우리는 배아 C. 대규모 문화 여기 수정 된 프로토콜을 설명 세포 엘레 간스. 배아 C. 엘레이 방법을 사용하여 시험 관내에서 배양 된 세포는, 셀 특정 방식으로 유전자 발현을 차별화하고 다시 요약 나타난다. 직접 셀에 접속하거나, 다른 조직으로부터 특정 세포 유형의 분리를 요구 C. 기법에 적용될 수있다 배양 된 세포 엘레 간스.
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이 논문에서
요약
초록
C. elegans의 유전 및 분자 기술에 쉽게 적용되는 강력한 모델 시스템이다. 최근까지, 비록 세포와 특정 세포 유형의 분리에 대한 직접 액세스를 요구하는 기술은, C.에 적용 할 수 없었다 엘레. 이 제한은 조직이 쉽게 효소 및 / 또는 세제로 처리하여 분해되지 않은 가압 표피 내에 국한된다는 사실 때문이었다. 레어드 꽃, 크리스텐슨과 1 C.을 배양하기위한 강력한 방법을 개발 동료에 의해 초기 개척자의 작업을 바탕으로 큰 규모의 배아 세포 엘레 간스. 계란은 표백제 / NaOH로 처리하여 임신하는 성인에서 분리하고 이후에 달걀 껍질을 제거하는 키틴으로 처리됩니다. 배아 세포는 다음 수동 피펫에 의해 해리와 혈청 풍부한 미디어 기판 덮인 유리에 도금되어있다. 아이솔레이션 셀 24 시간 이내에 형태를 변화시킴으로써 세포를 발현하는 특정 마르크 의해 구별하기 시작할RS. C. 엘레이 방법을 사용하여 배양 된 세포는 체외에서 2 주까지 생존 및 전기 생리학, 면역에 사용 된, 그들은 정렬 및 마이크로 어레이 프로파일에 사용 된 같은 영상도 분석한다.
서론
예쁜 꼬마 선충 (C. elegans의)는 세포 기능 분화 및 동작의 분자 기초를 조사하기위한 강력한 모델 생물이다. 게놈, 신진 대사와 생합성 경로는 척추 동물과 유사하지만, 유전 및 분자 온순함 2 훨씬 크다. 장점 중의 크기와 간단한 해부학, 급속한 수명주기 (25 ° C에서의 3 일), 짧은 수명 (2 개월)과 자손의 많은 수 (> 200)이다. 그것의 자웅 동체 자연과 짧은 수명주기에, 분자 및 유전자 조작은 C로 간단합니다 형질 전환 동물 3,4와 같은 RNA 간섭과 같은 5 유전자 녹다운 기술의 애플리케이션의 생성 등의 elegans. C. 엘레 몸 껍질은 투명합니다. 따라서 세포는 쉽게 성인 및 표준 현미경을 사용하여 난자에 시각화 될 수있다. 지난 40 년 동안, C. 엘레 커뮤니티 C.를위한 귀중한 자원을 만들었습니다 돌연변이, 녹아웃 및 형질 전환의 큰 컬렉션, 신경계 (8)의 전체 복원 등의 해부학과 개발 6,7에 대한 자세한 설명, 잘 주석과 공동체 전체에 사용할 수있는 완전히 시퀀스 게놈 (포함 엘레 조사
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프로토콜
크리스텐슨 등과 비교하여 별표 (*)는 신규 또는 수정 된 단계를 나타냅니다. 1
1. 재질 설정
- 세포 배양 과정은 임신하는 인원수로부터 격리 계란 대량을 요구한다. C. 성장한다 계란의 대량 분리하는 박테리아 - 엘레 8P 한천 플레이트에 NA22 (CGC C. elegans의 유전 컨소시엄을 통해 사용 가능)과 시드. 이 판에 사용 펩톤의 양은 일반적으로 NGM 플레이트에 사용되는 8 배의 양입니다. 높은 펩톤 농도 OP50가-두꺼운 층 성장에 반대되는,보다 효율적 NA22 박테리아의 성장을 유지한다.
8P 접시 조리법 :
3g 염화나트륨, 20g 박토 - 펩톤, 30 분간 멸균 및 오토 클레이브의 1 L에 25g의 한천을 녹인다. 55 ° C에서 매체의 열이 식도록 한 후 1 ㎖ 1 MgCl2를 콜레스테롤의 멸균 여과 1 ㎖ (EtOH를 5 ㎎ / ㎖)을 추가,, 망초 1 ㎖ 및 KP 버퍼 (500 ㎖의 재고 : 5g의 K 2 HPO 4,
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결과
C. 배양 세포가 특정 마커를 차별화하고 표현 세포 엘레
크리스텐슨과 트리 판 블루 염색법을 사용하여 동료는 것을 보여 주었다 배아 C.의> 99 % 엘레 세포는 분리 절차를 생존. 9 일 도금 후 22에서 각각 85 %와 65 %는 여전히 1 살아있다. 고립 된 배아 C. 엘레 세포 분화하기 위하여 기판에 부착한다. 양식 대단히 짧은 시간을 준수하는 데 실패하고 그들이 살아 있는지 명확하지 않다 세포. 세포의 분화 도금 후 2 ~ 3 시간을 시작 ~ 24 시간 동안 계속된다. 24 시간 내, 세포는 특정 형태학에 걸릴. 따라서, 신경이 과정 1,18-20을 보내, 근육 세포는 루멘 (17)을 형성 생체 내 1, 운하 세포에서 볼 수있는 것과 비슷한 손가락 같은 긴 구조를.......
