기계적 세포 파괴, 용매 기반 지질 추출, 에스테르 교환 반응 및 정량 가스 크로마토 그래피를 사용하여 지방산의 식별에 기초하여 미세 조류의 지방산 함량 및 조성의 결정을위한 방법을 설명한다. tripentadecanoin 내부 표준 물질은 추출과 불완전 에스테르 교환시 가능한 손실을 보상하기 위해 사용된다.
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이 논문에서
요약
초록
미세 조류에 존재하는 전체 지방산의 함량 및 조성을 결정하는 방법을 설명한다. 지방산은 미세 조류 바이오 매스의 주성분이다. 이러한 지방산은 다른 아실 지질 클래스에 존재할 수있다. 그들은 연료 수송, 벌크 화학 물질, 기능 식품 (ω-3 지방산), 식품 상품의 제조에 이용 될 수 있기 때문에 특히 트리 아실 글리세롤 (TAG)에 존재하는 지방산, 상업적인 관심사이다. 상용 응용 프로그램을 개발하려면, 지방산 함량과 성분의 정량화를위한 신뢰할 수있는 분석 방법이 필요합니다. 미세 조류는 단단한 세포벽에 둘러싸여 하나의 세포입니다. 지방산 분석 방법은 모두 아실 지질 및 사용한 추출 조작은 모두 아실 지질 클래스를 추출 할 수 있어야 해방 충분한 세포 분열을 제공한다.
방법은 여기에 제시된으로 미세 조류에있는 모든 지방산은 척수 문제 또는 신경관 정확하고 재현성이 될 수 있습니다tified 그들의 사슬 길이, 불포화도 또는 지질 클래스가 속하는 무관 샘플 소량 (5 mg)을 사용하여 정량.
이 방법은 다른 지질 클래스의 상대적인 풍부함에 대한 정보를 제공하지 않지만, 서로 지질 클래스를 구분하기 위해 확장 될 수있다.
방법은 기계적 세포 파괴, 용매 기반 지질 추출, 지방산 메틸 에스테르 (장의 이미지)으로 지방산의 에스테르 교환 반응 및 정량 가스 크로마토 그래피 (GC-FID)를 사용하여 장의 이미지의 식별 시퀀스에 기초한다. TAG 내부 표준 (tripentadecanoin)는 추출과 불완전 에스테르 교환시 손실을 수정하기 전에 분석 절차에 추가됩니다.
서론
지방산은 미세 조류 바이오 매스의 주요 성분 중 하나이며, 일반적으로 세포 건조 중량 1-3 5~50% 사이에 만들 수 있습니다. 그들은 glycerolipids의 형태로 주로 존재한다. 차례로 이러한 glycerolipids는 주로 인지질, 당지질, 및 트리 아실 글리세롤 (TAG)로 구성되어 있습니다. 그들은 연료 수송, 벌크 화학 물질, 기능 식품 (ω-3 지방산), 및 음식 재화 3-6의 제조 자원으로 이용 될 수 있기 때문에 특히 TAG 존재 지방산은 상업적 관심이다. 미세 조류는 바다 수중 재배 미디어에서 성장할 수있는 육상 식물보다 훨씬 높은 면적 생산성을 가질 수 있으며, 어쩌면 해양, 농업에 적합하지 위치에 광 바이오 반응기에서 재배 할 수있다. 이러한 이유로, 미세 조류는 종종 바이오 디젤 및 기타 벌크 제품 3-6의 생산을위한 육상 식물에 유망한 대안으로 간주됩니다. 잠재적으로 더 농업 L 없습니다및 또는 신선한 물 (폐쇄 광 바이오 반응기하거나 재배 할 때 해양 미세 조류를 사용하는)가 자신의 생산을 위해 필요합니다. 따라서, 미세 조류 유래 바이오 연료는 제 3 세대 바이오 연료로 간주됩니다.
지방산 (건조 중량 %), 지질 수준의 조성물....
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프로토콜
1. 샘플 준비
1.1 및 1.2 단계로 준비가 포함 된 샘플에 대한 두 개의 다른 프로토콜이 있습니다. 두 가지 방법 모두 동일하게 적합하고 유사한 결과를 얻을 수 있지만, 조류 배양 볼륨을 제한 금액을 사용할 수있는 경우, 방법 1.1을 권장합니다.
참고 : 프로토콜 중 하나를 들어, 전체 프로토콜에 따라 두 개의 추가 비드 비터 튜브를 준비하지만 빈으로 사용할 수 있도록 그들에게 조류를 추가하지 않고. 이러한 방식으로, 사용되는 재료의 성분의 추출시에 얻어지는 GC 크로마토 그램의 피크가 식별되고 정량화 될 수있다.
1.1. 샘플 준비 프로토콜 옵션 1 : 추천하면 조류 문화의 제한된 양의 예약이 가능
- 브루어 등으로 설명 예를 들어, 배양액의 조류 건조 중량 농도 (g / L)를 확인합니다. 1.
