모터 신경 절개와 라이브 제브라 피쉬의 아교 세포 행동의 시간 경과 영상

제브라 피쉬 때문에 그들의 광학 투명 신경계의 발달을 연구하고 transgenesis의 용이성, 그 결합 할 때, 생활 배아에서 동적 세포 행동의 멋진 영상을 허용하기 위해 광범위하게 사용되어왔다. 제브라 피쉬와 포유류는 거의 모든 신경계 형성이 모델 생물에서 수집 한 세포 및 분자 정보에 필요한 유전자 공유하기 때문에 또한, 다른 척추 동물 종에 직접 논리적 인 사람이어야합니다. 신경 발달 연구를위한 매우 강력한 있지만, 제브라 피쉬와 독특한 속성은 또한 손상 후 신경 시스템을 유지하고 다시 메커니즘을 규명 할 수있는 잠재력이있다. Zebrafish의 유충 늦은 애벌레 단계로 자신의 반투명을 유지하고 색소 침착을 효과적으로 멜라닌 생산 또는 색소 세포가 부족한 유전자 돌연변이의 약물 억제제의 사용도 함께 차단 될 수 있습니다. 따라서,이 모델 생물을 사용하면 부상 및 regenerat을 연구하는세 동물의 이온이 가능하고, 직접 신경 시스템을 다시 세포 및 분자 메커니즘을 조사하는 독특한 기회를 제공합니다. 이 논문에서, 우리는 효율적이고 재현성 zebrafish의 애벌레의 PNS의 신경을 손상하는 방법에 대해 설명합니다. 이 부상 패러다임은 주변 glia의 면역 세포의 반응뿐만 아니라, 재생하는 동안이 인구 사이의 상호 작용도 변성뿐만 아니라 공부에 자신을 준다, 그러나.

PNS는 유기체가 환경과 상호 작용하고 생존 할 수 있도록, 중추 신경계 (CNS)와 피부, 장기와 신체의 근육 사이에 정보를 전달하는 데 필요한 운동 및 감각 신경의 복잡한 네트워크입니다. 이 신경을 따라 수초가 아닌 수초 슈반 세포와 perineurial 아교뿐만 아니라, 결합 조직, 축삭 넣다 궁극적으로 성숙한 신경을 형성하는 등 주변의 glia. 이러한 신경의 손상이 프로​​세스 K를 시작Wallerian 변성 ¹⁰ nown. 축삭 분열, 면역 채용, 파편 통관 및 재생이 메커니즘은 매우 틀에 박힌 및 유전자 ¹ 규제이다. 포유류 시스템의 이전 연구는 신경 변성 및 재생 ^{1, 2, 6, 8시} 슈반 세포의 역할을 설명했습니다. 고정 된 조직 또는 세포 배양의 이러한 연구에서는 슈반 세포뿐만 아니라 파편 정리에 도움이 상해 사이트에 대식 세포를 모집뿐만 아니라, 수초의 식균 작용 자체 주었. 이러한 연구는 매우 유익하고 있지만, 우리는 실시간으로 생체 내 말초 축삭 손상에 대한 시각 신경교 반응하기 전에 적이없는, 그리고 다른 연구는 이러한 이벤트 기간 동안 주변 교세포의 다른 클래스 사이의 관계를 조사 없다.

최근, 여러 실험실 우리가 여기서 설명하는 것과 유사한 제브라 피쉬와 레이저 매개 축삭 손상을 사용 Wallerian 변성을 조사했습니다 4, 5, 9를 사용하여 어린 유충에 axotomized 하였다. 또 다른 연구에서, 이는 우리 자신과 매우 유사하다, 복부 운동 신경에서 깊은 축삭은 상업적으로 이용 가능한 레이저 제거 시스템 ^7을 사용 오일 오래된 유충에 그었 하였다. 이러한 실험 셋업 모두에 초점을 Wallerian 변성 두 축삭과 면역 세포 군데 있었다있었습니다. 이러한 연구를 확장하기 위해, 우리는 더 성숙한, 유수 신경 및 분석 변성과 재생 동안 모든 신경 관련 주변 교세포의 반응을 함께 오래된 애벌레의 모터 축삭 손상 대해 설명합니다.

