우리는 살아있는 효모 세포에서 세포 내 해상도에서 미토콘드리아의 산화 환원 상태와 ATP 수준을 모니터링하기 위해, GFP를 기반으로하는 두 개의 비례, 유전자 인코딩 바이오 센서의 사용을 설명합니다.
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방법 논문
생활 효모 세포에서 미토콘드리아 산화 환원 상태와 ATP를 측정 비례 바이오 센서
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
미토콘드리아는 에너지 대사와 세포의 수명과 프로그램 된 세포의 죽음으로 제어하는 칼슘 항상성에서 많은 세포 과정에있는 역할을한다. 이러한 프로세스는 영향의 산화 환원 상태와 미토콘드리아 ATP 생산에 의해 영향을받습니다. 여기, 우리는 효모 세포를 생활에 세포 내 해상도에서 미토콘드리아의 산화 환원 상태와 ATP 수준을 감지 할 수있는 두 개의 비례, 유전자 인코딩 바이오 센서의 사용을 설명합니다. 미토콘드리아의 산화 환원 상태는 미토콘드리아의 매트릭스를 대상으로 산화 환원에 민감한 녹색 형광 단백질 (roGFP)를 사용하여 측정됩니다. 미토 roGFP 차례로 단백질의 여기 스펙트럼을 변경 가역 및 환경에 따라 산화와 환원을 거쳐 위치 147과 GFP의 204의 시스테인이 포함되어 있습니다. MitGO-ATeam은 F 오의 ε 소단위가 F 1-ATP 합성 효소를 사이에 끼워 넣으면되는 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 프로브는 기증자와 수용체 플루오을 무서워rescent 단백질. 을 가지고 단백질의 형태 변화 ε 소단위 결과로 ATP의 결합은 가까운 곳에서 기증자와 수용체를 무서워하고 기증자의 수용체에 형광 공명 에너지 전달을 허용합니다.
서론
미토콘드리아는 아미노산, 지방산, 헴, 철, 황 클러스터 및 피리 미딘의 ATP 생산 생합성에 필수적인 세포 소기관이다. 미토콘드리아는 칼슘 항상성에 중요한 역할을하고, 세포 사멸 조절합니다. 파킨슨 병, 알츠하이머 병, 루게릭 병, 헌팅턴의 질병 등 노화 및 노화 관련 질병에 미토콘드리아 1 증가 증거 링크 2. 개인이 자신의 전체 삶을 살 수 있지만 퇴행성 신경 질환과 관련된 미토콘드리아 단백질에 돌연변이가 질병의 증상은 생활에서 나중에 발생합니다. 이것은 변경이 등장하는 병리 질환을 허용 연령 미토콘드리아에서 발생 나타냅니다. 사실, 미토콘드리아 피트니스은 전체 세포의 건강과 수명 효모와 포유 동물 세포와 연관되어 있습니다. 여기서 3,4, 우리는 mitoc의 두 가지 중요한 기능을 평가하기 위해 유전자 인코딩, 비례 형광 바이오 센서를 사용하는 방법에 대해 설명합니다효모 세포를 살아있는 hondria : 산화 환원 상태와 ATP 수준.
유산소 에너지 동원 미토콘드리아의 기능이 제대로 설정됩니다. 미토콘드리아의 산화 환원 상태는 NAD + / NADH, FAD / FADH 2, NADP + / NADPH, 글루타티온 ....
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프로토콜
1. 바이오 센서와 효모 세포의 변화
- 리튬 아세테이트 방법 27을 사용하여 플라스미드 베어링 미토 roGFP 또는 mitGO-ATeam2하여 원하는 효모 균주를 변환 할 수 있습니다.
- 플라스미드 매개 바이오 센서와 변환을 확인하고 플라스미드의 손실을 방지하기 위해 선택하고 적절한 선택적 합성 완전 배지 (미토 roGFP을위한 SC-우라, 또는 mitGo-ATeam2을위한 SC-레우)에 형질 전환을 유지한다. 형광 프로브가 여기에서 설명한 것보다 다른 플라스미드에 클로닝 된 경우, 적절한 선택 배지를 사용합니다. 그들은 형광 바이오 센서를 표현할 수 있는지 확인하고 정상 미토콘드리아 형태를 전시하는 형광 현미경에 의해 형질 전환을 시각화.
2. 이미징을위한 세포 및 준비의 성장
세포의 기능 및 약물 치료에 대한 반응은 세포 밀도와 대사 활동에 크게 의존하고 있습니다. 최상의 결과를 얻을 때 세포적극적으로 (- 1 × 10 7 세포 / ML 중반 로그 단계 ~ 0.5) 분할됩니다. 일관된 밀도의 중간 로그 상 문화를 생성하는 가장 신뢰할 수있는 방법은 고정 된 상 사전 문화에서 접종하는 것입니다.
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결과
미토 roGFP와 미토콘드리아의 산화 환원 상태를 측정
여기, 우리는 미토 roGFP1 효모 세포의 성장 또는 미토콘드리아의 형태에 영향을주지 않고, 효모 살아있는 세포에서 감소하는 완전 산화에서 미토콘드리아의 산화 환원 상태의 변화를 감지하는 동적 범위를 가지고 것을 보여줍니다. 첫째, 우리는 미토콘드리아 대상 GFP 및 roGFP1을 표현하는 세포가 정상 요금 (그림 1A)에서 성장 찾을 수 있습니다. 로 로그 위상 성장과 최대의 성장 속도에 도달하는 시간 동안 성장 곡선의 최대 기울기에 의해 측정 된 최대 성장률, 미토 GFP 및 미토 roGFP1을 표현 세포에서 유사하다. 또한, 미토 roGFP1 전시 야생형 형태 (그림 1B)를 표현하는 효모 미토콘드리아. 특히, 그들은 관이며, 어머니 봉오리 축을 따라 정렬하고 어머니와 딸 세포의 끝에서 축적. 미토콘드리아 기능 장애는 종종 분열을 유도하기 때문에,이 일반적인 .......
