여기에서, 우리는 이미지 세포 계측법은 문화 숙주 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 정량화를 위해 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 CFU 열거에 대한 대안으로 사용할 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
이러한 칸디다 알비 칸스, Histoplasma capsulatum, 그리고 크립토 neoformans를 같은 병원성 효모의 세포 발병 메커니즘의 연구는 일반적으로 단위 분석이나 유동 세포 계측법을 형성 식민지을 사용하여 효모 정량 뒤에 포유류의 호스트 또는 호스트 세포 (즉, 대 식세포)의 감염을 사용합니다. 콜로니 형성 단위 열거 분야에서 가장 일반적으로 사용되는 방법 왔지만,이 기술은 성장을 비교할 때 특별한 관심입니다 고체 미디어 및 저 및 / 또는 변수 도금 효율에 약간의 곰팡이 종의 성장 둔화 등 단점과 한계를 가지고 야생형과 돌연변이 균주. 유동 세포 계측법 효모의 생존에 대한 신속한 정량 정보를 제공 할 수 있습니다, 그러나, 병원성 효모에 대한 유세포 검출 채택 높은 비용과 바이오 안전성 고려 등 실제적인 이유로 제한되었습니다. 여기에서, 우리는 이미지 기반을 보여대식 세포와 공동 배양 가능한 병원성 효모의 정량 Cellometer 비전 (생명 Nexcelom, LLC)를 사용하여 유세포 방법. Histoplasma capsulatum과 칸디다 H. :. 우리의 연구는 두 가지 인간의 곰팡이 병원균의 검출에 초점을 capsulatum는 대식 세포 phagosome에 내 복제하여 폐포 대 식세포를 정착, 그리고 여기, 우리는 양적 H.의 성장을 평가 이미지 세포 계측법과 함께 크리 딘 오렌지 /의 propidium 요오드 염색을 사용하여 RAW 264.7 대 식세포에서 capsulatum 효모. 우리의 방법 충실 단위 열거 형을 형성하는 전통적인 식민지로 측정 recapitulates 성장 동향,하지만 크게 증가 감도. 또한, 우리가 직접 C.의 GFP 발현 균주 라이브 대식 세포의 감염을 평가 알비 칸스. 우리의 방법론은 협회의 재치있는 중요한 인간의 곰팡이 병원균의 검출 및 정량화, 신속 정확하고 경제적 인 방법을 제공합니다H 호스트 세포.
서론
자신의 호스트 및 / 또는 숙주 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 연구는 종종 시간 과정을 통해 또는 다른 감염 조건 하에서 가능한 진균 세포의 정량화가 필요합니다. 집락 열거 형 (CFU)이 가능한 진균 세포의 수를 측정 한하는 표준 방법입니다, 그러나,이 방법은 몇 가지 단점과 한계가있다. 첫째, 많은 곰팡이 종은 천천히 성장하고있다. 고체 매체에 표시 식민지의 성장은 크게 연구의 속도를 둔화, 1-3 주 소요될 수 있습니다. 여러 희석은 식민지의 셀 수있는 숫자를 보장하기 위해 도금해야하기 때문에 둘째, CFU 도금 동안 시료의 조작은, 힘든 과정입니다. 도금 효율은 물론 100 % 이하이기 때문에 셋째, CFU의 수는 도금 가능한 유기체의 수보다 일반적으로 낮다. 예를 들어, 동종 이형의 진균 병원체 Histoplasma capsulatum에 대한 도금 효율은 90 %로 높은 수 있지만, 같은 일상적으로 낮은 수30 %는 관련 곰팡이 dimorph의 Paracoccidioides의의 brasiliensis 1, 2 (10 %)도 낮다. 칸디다 albicans에 대한 도금 효율도 변화 3에 따라 달라질 수 있습니다. 많은 경우에, 그것은 죽은 및 / 또는 대사 비활성 셀의 존재와 농도를 결정하는 것이....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. H.와 대 식세포의 감염 capsulatum, C. albicans에
- 감염 이전에 16 시간, 24 잘 접시에 원하는 농도에 씨앗 식세포. 이 프로토콜에서는 잘 3.0 × 10 5 세포의 밀도가 /을 사용 하였다.