이렇게하려면, 우리는뿐만 아니라 손상된 축삭을 따라 이러한 집단 간의 상호 작용을 조사하기로 6 운동 신경, 7 일 게시물 수정 (DPF) 유충을 절개 개별 교세포 집단의 반응을 시각화. 더블, 트리플 TRA를 사용하여그 슈반 세포와 perineurial 아교뿐만 아니라 축삭을위한 마커 등의 라벨 주변 아교, nsgenic 라인, 우리는 구성된 시판 레이저 제거 시스템을 사용 질소 펌프 회전 디스크 공 촛점 시스템에 부착 된 염료 레이저 (파장 435 nm의) 축삭 transections을 만들 수 있습니다. 이 실험 셋업 우리가 서로 축삭 손상과의 관계에 특정 주변 장치 모터 축삭 책자 및 시간 경과 이미지 별개의 폐해 인구의 반응을 손상, 라이브, 애벌레 zebrafish의를 시각화 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 또한 다른 과학적 문제를 해결하기 위해 서로 다른 유전자 변형 라인이나 유전 적 돌연변이로, 다른 나이의 제브라 피쉬의 신경 부상을 만들기 위해 적용 할 수 있습니다.

1. 절제와 라이브 영상을위한 준비 및 제브라 피쉬 배아의 설치

1. 계란 물에 0.8 % 낮은 용융 아가로 오스의 주식을 준비한다. 필요한 ° C까지 4에서 13X 100mm 처분 할 수있는 문화 튜브 및 저장소로 나누어지는.
2. 찬란 모터 뉴런과 관심의 아교 세포 유형 레이블을 안정적으로 통합 된 형질 전환 유전자를 포함하는 크로스 성인 zebrafish의. 올바른 준비를위한 ° C 배양기 ³ 이후 28.5 달걀 물과 장소에 제브라 피쉬 배아를 수집합니다.
3. 약 24 시간 포스트 수정 (HPF)에서 계란 물을 제거하고 계란 물에 1 - 페닐 -2 - 티오 우레아 (PTU) 0.002 %를 추가합니다. 인큐베이터에 배아를 반환합니다.
4. 24 96 HPF 사이에, 배아는 형광 해부 범위에서 원하는 형질 전환 유전자의 존재에 대한 검사를해야한다. 신선한 PTU 계란 물에 선택된 배아를 놓고 인큐베이터로 돌아갑니다.
5. 유충 6 일 게시물 수정 (DPF) (또는 원하는 나이)에 도달하면, 인큐베이터에서 제거, 설치에 대한 몇 가지 유충을 선택하고, 작은 접시로 전송할 수 있습니다.
6. 접시에서 물을 제거하고 즉시 PTU 달걀 물에 약 0.02 % Tricane로 교체합니다. 유충은 약 5 분 마취에 앉아 할 수 있습니다.
7. 30 초 동안 수돗물 전자 레인지 비커에 0.8 % 낮은 용융 아가로 오스의 나누어지는을 배치하거나,​​ 아가가 녹을 때까지. 문화 관 아가로 오스가 터치 (뜨겁지 않은)에 미지근한 느낌까지 비커를 냉각 할 수 있습니다.
8. 마취 유충을 선택하고 단일 또는 다중 아니라 35mm 유리 바닥 접시에 전송할 수 있습니다. 애벌레로 전송 된 모든 물을 제거 후 즉시 요리의 유리 바닥 부분을 채우기에 충분한 따뜻한 아가로 오스와 유충을 커버하지만, 큰 돔을 만들 수 없습니다.
9. 아가로 오스는 견고으로 접시의 바닥에 옆으로 애벌레의 위치를​​ 해부 바늘을 사용하여, 다음의 뒷면에 단지 약간 애벌레를 기울이십시오. 그것은 부상 이후 이미징을위한 필수적입니다마운트 된 유충은 접시의 바닥에 유리를 터치 할. 아가로 오스가 응고되어 유충이 고정 될 때까지이 위치에 유충을 유지하기 위해 해부 바늘을 사용합니다.
10. 아가로 오스가 완전히 경화되면, 천천히 완전히 아가로 오스와 유충을 커버하는 접시에 충분히 Tricane 물 (이것은 마취에 사용되는 것과 동일한 Tricane 될 수 있습니다) 피펫.