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토론
C. elegans의 개발, 행동과 노화에 관련된 유전자 경로를 해독하기위한 강력한 모델 생물이다. 그것의 편익은 주로이 유전자 조작 할 수있는 용이성에서와 짧은 수명주기에서 유래한다. 의 편의에도 불구하고, C. 엘레는 한계가있다. C.를 엘레 세포는 작은 그러한 마이크로 어레이 분석에 의해 유전자 발현 프로파일과 직접적인 같은 전기 생리학 및 약리학 기술 등 셀에 대한 액세스, 또는 특정 세포 유형의 분리를 요구하는 방법의 적용을 제한하는 가압 표피 내에 갇혀있다. C. elegans의 세포 배양 방법은 본 모델 생물의 많은 한계에 대한 해결책이다.
이 논문에서 우리는 배아 C.를 분리 및 배양에 대한 업데이트 방법을 설명 엘레 대규모의 세포는 크리에 의해 초기 작품을 기반으로 동료 1. 우리 ALSO C.의 생리 학적 과정과 유전 적 요구 .......
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| Bacto 펩톤 | VWR International Inc. | 90000-382 | |
| Difco 한천 과립 | VWR International Inc. | 90000-784 | |
| Bacto 트립톤 | VWR International Inc. | 90000-284 | |
| Bacto 효모 추출물 | VWR International Inc. | 90000-724 | |
| Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid | Invitrogen | 11415-064 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16140-063 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 시그마 | P4333-100ML | |
| 스트렙토마이세스 Griseus | 시그마 | C6137-25UN | |
| NA22 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | ||
| Peanut Lectin | Sigma | L0881-10MG | |
| Sucrose | Sigma | 57903-1KG | |
| D-(+)Glucose | Sigma | 67528-1KG | |
| Ethylene glycol-bis (2-amin– 틸에테르), N,N,N',N'- 사산(EGTA) | 시그마 | E0396-25G | |
| 헤페스 | 시그마 | H3375-500G | |
| 콜레스테롤 | |||
| NaCl | 시그마 | 57653-1KG | |
| KCl | 시그마 | P9333-500G | |
| CaCl2 | Sigma | C1016-500G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| MgSO><4 | Sigma | M2643-500 g | |
| K2HPO4 | Sigma | P2222-500G | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791-500G | |
| NaOH | 시그마 | S8045-500G | |
| KOH | Sigma | P1767-500G | |
| 에탄올 | |||
| 고압증기멸균 증류 H2O | |||
| Bleach | |||
| EQUIPMENT | |||
| 101-1000 μ l 블루 그래디에이티드 피펫 팁 | USA Scentific | 1111-2821 | |
| 10 ml 멸균 피펫 개별 포장 | USA Scentific | 1071-0810 | |
| Ergonomic Variable Volume (100-1000 μ l) 팁 이젝터가 있는 피펫터 | VWR International Inc. | 89079-974 | |
| 휴대용 피펫 에이드, Drummond | VWR International Inc. | 53498-103 | |
| 전송 플라스틱 피펫 멸균 | VWR International Inc. | 14670-114 | |
| 15ml 원뿔형 튜브 | 미국 Scentific | 1475-1611 | |
| 50ml 원뿔형 튜브 | USA Scentific | 1500-1811 | |
| 멸균 18 게이지 바늘 | Becton, Dickinson and Co. | ||
| 멸균 10ml 주사기 | Becton, Dickinson and Co. | ||
| 플라스틱 주사기 필터 Corning 0,20 μ m 기공 크기 | Corning | 431224 | |
| Acrodic 25mm 주사기 필터 w/5 μ m versapor 멤브레인 | VWR International Inc. | 28144-095 | |
| 60x15mm 페트리 접시 멸균 | VWR International Inc. | 82050-548 | |
| 100x15mm 페트리 접시 멸균 | VWR International Inc. | 82050-912 | |
| 12mm 직경 유리 커버 슬립 | VWR International Inc. | 48300-560 | |
| 투명 세포 배양 플레이트, 24웰 플랫 바닥(뚜껑 포함 | Thomas Scientific | 6902A09 | |
| Dumont #5- 미세 집게 | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 022629883 | |
| Laminar Flow Hood | |||
| 도립 현미경(x10 대물렌즈 | |||
| 주변 공기 가습 인큐베이터 |
참고문헌
- Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
- Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D.
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재인쇄 및 허가