- 감염 원하는 다중성 (MOI)에서 로그 위상 성장 곰팡이 세포를 추가합니다. 이 프로토콜은 MOI의 범위 (- 5.0 0.2)을 수용 할 수 있습니다. H.와 RAW264.7 대식 세포의 감염 capsulatum, 우리는 MOI 0.2을 사용했다.
- 1.5 시간 식균 작용을 허용하는 다음, 세포 곰팡이를 제거하는 PBS와 대식 세포를 세 번 씻는다.
- 시료 분석 이전 시간에 원하는 번호를 품어. (우리의 실험 0.2) MOI 저에 감염된 대식 세포는 며칠 동안 가능한 남아 있고, 샘플마다 약 12 ~ 24 시간을 분석 할 수 있습니다.
2. 대식 세포 용해
- 대식 세포에서 곰팡이를 해방하려면, 미디어를 제거 PBS로 3 회 세척하고,0.5 ML 멸균 물을 추가합니다. 이러한 조건에서, 대식 세포 용해하고 곰팡이 세포는 그대로 유지됩니다. <....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
우리는 H.의 성장을 모니터링하는 Cellometer 비전 이미지 cytometer에 사용 대식 세포 capsulatum. RAW 264.7 세포는 H. 감염된 다양한 시간 지점에서 capsulatum 효모 세포는 샘플 이미지 기반의 유세포 분석에 의해 다음 AO / PI 염색을 실시 하였다. 병렬로, 샘플은 기존 CFU 열거 형으로 분석 하였다. 각 시점에서 시료는 대식 세포를 용해 물에 배양하였으며, 해방 효모 세포는 Cellometer 비전 소프트웨어 (도표 1A와 1B)에 의해 확인되었다. 각 시점 (그림 1C)에서 이미지 기반의 유세포 분석 및 CFU 열거 형에 의해 발견으로 우리는 가능한 효모의 농도에서 매우 유사한 경향을 관찰합니다. 예상대로, AO / PI 염색에 의해 감지 살아있는 효모의 절대 값 기호를 강조 CFU 분석에 의해 평가로 고체 배지에서 집락 형성 할 수있는 효모의 수보다 지.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이미지 세포 계측법은 사용자가 고품질 이미지를 캡처 전문 소프트웨어를 사용하여 세포의 빠른 정량화를 수행 할 수 있습니다. 미생물 병인의 분야에있는 이미지 세포 계측법의 채택에 하나의 잠재적 인 문제는 계산되는 미생물 포유류 숙주 세포를 포함한 세포의 혼합 인구에 존재하는 것입니다. 여기에서, 우리는 이미지 세포 계측법은 체외 대식 세포 감염시 가능한 병원성 효모의 정량화를 위해 사용할 수 있습니다 보여줍니다. 우리의 방법론은 체외 대식 세포 감염 시험 법의 동안 관찰 곰팡이의 성장과 생존에 충실 recapitulates 동향뿐만 아니라, 기존의 CFU 분석 13에 비해 향상된 감도를 표시뿐만 아니라.
효모 세포의 정량화 CFU 열거 나 유동 세포 계측법 하나와 비교할 때 이미지 세포 계측법은 몇 가지 실질적인 이점을 제공합니다. CFUs을 도금 할 때, 실험실 노동자 플레이트 여러 dilut.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자 레오 리튬 잉 찬과 벤자민 파라는 Nexcelom 생명 LLC의 직원입니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| 태아 소 혈청 | Life Technologies | 16000044 | |
| AO/PI 솔루션 | Nexcelom Bioscience | CSK-0102 | |
| 일회용 계수 챔버 | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| < strong>EQUIPMENT | |||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | ||
| Cellometer Vision Software | Nexcelom Bioscience |
참고문헌
- Worsham, P. L., Goldman, W. E. Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores. J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).
- Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