2. 레이저 교정 및 테스트

1. 모든 공 촛점 현미경 계측, 흥미 진진한 제브라 피쉬의 도입 유전자에 적합한 다이오드 레이저, 및 질소 펌프 색소 레이저를 켭니다. "빈"빔 스플리터가 제자리에 있는지 확인합니다, 레이저 감쇠기는 완전히 개방하고, 435 nm의 쿠마린 염료 셀 위치에 있습니다. 컴퓨터에서 이미징 소프트웨어를 엽니 다.
2. 위치에 63X 1.2NA 물 침수 목표를 이동하고 객관적 위에 물이 목적을 침수 매체의 작은 방울을 적용합니다. 63X 목표는 좋은 레이저 절제 정확도 및 물 수 전mmersion 6-7 DPF의 zebrafish의 애벌레로 작업 할 때 필요한 큰 작업 거리를 허용합니다.
3. 레이저의 교정을 위해 사용하는 하나의 미러면 유리 슬라이드를 얻습니다. 현미경 스테이지로, 슬라이드, 거울면을 아래로 놓습니다.
4. 브라이트 조명 아래 접안 렌즈를 사용하여, 찾아 거울에 흠집이나 에칭에 초점을 맞 춥니 다. 브라이트 빛은 유리 슬라이드에 아래로 빛나는 수 있지만 미러가 긁히거나 에칭 된 장소에서 목적에 통과하고, 접안 렌즈를 통해 검은보고 거울을 유발하고, 에칭은 반점 같이하거나 빛의 라인.
5. 이미징 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터 화면에 에칭을보고 초점을 맞 춥니 다. 레이저 캘리브레이션 및 전원 설정을 제어 창을 엽니 다. "1"펄스의 수와 "3"%의 전송에 감쇠 플레이트를 설정합니다. 펄스의 수는 레이저 각 관심 영역 (RO 내에 발생하는 횟수를 나타냅니다I)와 % 전송은 레이저 출력을 나타냅니다. 정확한 보정 설정은 63X 1.2NA 침수 목적으로 선택되어 있는지 확인합니다.
6. 기본 도구 모음에서 타원 도구를 선택하고 하나의 원형 ROI를 생성하는 컴퓨터 화면의 이미지를 클릭합니다. 이미지 위에 무작위로 간격을 4 원형 로아가 될 때까지이에게 3 번 이상을 수행합니다.
7. 일부 시스템은 접안에 빛의 경로가 열려있는 경우 레이저가 발사하는 것을 허용하지 않습니다 안전 기능을 포함 할 수 있습니다. 이 경우 수동으로 시간 접안에 빛의 경로를 닫습니다.
8. 레이저를 발사. 이것은 각 원형 ROI 내 4 작은 반점 에칭, 1을 생성합니다. 레이저가 발생하지 않는 경우, 레이저가 켜져 있고 제대로 연결되어 있고, 접안에 빛의 경로가 닫혀 있는지 확인 할 수 확인하십시오. 레이저 발생하지만 에칭을 볼 경우, "빈"빔 스플리터가 제자리에 있는지 확인합니다 확인하십시오. 모든 장소에있는 경우, 에칭 아칸소 때 레이저 파워와 "FRAP을"증가가시 마. 10보다 큰 설정 레이저 전원 에칭 유리 필요한 경우,이 레이저 플라즈마 카트리지를 교체해야합니다 나타낼 수 있습니다.
9. 에칭 반점 선택한 ROI를 가운데에 나타나는 경우, 보정 (2.12로 진행) 필요가 없습니다. 반점이 중앙에 있지 않은 경우, 보정 설정을 업데이트해야합니다.
10. 보정하려면 업데이트에게 보정 설정을 클릭합니다. 레이저 발사하고 이미지는 하나의 에칭 포인트를 포함한 나타납니다. 지점이 표시되지 않는 경우, 보정을 취소 레이저 출력을 증가하고, 다시 교정을 시작합니다.
11. 현장의 중심을 클릭합니다. 레이저가 다시 발생하고, 다른 지점이 표시됩니다. 그 점을 클릭하고 교정이 완료되고 9 반점 그리드 방식으로 표시 될 때까지이 과정을 반복합니다. 보정이 성공적으로 완료되었는지 확인하는 단계 2.6-2.9를 반복합니다.
12. 현미경 스테이지에서 유리 슬라이드를 제거하고 목표를 청소합니다. OCU에 빛의 경로를 엽니 다라스, 및 "100 % ILL"빔 스플리터 "빈"빔 스플리터를 교체합니다.

