그람 음성 박테리아 지질 다당류 (LPS)의 지질 도메인의 분리 및 특성은 세포 표면 항생제 내성의 기반 메커니즘, 세균의 생존과 건강, 어떻게 화학적으로 다양한 지질 분자 종은 차등 호스트 타고난 면역 반응을 조절에 대한 통찰력을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
지질 다당류 (LPS)는 외막 이중층의 외부 전단지에 증착 그람 음성 박테리아의 주요 세포 표면 분자이다. LPS는 세 개의 도메인으로 분할 될 수있다 : 원심 O-다당류, 코어 올리고당 및 지질 지질로 이루어진 도메인 분자 종 및 3 - 데 옥시-D-Manno의-옥트 -2 - ulosonic 잔기 (KDO). 지질 도메인은 세균 세포의 생존에 필수적인 유일한 구성 요소입니다. 그 합성에 이어 지질 화학적 항생제 화합물에 대한 내성을 증진하기 위해, 그리고 호스트 선천성 면역 반응의 매개체하여 인식을 회피하기 위해, 그러한의 pH 나 온도 등의 환경 스트레스에 대응하여 수정된다. 다음 프로토콜은 그람 음성 세균으로부터의 지질의 소규모 및 대규모 분리 세부. 절연 물질은 화학적 후 박층 크로마토 그래피 (TLC) 또는 질량 분광법 (MS)에 의해 특징된다. 또한에 F의 레이저 탈착 / 이온화 타임 매트릭스 지원빛 (MALDI-TOF) MS는, 우리는 또한 충돌 유발 분해 (CID)에 연결된 전자 분무 이온화 (ESI) 및 새로 채용 자외선 광분해 (UVPD) 방법을 사용하여 지질에게 분자 종을 분석 탠덤 MS의 프로토콜을 설명합니다. 우리의 MS 프로토콜은 고유 또는 새로운 화학 수정을 포함하는 지질 분자의 특성에 가장 중요한, 화학 구조의 명백한 결정을 위해 수 있습니다. 우리는 또한 TLC로 분석 박테리아 세포에서 지질의 방사성 동위 원소 표지, 이후 격리를 설명합니다. MS-기반 프로토콜에 상대적 TLC는보다 경제적이고 신속한 특성화 방법을 제공하지만, 명백하게 알려진 화학 구조의 표준을 사용하지 않고 화학 구조 지질을 할당 할 수 없다. 지난 20 년간 지질의 분리 및 특성은 그람 음성 세균, 항생제 RESIS의 메커니즘의 생리에 대한 우리의 이해를 향상하는 많은 흥미로운 발견되었다tance, 인간의 타고난 면역 반응 및 항균 화합물의 개발에 많은 새로운 목표를 제공하고 있습니다.
서론
지질 다당류 (LPS)는 거의 모든 그람 음성균의 주요 외부 표면 분자이며 세 분자 도메인으로 구성 원위 O-항원 다당류, 코어 올리고당, 및 막 - 관련 지질의 외측 전단지에 증착 도메인 외막 이중층 1,2. 지질 도메인은 지질이 약한 산 가수 분해 1시 LPS의 클로로포름 가용 부분으로 정의 할 수 있습니다 3 - 데 옥시-D-Manno의 10 월 2 ulosonic (KDO) 잔류 물과 지질 분자 종으로 구성 2. 모델 생물 대장균 (E. 콜라이) 1,2 관찰 주요 지질 종과 일치; 표준 지질 분자는 화학적 헥사 아 실화 및 비스 - 인산화 diglucosamine 백본으로 정의 될 수있다. 그람 음성 박테리아에 걸쳐 보존 나인 구조적으로 표현 된 유전자는 지질의 생산 도메인 (그림 1) 1, 2에 대한 책임이 있습니다. 대부분의 박테리아는 지질 3의 추가 화학적 변형에 참여 계통 보호의 정도에 차이가 유전자의 추가 집합을 보유하고 있습니다. 탈 인산화, 아실 사슬의 제거와 같은 아미노 당 (예 aminoarabinose) 및 / 또는 phosphoethanolamine ....
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프로토콜
모든 솔루션은 초순수 및 HPLC 급 메탄올과 클로로포름으로 준비를해야합니다. 메탄올, 클로로포름, 피리딘 및 농축 산 또는 염기와 같은 유기 용매를 포함하는 준비 솔루션을 준비하고 화학 흄 후드에서 사용되어야한다. 모든 용액은 RT에서 저장 될 수있다. 용제는 캡을 지어 졸업 유리 실린더 측정 및 PTFE 유리 용매 병에 보관해야합니다. 장기간 저장을 위해 클로로포름 - 함유 용매는 포스겐의 생산, 고 반응성 산 클로라이드를 피하기 위해 착색 호박색 유리 병에 저장되어야한다. PTFE의 원심 분리기 튜브 및 회전 증발기 플라스크는 사용하기 전에 메탄올과 클로로포름으로 세척해야한다. 용매 및 / 또는 방사성 폐기물의 처분 필요한 경우 연방, 주 및 / 또는 기관의 폐기물 처리 규정을 따르십시오.