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토론
여기, 우리는 효모 세포를 생활에 미토콘드리아 산화 환원 상태와 ATP 수준을 평가하기 위해 바이오 센서로 미토 roGFP1 및 mitGO - ATeam2를 사용하는 방법을 설명합니다. 우리는 양적 미토콘드리아의 형태 또는 배포 또는 세포 성장 속도에 대한 명백한 효과없이, 미토콘드리아에 표적의 플라스미드 매개 미토 roGFP1 또는 mitGO-ATeam 결과의 표현을 찾을 수 있습니다. 3 미토 roGFP1 매우에서 미토콘드리아 산화 환원 상태의 변화를 감지 할 수 있습니다 매우 감소 상태로 산화. 마찬가지로, mitGO-ATeam는 호흡 억제제로 치료 호흡 중심의 성장과 효모를 겪고 효모에서 발생하는 미토콘드리아의 ATP 농도의 변화를 측정 할 수 있습니다. 두 바이오 센서는 세포 내 해상도를 제공하고 있기 때문에 또한, 그들은 산화 환원 상태 또는 개별 세포 내 미토콘드리아의 ATP 수준의 이질성을 감지 할 수 있습니다. 두 바이오 센서는 비례 프로브이기 때문에 마지막으로, 그들은 샘플의 두께 나 병의.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 HHMI 56,006,760에서 (GM45735, JDV, DMAW에 국립 보건원 (NIH) (2 TL1 RR 24158-6)와 엘리슨 의료 재단 (AG-SS-2465)와 NIH에서 수상에 의해 지원되었다 GM45735S1 및 GM096445) LP합니다. GM45735S1는 미국의 복구 및 2009 년 재투자 법 아래에있는 NIH에서 발행되었다. 이 연구에 사용 된 현미경은 NIH / NCI 부여 (5 P30 CA13696)를 통해 부분적으로 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 1397-94-0 | 2 mg/ml 원액에 에탄올에 용해. |
| SGlyc(합성 글리세롤 기반) 효모 성장 배지 *SGlyc-Ura 생략 **SGlyc-Leu | 생략 H2O에 용해 NaHCO3로 pH를 5.5로 조정합니다. Autoclave. 성분: 0.67% 아미노산이 없는 효모 질소 염기 3% 글리세롤 0.05% 포도당 2 mg/ml 아데닌 2 mg/ml 우라실* 1 mg/ml L-아르기닌 1 mg/ml L-히스티딘 1 mg/ml L-류신** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-메티오닌 4 mg/ml L-페닐알라닌 2 mg/ml L-트립토판 3 mg/ml L-티로신 | ||
| SC (합성 완성, 포도당 기반) 효모 성장 배지 *SGlyc-Ura 생략 **SGlyc-Leu | H2O에 용해 NaHCO3로 pH를 5.5로 조정합니다. 오토 클레이 브. ><성분 : < / em> 0.67 % 아미노산이없는 효모 질소 염기 3 % 포도당 < / > 2 mg / ml 아데닌 < br / > 2 mg / ml 우라실 * < > 1 mg / ml L- 아르기닌 < br / > 1 mg / ml L- 히스티딘 1 mg / ml L- 류신 ** 3 mg / ml L- 라이신 < > 2 mg / ml L- 메티오닌 4 mg/ml L-페닐알라닌 2 mg/ml L-트립토판 3 mg/ml L-티로신 | ||
| 발랍 | 성분을 1:1:1 (w:w:w) 비율로 섞습니다. 70 °에 담궈서 녹습니다. C H2O bath. 유리 페트리 접시에 분취하십시오. 실온에서 보관하십시오. 성분: 바셀린 바셀린 바셀린, 하드 파라핀, 라놀린 | ||
| 장비 및 소프트웨어 | |||
| Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides | Thomas Scientific (Swedesboro, NJ) | 3050 | 크기: 25 x 75 mm; 두께: 0.93 - 1.05 mm |
| 고성능 커버슬립, No. 1.5, 18x18 mm | Zeiss (Thornwood, NY) | 474030-9000-000 | 이들은 두께가 덜 가변적입니다 (170± 5 &뮤; m) 표준 커버슬립보다 구형 수차를 줄이고 3D 이미징 성능을 향상시킵니다 |
| Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5 | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) | 12-545E | 크기: 22 x 22 mm, No. 1.5 두께 (170 μ m) |
| 스펙트럼 검출기 및 100x/1.49 NA Apo-TIRF 대물 | Nikon(Melville, NY) | ||
| 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar 대물렌즈(Zeiss) 및 Orca ER 냉각 CCD 카메라(Hamamatsu)가 장착되고 Axiovision 소프트웨어 Zeiss(Thornwood, NY)로 제어되는 AxioObserver.Z1 현미경 | ; 하마마츠 (일본 하마마츠시) | ||
| Volocity 3D 이미지 분석 소프트웨어 | Perkin Elmer (Waltham, MA) | 디콘볼루션을 위한 복원 모듈; 비율 계산 및 측정을 위한 정량 분석 모듈 | |
| ImageJ 소프트웨어 | National Institutes of Health(Bethesda, MD) | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
참고문헌
- Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6),....
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재인쇄 및 허가
