방법 논문

의 두부 컴플렉스 유전 유도하고 양성 및 침윤성 종양의 시각화를위한 프로토콜 초파리

DOI:

10.3791/50624

⸱

2013년 9월 11일

1Department of Biology, Western Kentucky University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RAS V12 및 남겼, 종양 세포는 또한 침략적인 행동을 표시 초파리에있는 종양의 성장 결과와 같은 세포 극성 유전자의 돌연변이와 같은 활성화 된 발암 유전자 간의 협력. 여기에 양성 및 침입 종양의 유도 및 관찰을위한 간단한 프로토콜을 제시한다.

초록

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초파리는 복잡한 질병 1-7에 대한 우리의 이해에 상당히 기여하고 있습니다 지난 몇 년과 오늘 정상 개발 및 질병의 유전 적 기초에 대한 우리의 이해를 조명하고있다. 전이 된 상태로 양성의 종양의 진행 상황은 복잡한 이벤트 8하고 우리가 더 나은이 질병 (9)의 유전 적 기초를 이해하는 데 도움이 초파리 모델로하고있다. 여기에 유 전적으로 유도 관찰하고 초파리 유충에 종양의 진행을 분석하는 간단한 프로토콜을 제시한다. 종양 유도 기술은 MARCM 시스템 (10)을 기반으로 활성화 된 종양 유전자, 라스 V12 세포 극성 유전자의 손실 (남겼, 디스크 크고 치명적인 거대한 애벌레) 침략 종양 9를 생성 사이의 협력을 활용한다. 나는이 종양은 그대로 유충으로 시각화 할 수있는 방법을 설명하고그럼 어떻게 이러한 추가 분석을 위해 해부 할 수 있습니다. 여기에 제시된 단순화 된 프로토콜은 가능한이 기술은 종양의 침공에있는 유전자의 역할을 이해에 관심있는 연구자에 의해 이용 될 수 있도록해야한다.

서론

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전이 된 상태로 양성의 종양의 진행 상황은 본체 (8)에 존재하는 보호 메커니즘을 회피 특징 단계 현명한 방법입니다. 예를 들어 몸에있는 종양 세포는 세포 사멸과 면역 체계를 회피 지하실 멤브레인라고하는 특수 세포 외 기질 (ECM)을 돌파구와 주변 세포 (8)에 의해 부과 된 사회 통제를 극복 할 수 있어야합니다. 이는 암세포가 전이 불리는 프로세스에서 먼 위치를 이주 및 정착 할 수있는 능력을 습득하는 것이 현명 단계 진행을 통해서이다. 종양 세포는 몸에 의해 부과 된 장벽을 극복하는 방법에 대한 우리의 이해는하지만, 연구의 새로운 그림이 암 세포 11 ~ 13로 정상 발달 과정 및 신호 전달 경로의 반복 사용으로 지금까지의 포인트를 수행, 아직 초기 단계에있다.

