경
    1. intraperit로 쥐를 마취케타민을 하이드로 클로라이드 (12.5 ㎎ / ㎏)과 클로르 프로 마진 염산염 (0.625 ㎎ / ㎏)의 ONEAL 주입. 확인 쥐 전에 프로토콜을 진행하기에 발가락 핀치 마취 있습니다.
    2. 지느러미 욕창에 쥐를 놓습니다.
    3. 후두의 최고의 전망을 제공하기 위해 조정 된 30 ° videolaryngoscope를 삽입합니다. 각각의 기록에 대한 동일한 뷰를 재현하는 해부학 적 랜드 마크를 확인합니다.
    4. videolaryngoscope (5-10 시퀀스 / 동물)를 사용하여 성대의 움직임을 기록합니다. 각 동물에 대해 연속 최대 내전 및 외전 최대 세 시퀀스를 선택합니다.
    5. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 후두 함수를 분석한다. 최대 납치 성대의 최대 내전의 움직임의 차이를 측정하여 절대 각도의 움직임을 확인합니다. 움직임의 진폭을 측정함으로써 동적 점수를 결정합니다. synkinesis 및 paradoxal 움직임을 측정하여 기능 점수를 결정합니다.
  2. 근전도 (EMG)
    1. 전기 절연을 위해 쥐의 다리 힘줄 근육에 전극을 배치합니다.
    2. "재발 성 신경 문합"(2.1)에서 전술 한 바와 같이 피부와 근육을 열어 후두 및 기관을 노출합니다.
    3. cricothyroid 연골을 노출합니다.
    4. microscissors를 사용하여 후방 cricoarytenoid (PCA) 근육을 노출하는 cricothyroid 연골을 엽니 다.
    5. PCA 근육의 단극 바늘 전극 (38 × 0.45 mm)를 소개합니다.
    6. 자연 환​​기 중에 획득 시스템을 사용하여 PCA 근육의 근육의 전기 활성을 기록한다.
    7. 호흡과 풍요 로움과 동기화 측면에서 근육 활동을 분석합니다. 풍부한 활동과 추적 운을 맞춘 : 증가 흡기와 추적 운을 맞춘,하지만별로 추적 (neurogen), 2 : 영감, 1시 unrhymed 추적, 증가없이 0 : EMGS을 분석하기 위해, 다음과 같은 척도를 사용하여 0-3 질적 점수를 할당 3 : I를 구성, 매우 풍부한 추적 운을 맞춘최대 의도적 인 활동과 유사한 nterference 패턴.
    8. 대기 시간 및 잠재적 인 시간을 측정하는 미주 신경을 노출합니다. RLN 인해 작은 크기에 자극 도중 손상을 입힐 수 있기 때문에 미주 신경은 자극의 사이트로 선택된다.
    9. 전극과 미주 신경을 자극한다.
    10. PCA 근육에 전기 신호를 기록한다. 대기 시간 및 잠재적 인 지속 시간을 측정한다. 가능하면 같은 PowerLab의 시스템으로 근육 활동, 대기 시간 및 잠재적 인 시간을 기록 수집 모듈을 사용합니다.
  3. 조직학
    1. 펜토 바르 비탈 과다 복용을 사용하여 동물을 안락사.
    2. 미세한 제어 RLN의 말초 그루터기를 제거합니다. RLN의 말단 부분은 문 합부와 후두 사이의 부분으로 정의된다. 는 11.0 봉합은 비 흡수성 봉합사 때문에 몇 주 동안 수술 후 문 합부를 찾을하는 것이 가능하다.
    3. 0.1 M 인산과 2 % 글 루타 알데하이드 (glutaraldehyde)에 RLN의 말단 부분을 놓고4 ℃에서 2 시간 동안 (= 7.3의 pH)
    4. 조심스럽게 코로나 섹션을 실현하기 위해 샘플의 방향.
    5. 인산 버퍼에 샘플을 씻으십시오.
    6. 1 % cacodylate에 실온에서 60 분 동안 작은 세그먼트 (3-4 mm 길이)와 후위를 절단 OSO 4 에탄올 탈수 버퍼링.
    7. 오리엔트 실리콘 금형 샘플 및, POLYBED 812 DDSA 및 MNA으로 이루어지는 수지에 매립 촉진제 BDMA 2 %를 첨가하도록한다.
    8. Pyramitome Ultramicrotomy 시스템을 사용하여 반 얇은 가로 섹션 (1 ㎛ 두께)을 확인합니다.
    9. 70 ℃에서 75 초 동안 1 %의 나트륨 붕산 0.1 % 톨루이딘 블루로 얼룩
    10. 계수 분석 시스템 RLN 샘플을 분석합니다. 섬유의 수를 세어 수초의 외측 및 내측 경계를 결정함으로써 유수 신경 섬유 프로파일을 측정한다.
  4. 이식
    1. 이식 세포를 준비하고 이전에 기술 된 세포를 이식"세포 이식"에 (2.2 절).
    2. 분석
    3. 펜토 바르 비탈 과다 복용을 사용하여 동물을 안락사. 동물의 고정은 PFA의 심장 내 주입 4 %를 사용하여 수행 할 수 있습니다.
    4. RLN의 약 2cm를 제거합니다. 근위 및 RLN의 말단 부분을 사용합니다.
    5. 액체 질소에 RLN 샘플을 수정.
    6. -80 ° C에서 저장 샘플
    7. 컷 샘플은 길이 방향으로 저온 유지 장치 (10 ~ 20 μm의 두께)를 사용하여.
    8. GFP 양성 세포를 감지하는 형광 현미경으로 샘플을 분석합니다. 항-GFP 항체가 형광 발광을 증가시키고 costainings을 수행 할 수 없습니다.