- 5-10 mg의 조류 건조 중량이 포함되어 배양액의 볼륨을 전송유리 원심 관. 단계 1.1.1에서 결정된 바이오 매스 농도를 사용하여 전송 바이오 매스의 정확한 금액을 계산합니다.
- 1,200 X g에서 원심 분리기 5 분.
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결과
이 과정을 통해 얻어지는 전형적인 크로마토 그램은도 1에 도시된다. 장의 이미지가 사용 된 GC 컬럼 및 프로토콜에 의해 크기와 채도의 정도에 따라 구분됩니다. 짧은 사슬 길이의 지방산 등의 포화 지방산 (닫기 이중 결합)은 짧은 체류 시간이있다. 사용 GC 컬럼 및 프로토콜 지방산 이성질체 (동일 사슬 길이 및 포화도 있지만 이중 결합의 다른 위치)를 분리하고자하지 않지만, 이것은 다른 GC 컬럼 및 프로토콜을 사용하여 달성 될 수있다.
지방산 농도와 조성은 GC 피크 면적을 내부 표준 농도 (㎎ / L) (단계 2.1) 및 샘플 (MG)에 첨가 바이오 매스의 양 (단계 1.1.2 또는 1.2를 사용하여 계산 될 수있다. 6, 샘플 준비 프로토콜)가 선택되었다 따라하는.
바이오 매스의 각각의 지방산 (MG 지방산 / g 건조 중량)의 함량은 B를 구할 수있다 와이
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토론
한 방법은 콘텐츠를 결정할뿐만 아니라, 미세 조류 바이오 매스에서 본 전체 지방산의 조성하는데 사용될 수있다. 저장 (TAG)를 포함뿐만 아니라 세포막 지질 (인지질 및 당지질) 모든 지질 클래스에서 파생 된 지방산, 검출된다. 미세 조류에 존재하는 모든 포화 지방산 사슬 길이와 각도를 검출하고 구별 될 수있다. 방법은 기계적 세포 파괴, 용매 기반 지질 추출 장의 이미지에 지방산의 에스테르 교환 및 불꽃 이온화 검출기 (GC-FID)와 함께 가스 크로마토 그래피를 사용하여 장의 이미지의 정량화에 기초한다. 이 방법은, 시료 (5 mg)를 적은 양을 필요로 정확하고 재현성 및 미세 조류 종의 다양한 구비 사용될 수있다. 이 방법은 분석 목적을 위해 사용되는 것으로 의도되며 구체적으로 작은 샘플 크기를 사용 맞게 조정된다. 방법은 대규모의 추출에 업 스케일링 및 사용할 수 없습니다미세 조류 지방산의 양. 이 방법의 한계는 힘든이며이 결과를 획득하는 절차를 시작 몇 일이 걸릴 수 있다는 것입니다. 특히 산업용 미세 조류 지방산 생.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
이 작품의 일부는 재정적으로 과학 기술 - 전략적 기초 연구 (IWT-SBO) 프로젝트 햇빛과 생체 태양 전지에 의한 혁신의 추진 연구소에 의해 지원되었다. 에릭 과감하고 BackKim 구엔은 비드 박동 절차의 최적화에 기여에 대한 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| tripentadecanoin (C15:0 TAG) | Sigma Aldrich | T4257 | CAS 번호 7370-46-9 |
| 샘플에서 예상되는 모든 지방산의 TAG 또는 FAME 표준물 샘플에서 예상되는 | Sigma Aldrich | ||
| TAG 또는 FAME 표준물 샘플에서 예상되는 모든 지방산의 | Lipidox | ||
| TAG 또는 FAME 표준 | Larodan | ||
| Beadbeater | Bertin Technologies | Precellys 24 | |
| beadbeater tubes | MP Biomedicals | Lysing matrix E 116914500 | |
| GC-FID | Hewlett-Packer | HP6871 | |
| GC column | Supelco | Nukol 25357 | |
| Positive displacement pipette 100-1000μ l | Mettler Toledo | MR-1000 | |
| 용적형 피펫 팁 C-1000 | Mettler Toledo | C-1000 | |
| Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml | VWR | 612-1925 | |
| 유리관 | VWR | SCERE5100160011G1 | |
| 16 X 100 MM 붕규산 5.1 1 * 1.000 | VWR | SCERE5100160011G1 | |
| 테프론 코팅 나사 캡 | VWR | SCERKSSR15415BY10 | |
| STUART SCIENTIFIC SB2 시험관 회전기 | VWR | 445-2101 | |
| 가열 증발기/농축기 | Cole-Parmer | YO-28690-25 |
참고문헌
- Breuer, G., Lamers, P. P., Martens, D. E., Draaisma, R. B., Wijffels, R. H. The impact of nitrogen starvation on the dynamics of triacylglycerol accumulation in nine microalgae strains. Bioresource Technology. 124, 217-226 (2012).
- Hu, Q., Sommerfeld, M., et al.
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