열매는 초파리 melanogaster의 우리 싶게에 엄청난 기여하고있다 비행지난 몇 년간 14 ~ 17에 걸쳐 개발 정교한 유전자 기술의 사용을 통해 정상적인 발달과 질병의 erstanding. 우리는 다양한 종양 유전자와 종양 억제 유전자 18-22의 더 나은 이해에 도착했습니다 돌연변이 유발 및 과발현 도구를 사용하여. 그러나, 종양 전이가 세포 배양 모델 (23, 24)뿐만 아니라, 다양한 이종 이식 모델에서 25-27 주로 연구되어 여러 유전자 ​​병변 간의 협력의 결과이다. 그들은 완전히 살아있는 유기체에서 발견되는 조건을 모방하지 않는 한이 모델 강력한하지만 자신의 제한이 있습니다. 또한, 마우스에서 사용할 수있는 형질 전환 모델은 복잡하고 침략적인 행동 (28, 29)의 유전자 분석에 도움이되지 않습니다. 몇몇 연구는 초파리 (30, 31)에서 종양 세포의 침윤을 이해하려고했습니다. 이러한 기술은 주로 호스트 일차 종양 이식을 활용하고 TRA 추적에 의존이웃 조직 (32, 33)의 침략 종양을 nsplanted. MARCM 10라는 강력한 기술은 초파리 9 종양의 침략을 모델로 Pagliarini와 쑤으로 적응했다. 종양의 침윤이 우아한 유전 모델링은 활성화 된 종양 유전자 및 세포 극성의 손실 사이의 협력을 악용. 이러한 모델링의 전력은 침습 종양 따라서 조직의 이식을위한 필요성을 우회 본래 유기체에서 생성된다는 사실에있다. 종양의 협력에 대해 가지고, 라스 V12 등 활성화 된 종양 유전자는 애벌레 눈 더듬이 디스크에있는 세포의 클론으로 표현된다. MARCM 기술의 결과로 이들 클론은 쉽게 시각화를 위해 녹색 형광 단백질 (GFP)로 표시되어 치명적인 거대한 애벌레 남겼, 대형 디스크와 같은 세포 극성 돌연변이에 대한 동형 접합 만들어집니다. 결과는 GFP가 침습성 종양 태그입니다 두개의 복잡한. 이 보고서 I유도하는 방법을 설명하고, 그대로 애벌레의 맥락에서 밖으로 해부 두개의 단지에 두 가지 침습적 종양을 시각화. 여기에 제시된 종양 유도 초파리의 두 번째 염색체에 시약을 사용한다. 표 2에서, 내가 같은 목적을 위해 이용 될 수있는 X와 3 번째 염색체에 주식의 목록을 제공합니다. 나는이 간단한 프로토콜은 종양의 진행의 분자 기초를 이해에 관심이 연구자들에게이 기술을 쉽게 액세스 할 수 있도록 것이라고 믿는다.

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프로토콜

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1. 양성 비 침습적 종양의 유도

  1. 양성 종양의 유도를 위해 표 2에 주식을 사용합니다.
  2. 다음과 같은 유전자형의 "테스터"주식에 대한 스타터 문화를 준비, 욕조 - Gal80, FRT40A, Y, EY-FLP1, w Act5C> Y +> 인 Gal4, UAS - GFP
  3. 다음과 같은 유전자형의 "테스트"주식에 대한 스타터 문화를 준비 W; FRT40A, UAS - 라스 V12 / CYO
  4. "테스트"주식에서 "테스터"주식 ~ 10 여성 처녀 십 명의 남성을 수집합니다.
  5. 플라이 음식과 함께 유리 병에 모두 배치하여 "테스터"및 "테스트"주식에서 남성과 여성을 교차.
  6. 25 ° C 배양기에서 십자가를 놓고 남성과 여성이 짝과 24-48 시간 동안 알을 낳을 수 있습니다.
  7. 충분한 계란 증착 먼저 령 애벌레 문화가 건조되지 않도록 만드는 존재의 병을 확인합니다.
    1. 멸균 몇 방울 추가(문화가 건조되어있는 경우)가 촉촉한 유지하는 문화에 물을 증류.
    2. 문화를 모니터하고 필요에 따라 단계 1.7.1를 반복을 계속합니다.
  8. 3 절에 설명 된대로 형광 실체 현미경을 이용하여 제 령 애벌레를 방황 관찰한다.