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결과

제어와 (과 / 문합) 동물 reinnervated와 그림은 결과 (OM, OB 또는 OM + OB) 수행 세포 이식에 따라 달라질 수 있습니다로 선정되었다.

세포 배양
세포는 플라스틱 표면에 빠르게 밀착 기다란 또는 테이퍼, 삼각형, 다극 또는 방추형되는 셀로 병렬 달해으로 분리되었다 (도 1a 및도 1b). 세포 계측법 분석 시험 관내 흐름의 8 일 후에 P75 양성 세포의 비율, 기본 OB에서 71 %, 및 기본 OM 문화의 13 % (그림 1C 및 1D)를 보여줍니다.

세포 이식 수술
세포는 문합 RLN에 리겔 매체 믹스에 이식된다. RLN의 문합은 11.0 봉합의 한 지점 (그림 2)에 의해 이루어집니다.

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토론

여기에 제시된 기술은 OECs 말초 신경 손상 모델에서 세포 이식을 연구하는 유용한 모델합니다. 세포 배양 프로토콜은 비교적 간단하고 쉽게 행할 수있다. 한편, 수술 절차는 RLN의 특정 섹션 / 문합에서, 경험을 필요로하고 자격을 갖춘 기술자 만 수행해야합니다.

이 프로토콜에 설명 된 절차는 최상의 결과를 얻기 위해 포커스를 중요한 요소를 강조. 첫째, OM의 해리 동안, 우리는 후각과 호흡하지 상피 세포를 얻기 위해주의 절개를 추천합니다. 둘째, RLN의 문합을 위해, 우리는 11.0 봉합 한 점을 수행하는 것이 좋습니다. 셋째, 평가 과정은 모든 동물 사이 마취 동일한 깊이가 매우 중요하다. 특히, 깊은 마취 videolaryngoscopy 동안 성대의 움직임의 크기를 줄일 수 있습니다. 우리는 R 추천동물의 질식을 방지하기 위해 가능한 한 빨리 후두경을 emoving. EMG 촬영 중에는 인해 PCA 근육의 크기에 우리는주의 깊게 단극 바늘 전극을 배치하는 것이 좋습니...

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공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

저자는 원고를 편집하기위한 재정적 지원을 위해 박사 Fanie 나베 - 하이더에 ADIR (소재지 보조 Insuffisants Respiratoires à 보좌관)와 매그 드 난 Avenir에서 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEM/F12InvitrogenE3521T
FBSInvitrogenE3387M
페니실린/스트렙토마이신Invitrogen1152-8876
HBSSInvitrogenM3467Y
Trypsin-EDTAInvitrogenM3513P
CacodylateMerck1.03256.0100
DDSABiovalley00563-450
MNABiovalley00886-450
BDMABiovalley00141-100
Polybed 812Biovalley08791-500
PE 안티-마우스 BD Bioscience550589
Matrigel GFRBD Bioscience356231
Collagenase ARoche10103586001
Mouse anti P75ChemiconMAB 365
11.0 WireEthiconFG 2881
Toluidine Blue Ral Diagnostics361590-0025
원심분리기SigmaSigma 2-16PK
인큐베이터 Thermo Scientific
층류 후드더 빠른BH-EN 2003 S
유세포 분석기BD BioscienceFACSCalibur
MicroscopeZeiss
VideolaryngoscopeKarl Storz EndoskopeTelecam SL NLSC 20212120
Acquisition systemAD InstrumentsPowerlab system
피라미토미 초박절개술 시스템 라이카Ultracut S
이미지 분석 시스템Explora NovaMercator

참고문헌

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