3. 레이저 어블 레이션 및 아교 세포 행동의 경과 공 촛점 이미징을 사용하여 신경 절개

1. 유리 슬라이드를 보유하고 35mm 유리 바닥 요리를 유지하기위한 적절한 단계로 교체하는 데 사용되는 단계를 제거합니다. 63X 1.2NA 물 침지 목표를 계속 사용합니다.
2. 목적에 침수 매체의 작은 방울을 적용하고 무대에 탑재 된 유충과 접시를 놓습니다. 클립 접시를 안정.
3. 접안 렌즈와 위드 조명을 사용하여 유충을 집중하고 운동 신경을 찾습니다. hemisegments 10-20에 신경을 검사하고 절개를위한 모터 신경을 선택합니다.
4. 이미징 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터 화면에 신경의 라이브 뷰를 엽니 다. Z-평면을 선택하고 축삭 손상되지 않은 신경 glial 세포의 이미지를 획득.
5. 캡처 이미지 소프트웨어에서 시간 경과 영상 설정을 준비합니다실험에 따라 5-30 분 간격의 모든 세포 유형의 Z-전망. 그것은 절제를 수행하기 전에 시간 경과에 필요한 모든 설정을 만드는 것이 좋습니다, 그래서 부상이 완료되면 시간이 경과 시작의 지연이 없습니다.
6. "100 % ILL"빔 스플리터를 제거하고 "빈"로 바꿉니다. 접안하는 광경을 닫습니다.
7. 신경의 라이브 뷰로 돌아갑니다. 그었 될 축삭을 보려면 적절한 형광 채널을 사용합니다.
8. 타원 도구를 사용하여 소작 할 영역의 얇은 타원형 ROI를 만든 다음 선택한 지역 내 작은 ROI를 만듭니다.
9. 레이저 설정을 제어 창에서 "2"로 펄스 수를 설정하고 감쇠 판 "18"% 전송합니다. 선택한 로아에서 레이저를 발사. ROI를 내 형광 유물은 레이저 출력을 증가 시키면 약 10 초 정도 기다린 다음 다시 레이저를 발사. 당신이 fluorescen을 일으키는 설정에 도달 할 때까지이 작업을 수행세륨은 ROI를 내 사라질 수 있습니다.
10. 10 초 이상 기다린 후 형광 다시 소작 영역을 확인합니다. 실제로 photobleached 때 ROI가 처음 소작 나타날 수 조심. 형광 반환하면 레이저 출력을 증가시키고 다시 레이저를 발사. 개화는 ROI를 내 사라지고 10 초 내에 반환되지 않을 때까지이 과정을 반복합니다. 그것은 낮은 레이저 출력을 시작하고 필요한 전력을 증가하는 것이 가장 좋습니다. 필요한 레이저 파워는 개별 현미경 시스템, 쿠마린 염료의 나이, 시편 장착, 유충의 연령, 조직의 두께에 따라 달라질 수 있습니다. 이상적인 레이저 전원이 설정되면,이 전원 설정은 동일한 실험에서 다음 신경에 다시 사용할 수 있습니다.
11. 제거가 완료되면, 시간 경과 영상을 시작합니다.
12. 시간 경과가 완료되면 데이터를 컴파일하고 Z-투상 각 시점의 컬러 복합 만들 이미징 소프트웨어를 사용합니다. 동작을 분석하는 QuickTime 동영상을 만들동시에 축삭과 glial 세포의.