1. 대규모 지질 추출 (50 ㎖ L 1.5)
- 단상 Bligh 고 - 다이어 혼합물을 준비 클로로폼 메탄올-1X 인산은 식염수 (PBS), 산도 7.4 버퍼, 1:2:0.8 V / V). 클로로포름 200 ㎖, 1 L 용매 병에 PBS 400 ㎖의 메탄올 160 ㎖의 결합. 모자 병 및 반전에 의해 혼합 (> 30 배). 환기 및 밀봉 저장하는 혼합 동안 주기적으로 캡을 풉니 다.
- 전 평형을 두 단계 Bligh....
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결과
E.의 정식 지질 4 '- 위치 - 대장균 및 살모넬라 엔테의 혈청 형 티피 뮤 리움은 헥사 실화 1에 인산염 그룹과 글루코사민의 이당류이다. 리치 미디어 (예 : 루리아 국물)의 성장하는 동안 지질의 부분은 트리스 - 인산화 종 36 (그림 1)를 산출 한 위치에서 피로 인산 그룹이 포함되어 있습니다. KDO (3 - 데 옥시-D-Manno의 - octulosonic 산은)에 부착 된 6'-히드 록시와 LPS의 나머지 탄수화물 도메인 (예 : 코어 올리고당 및 O-항원 도메인)에 지질을 연결하는 다리 역할을한다. 그람 음성균은 지질에 대해 보존 된 경로를 공유하지만 E. 유사한 생합성 콜라이 K-12 지질의 구조 다양성 다량있다. 이러한 다양성은 환경 적 자극에 응답하여 활성화되는 지질 구조를 수정할 잠재 효소의 작용으.......
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토론
이 프로토콜에서 우리는 박테리아의 전체 세포에서 지질 종의 분리를 자세히 설명하고, 화학적으로이 절연 재료의 특성을 TLC 또는 MS 기반의 분석 방법을 설명했다. 텐덤 질량 분석법은 생물학적 화합물의 드 노보 구조적 특성에 대한 강력한 전략이며, 자연에서 볼 수있는 지질 분자의 갑옷의 한 벌의 화학적 특성 분석을위한 매우 중요한 이점입니다. CID 및 UVPD 지질 분자에 대한 키 지문을 제공하는 제품 이온의 종류를 만드는 두 가지 보완 정품 인증 방법입니다. CID 및 UVPD을 모두 사용하여 MS / MS 조각화 할 수 있습니다 화학 구조 할당에 대한 정밀한 세부 사항을 제공하는 지질 구조의 미묘한 차이의 해명. 이러한 유형의 데이터는 지질 분자 종의 생물학에 정확한 상관 관계 구조 / 기능 관계를 구축 할 필요가 있습니다. 또한 발에 32 P-방사성 표지 지질 종을위한 절차를 설명했다32 P-지질 종의 화학 패턴이 TLC 및 오토 라디오 그래피를 사용하여 시각화 할.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 또한 JSB에 R01GM103655을 부여 웰치 재단의 F1155 및 NIH에 의해 지원되었다 건강 (NIH)의 국립 연구소에서 보조금 AI064184 및 AI76322에 의해 MST 연구에 육군 연구 사무실에서 그랜트 61789-MA-MUR에 의해 지원되었다
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 클로로포름 | Thermo Fisher Scientific | C607 | HPLC 등급 |
| 메탄올 | Thermo Fisher Scientific | A452 | HPLC 등급 |
| 테플론 FEP 원심분리기 병 | Thermo Fisher Scientific | 05-562-21 | |
| 실리카겔 60 TLC 플레이트 | EMD Biosciences | 5626-6 | |
| 등급 번호 3MM 크로마토그래피 종이 | Whatman | 3030700 | |
| Orbitrap Elite | Thermo Fisher Scientific | ||
| 질량분석기 | |||
| ExciStar XS Excimer Lasrer | Coherent Inc. | ||
| PicoTip Nanospray ESI 이미터 | 새로운 Obectives | ≥ 30 μ 막힘을 줄이기 위한 m | |
| 모델 505 펄스/지연 발생기 | Berkeley Nucleonics Corporation | ||
| 핫 플레이트 Thermoylne 2200 | Barnstead/Thermolyne | HPA2235MQ | |
| 16x125mm GPI 15-415 나사산 일회용 붕규산 배양 튜브 | Corning Pyrex | 99449-16X | |
| 재사용 가능한 나사산 PTFE 나사 캡 GPI 45-415 | Corning | 9999-152 | |
| 개인용 분자 이미저 시스템(인광) | BioRad | 170-9400 | |
| Autoradiography Cassette | Thermo Fisher Scientific | FBCS810 | |
| Phosphorscreen SO230 | Kodak | ||
| Peptide Mass Standards Kit | Sequazyme | P2-3143-00 | |
| Sonifier S250-A | Branson | 101063196 | |
| 1.5 ml 12x32 mm 테이퍼 베이스 나사산 바이알 | Thermo Fisher Scientific | C4000-V1 |
참고문헌
- Trent, M. S., Stead, C. M., Tran, A. X., Hankins, J. V. Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis. Journal of endotoxin research. 12, 205-223 (2006).
- Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
- Raetz, C. R., ....
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재인쇄 및 허가