2. 침윤성 종양의 유도

  1. 침습성 종양의 유도를 위해 표 2에 주식을 사용합니다.
  2. 다음과 같은 유전자형의 위의 단계 1.2에서 스타터 문화를 사용하여, Y EY-FLP1, W, 욕조 - Gal80, FRT40A; Act5C> Y +> 인 Gal4, UAS - GFP
  3. LGL 4, FRT40A, UAS - 라스 V12 / CYO, W : 다음과 같은 유전자형의 "테스트"주식에 대한 스타터 문화를 준비
  4. "테스트"주식에서 "테스터"주식 ~ 10 여성 처녀 십 명의 남성을 수집합니다.
  5. 비행 F와 함께 유리 병에 모두 배치하여 "테스터"및 "테스트"주식에서 남성과 여성을 건너짐 우드.
  6. 25 ° C 배양기에서 십자가를 놓고 남성과 여성이 짝과 24-48 시간 동안 알을 낳을 수 있습니다.
  7. 충분한 계란 증착 먼저 령 애벌레 문화가 건조되지 않도록 만드는 존재의 병을 확인합니다.
    1. (문화가 건조되어있는 경우)가 촉촉한 유지하는 문화에 멸균 증류수를 몇 방울을 추가합니다.
    2. 필요에 따라 건조 단계를 반복 2.7.1의 문화를 지속적으로 모니터.
  8. 3 절에 설명 된대로 형광 실체 현미경을 이용하여 제 령 유충을 관찰합니다.

3. 양성 및 침윤성 종양의 관측

  1. 양성 종양의 격리 및 시각화를위한 세 번째 령 유충을 사용합니다.
    1. 증류수에 페인트 붓을 적시고,이 페인트 브러시를 사용하여 배양 병의 벽에서 몇 번째 령 유충을 다 쳤어요.
    2. 1X PBS와 우울증 슬라이드에 애벌레를 배치 한 다음 젖은 페인트 브러시 스크랩을 사용하여유충의 표피에서 어떤 음식 재료를 전자.
    3. 페트리 접시에 애벌레를 놓고 유충을 고정시키기 30 분 -20 ° C 냉장고에 둡니다.
      1. FLYNAP를 사용하여 유충을 고정화하는 다른 방법.
      2. 3.1.3.2에서 유리 병에 FLYNAP에 담근 FLYNAP 지팡이를 놓고 애벌레 유리 병하자 연결 유리 병을 연결 한 후 30 ~ 40 분간 방치.
    4. 빛 할로 카본 오일 한 방울을 추가 커버 유리 커버 및 녹색 형광 단백질 (GFP)을 시각화 할 수있는 능력을 가진 형광 실체 현미경을 이용하여 관찰, 유리 슬라이드에 고정 된 애벌레를 놓습니다.
    5. 양성 종양 베어링 애벌레는 두개의 복잡한 존재하는 전방 지역에서 녹색 형광을합니다.
  2. 침습성 종양의 관찰 위의 단계 # 2에서 설정 한 문화 일에게 (유도 후​​) 10 애벌레를 선택합니다. 침략 종양 베어링 애벌레 확장 L을 가지고 있기 때문에 10 일째 유충이 선택됩니다일반적으로 ARVAL 무대와는 pupariate 실패합니다.
  3. 대신 세 번째 령 애벌레 사용 일 10 애벌레를 제외하고 3.1.4 단계 3.1.1를 따르십시오.
    1. 하루 10 침습 종양 베어링 애벌레는 두개의 복잡한 존재하는 전방 지역에서 녹색 형광을합니다.
  4. 형광 현미경은 디지털 카메라가 장착되어있는 경우 다음 형광 양성 및 침입 종양 베어링 애벌레의 사진을 찍을.

4. 양성 및 침윤성 종양의 두개의 콤플렉스 및 추가 관측의 해부

유충의 반투명 표피 어려운 종양의 침윤 정도를 관찰 할 수 있습니다. 따라서 침략의 정도는 더 유충 밖으로 두개의 복잡한을 해부 시각화됩니다. 다음 단계는 두부 복잡한 해부하기 위해 이용되어야한다.