여기에 설명 된 분석은 생체 내에서 축삭 손상에 glial 세포와 다른 신경 관련 세포 집단의 반응을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 영화 1이 방법과 glial 세포를 둘러싼의 응답을 사용하여 만든 신경 손상의 예를 보여줍니다. 이 실험은 (nkx2.2a : megfp) 전이에서 수행되었다 전이 (olig2 :는 DsRed) 제브라 피쉬, perineurial의 glia은 EGFP와 모터 뉴런 표현 세포질이 DsRed를 대상으로 멤브레인을 표현하는합니다. 부상은 6 DPF 라이브 제브라 피쉬의 트렁크 모터 신경의 주동이의 돌기를 따라했고, 신경 이후 EGFP와 DsRed를 채널 모두에서 이미지가 시간 경과이었다. 축삭과 아교 세포 행동이 허용 동시 시각화는 즉시 부상을 따라.

그림 1은 여전히 영화 1에서 가져온 정적 시간 점의 이미지를 보여줍니다. 점선 타원은 레이저를 이용하여 소작 된 ROI를 보여줍니다. 한 분게시물 절개 (MPT)은 소작 지역은 형광 부족과 부상 영역은 말초 그루터기 근위부에서 약 3.5 음을 측정 하였다. 절개의 성공은 영상에 의해 말초 신경 그루터기를 확인하고 말초 축삭 조각 및 신속한 통관 등의 Wallerian 변성의 흔적을 찾고 할 수 있습니다. 120 MPT에서 그림 1의 말초 그루터기에 따라 축삭 형광의 부재는 이러한 축삭이 실제로 Wallerian 변성을받은하고 절개가 성공을 나타냅니다.

레이저 박리 실험을 수행 할 때 이상적인 설정으로 레이저 파워를 조절하는 것은 매우 중요합니다. 이상적인 레이저 전원 설정이 정상적으로은 선택한 ROI 내 신경을 브레이션하고, 낮거나 너무 높은도 있습니다 레이저 전원 설정은 최적의 결과를 얻을 것입니다. 그림 2a가 너무 낮다 레이저 파워 하였다 부상을 보여줍니다. 형광 레이저를 발사 한 후 ROI 내에 남아, 완전 절개. 그림 2B의 결과는 매우 큰 절제의 결과로, 너무 높았다 레이저 파워 하였다 부상을 보여줍니다.

영화 1. 모터 신경 절개와 perineurial 아교 세포 행동의 공 촛점 시간 경과 영상. 영화는 1 MPT 및 이미지 190 분 총 10 분 간격 촬영 이미지 뒤에 트렁크 모터 신경 사전 상해를 보여줍니다. 전이 (olig2 :는 DsRed) : 부상 라이브 6 DPF 전이 (megfp nkx2.2a)에서 수행 하였다. 앞쪽에 탑재 제브라 피쉬의 유충 왼쪽 상단 등의 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 1. 모터 신경 절개 및 정지 영상아교 세포의 행동. 패널은 여전히 영화 1에서 찍은 이미지입니다. 점선 타원 영역은 점선으로 표시된 절개 부상을 작성, 소작 된 ROI를 나타냅니다. 화살촉 10 MPT에 존재하는 축삭 형광을 가리 있지만 120 MPT에서, 원위부 축삭 퇴화 표시. 스케일 바, 10 μm의.

그림 2. 최적의 레이저 전원 설정은 원치 않는 결과를 발생합니다. () 시도 절제가 너무 낮은 레이저 파워로 수행. 점선 타원 선택한 ROI를 나타냅니다. 1 지역은 약간 photobleached과 (화살촉) 그었되지 않았 MPT. (B) 절제가 너무 높은 레이저 전원 실시. 점선 타원 선택한 ROI를 나타낸다. 1를 MPT소작 영역은 선택한 ROI (점선)보다 훨씬 크다. 전이 (olig2 :는 DsRed) : 모든 이미지가 실제 6 DPF 전이 (megfp nkx2.2a)에서 촬영 앞쪽에와 zebrafish의 애벌레 왼쪽 상단 지느러미. 스케일 바, 10 μm의.

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