  1. 젖은 페인트 붓을 사용하면 F 제 령 (양성 종양) 유충 일 (침략 종양) 10 유충을 선택각각의 문화 튜브를 롬.
  2. 차가운 1X PBS를 포함하는 해부 접시에 잘 애벌레를 놓습니다. 유충의 표피에서 어떤 음식 입자를 긁어 페인트 브러시를 사용합니다.
    1. 차가운 1X PBS를 포함하는 해부 접시의 신선한 잘 깨끗한 유충을 전송합니다.
    2. 형광을 검출 할 수있는 실체 현미경을 이용하여 GFP의 형광의 유무를 확인합니다. 비 GFP 베어링 애벌레를 폐기하십시오.
  3. 해부 접시에 신선한 잘에 차가운 1X PBS의 1.0 ㎖를 추가하고 포셉 한 켤레를 사용하여 양성 또는 침습성 종양 (해부 프로토콜은 종양의 두 가지 유형에 대해 동일하게 유지) 중 하나를 베어링 유충을 전송합니다.
  4. 앞쪽 끝에서 2/3rds에 대한 포셉 한 쌍을 사용하여 유충을 누릅니다.
    1. 포셉의 다른 쌍을 사용하여 스마트 유충의 후방 1/3rd를 분리하고 폐기.
    2. 유충의 앞쪽에 2/3rds에 가자. 유충 내부 압력의 내용을 떼면유충 체강 배어 나오기 것이다.
    3. 창자, 지방 몸과 체강 밖으로 분출 한 흔적이 유충의 다른 내부 내용을 제거하는 포셉 한 쌍을 사용합니다.
    4. 유충의 입 후크를 잡고 애벌레 표피에 밀어 포셉 한 켤레를 사용하여 완전히 유충을 반전 포셉의 다른 쌍을 사용.
    5. 부드럽게 조심스럽게 지방을 몸, 침샘, 창자, 날개 디스크 복잡하고 어떤 기관 튜브를 제거하는 집게를 사용합니다. 두개의 복잡한 이제 반전 유충의 입으로 훅에 연결된 볼 수 있어야합니다. 뇌 반구 및 복부 신경 코드 (VNC)은 여전히​​ VNC에서 나오는 신경을 통해 유충의 표피에 연결됩니다.
    6. 부드럽게 두부 신경과 유충의 표피 사이의 연결을 중단 집게의 쌍을 사용합니다.
    7. VNC와 유충의 표피 사이의 신경 연결이 끊어 및 여분의 지방 기관 및 기타 조직을 제거 할 때, 두개의 공동MPLEX 명확하게 표시 될 것입니다 만 입 후크에서 유충의 표피에 첨부됩니다.
    8. 복잡한 항체 염색과 같은 다운 스트림 응용 프로그램에 이상 시각화 고정해야하는 경우 두개의 복잡한 애벌레 표피에 붙어 남아있을 수 있습니다.
    9. 더 다운 스트림 응용 프로그램이 다음을 수행하지 될 경우 두개의 복잡한 애벌레 표피에서 분리하고 추가 관찰과 분석을 위해 설치 미디어를 기반으로하는 글리세롤의 드롭에 배치 할 수 있습니다. 설치 매체로 VECTASHIELD를 사용합니다.

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결과

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프로토콜의 결과는 여기에 제시된 바와 같이, 사용자는 유충의 눈 더듬이, 상상 디스크에 활성화 된 종양 유전자를 과발현에 의해 양성 종양을 유도 할 수있을 것입니다. 사용자는 또한 세포 극성 유전자의 돌연변이 세포의 복제에 활성화 된 종양 유전자를 과발현에 의해 눈 더듬이 디스크에 침략 종양을 유도 할 수있을 것입니다. 종양은 쉽게 전체 유충이나 애벌레 체강 (그림 1) 중 해부 한 두개의 단지에있는 "녹색 형광"조직으로 형광 실체 현미경의 도움으로 시각화 할 수 있습니다. 침략 종양이 종양과 VNC와 인접한 다른 장기에 GFP 긍정적 인 침략 종양의 후속 마이그레이션의 대규모 전면에 자라 난에 발생합니다 반면 양성 종양은 GFP 양성 세포의 클론으로 눈 더듬이 디스크 복잡한 언어로 번역됩니다. > 10 일 이전의 유충에서 GFP 양성과 분리 된 이차 종양 (침습적 종양 유전자형에서 유래) 부유물애벌레 체강의 딸랑 딸랑 소리도 관찰 할 수있다. 양성 종양 베어링 애벌레 시간에 pupariat...

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토론

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암은 과거에 비해 훨씬 더 잘 이해 오늘날 복잡한 질병입니다. 그러나, 많은 여전히​​ 배우고 우리가 기본 메커니즘의 완전한 그림이 전에 설명해야합니다. 여기에 제시된 간단한 프로토콜은 가능한 유전자 전체 유기체의 양성 및 침입 종양을 유발하고이 모델에서 종양의 진행과 관련된 생물학을 연구 할 수 있습니다. 초파리 및 다른 생물체에서 기존 기술의 대부분은 종양 발생 및 전이 또는 23-27 성인 호스트로 일차 종양 조직의 이식을 이용하는 시스템을 이해하는 세포 배양 기반 시스템을 이용하거나. 셀 기반 및 이식 기술은 한계를 가지고 두. 예를 들어, 이식 기술은 복잡하고 시간 소모적이며 호스트로 비 종양 조직의 이식을 초래할 수있다. 이 실험 유물 생산 될 수 있습니다. 또한, 세포의 숭배우레 기반 시스템은 전체 유기체에 존재하는 실제 환경의 근사값이다. 이 제한은 어려운 종양의 진행과 전이 (34)에 중요한 역할을 매우 중요한 종양 미세 환경의 상호 작용을 모방 할 수있다...

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공개 사항

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I는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

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내 실험실에서 연구는 생물학의 시작 자금의 WKU학과, WKU 연구 재단 RCAP-I는 # 11-8032을 부여하고 지원하는 국립 연구소의 종합 의료 과학 국립 연구소에서 부모 부여를 통해 자금 KBRIN 면적 그랜트 건강의 보너스 번호 5P20GM103436-13에서. 또한 그의 실험실 내가 먼저 쑤 실험실에서이 기술을 확립이 기술 박사 레이몬드 Pagliarini에 소개 된 박사 티안 쑤에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10X PBS (인산염 완충 식염수) pH 7.2 원액Invitrogen, Sigma Aldrich
Chilled 1X PBS pH7.2 작업 용액Invitrogen, Sigma Aldrich신선하고 냉장 보관, 최대 일주일 동안 사용 가능
FlynapCarolina Biologicals유충 마취에 필요한 파리 마취
고정제0.1M PIPES, pH 7.2, 4% 파라포름알데히드해부된 두부 복합체
Ice BucketMultipleMaintain 솔루션을 얼음 위에 고정하는 데 필요합니다. 또한 냉각된 1X PBS에서 두부 복합체를 해부한 다음 Eppendorf 튜브
1.7ml Eppendorf 튜브다양한
유리 슬라이드, 커버 유리Fisher Scientific
Vectashield 마운팅 미디어 또는 기타 마운팅 미디어Laboratories
Halocarbon 200 또는 700 OilPolysciences Inc. 또는 Halocarbon.comHalocarbon 200은 형광 입체 현미경 Sally
Hansen "Hard as Nails"매니큐어모든 잡화점에서. Coverslip
A Leica MZ16.5 형광 실체 현미경 또는 기타 형광 실체 현미경Leica 및 기타충에서 GFP 형광을 관찰하는 데 필요
Dumont # 5 집게Fine Science Tools
Pyrex 9 웰 스폿 플레이트 또는 기타 해부 접시Sigma Aldrich
페인트 브러시는 모든 잡화점에서
Table 1. 이 기사에 제시된 실험 프로토콜을 수행하는 데 필요한 재료.
, 에 얼음 위에 놓습니다. Vector 에 시각화하기 위해 유충을 장착하는 데 사용됩니다. 찾을 수 있습니다 유 찾을 수 있습니다

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MARCMGFP3

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