방법 논문

제브라 피쉬의 선천성 면역 건강의 지표로 호흡 버스트 응답의 정량화

DOI:

10.3791/50667

⸱

2013년 9월 12일

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine

이 논문에서

요약

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선천성 면역 반응은 병원체의 감염에 대한 유기체를 보호합니다. 타고난 면역 반응의 중요한 구성 요소, 식세포 호흡 버스트, 침입 미생물을 죽이는 활성 산소를 생성한다. 우리는 타고난 면역 반응이 화학적으로 유도 될 때 생성 된 활성 산소 종을 정량화 호흡 버스트 분석에 대해 설명합니다.

초록

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식세포 호흡기 버스트는 병원균 감염에 대한 선천성 면역 반응의 일부이며, 반응성 산소 종 (ROS)의 생성을 포함한다. ROS는 독성이 phagocytized 미생물을 죽이는 기능을한다. 식세포 유래 ROS의 생체 정량화 강력한 타고난 면역 반응을 탑재 할 수있는 유기체의 능력에 관한 정보를 제공합니다. 여기서 우리는 식세포 호흡 버스트의 화학 유도에 전체 제브라 피쉬 배아에 ROS의 양을 비교하는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 활성 산소에 의한 산화에 따라 형광이되는 비 형광 화합물을 사용한다. 개인 제브라 피쉬 배아는 마이크로 플레이트의 웰에 피펫과 호흡 버스트의 화학 유도 유무에 관계없이이 형광 기판에서 배양된다. 각 웰의 형광 마이크로 플레이트 리더를 이용하여 원하는 시점에서 정량화한다. 형광 판독이 배경 형광을 제거하도록 조절하고 공동 아르짝 t-검정을 사용하여 mpared. 이 방법은 서로 다른 발달 단계에와 단백질의 최저, 과발현 또는되는 약물과 치료로 실험 조작에 대한 응답에있는 제브라 피쉬 배아의 호흡 버스트 잠재력의 비교를 할 수 있습니다. 이 방법은 또한 어른 지브라 피쉬의 신장 및 다른 어류로부터 해부 전체 신장 또는 세포 제제의 호흡 버스트 응답을 모니터링하기 위해 사용될 수있다. 우리는이 프로토콜의 상대적 단순성과 적응성이 기존의 프로토콜을 보완하고 더 나은 타고난 면역 반응을 이해하고자 연구에 관심이있을 것이라고 믿는다.

서론

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타고난 및 적응 면역 : 면역 시스템은 두 가지로 구성되어 있습니다. 선천성 면역은 진화 적으로 적응 면역보다 더 고대합니다. 척추 동물은 모두 타고난 및 적응 가지를 가지고 반면, 무척추 동물은 현재 만 선천성 면역을 것으로 생각됩니다. 적응 면역은 특정 병원체에 대한 구체적이고 오래 지속되는 면역을 부여하면서, 선천성 면역은 침입 한 세균, 바이러스, 곰팡이에 즉각적인 반응이다. 타고난 면역 반응의 중요한 측면은 외국 침략자를 침몰하고 파괴하는 식세포 (예를 들어, 대 식세포, 호중구)의 염증과 모집 결과 사이토 카인과 케모카인의 방출을, 포함한다.

성공적인 선천성 면역 반응은 포함 : 침입하는 미생물의 (1) 인식, 적절한 신호 폭포 (사이토 카인과 케모카인의 예를 들어 릴리스)의 것 (2) 유도, 식세포의 (3) 적절한 개발 / 적절한 번호, (4) 감염의 사이트에 식세포의 이동, 병원균 (5) 말림, 그리고 가득 채우고 미생물 (6) 파괴. 다음 단계 중 하나의 결핍에 의해 압도되는 호스트로 이어질하고, 감염에 굴복 할 수 있습니다. 이 모든 식물과 동물의 병원균에 대한 방어의 첫 번째 라인 때문에 강력한 선천성 면역 반응은 생명체의 건강에 매우 중요합니다. 척추 동물에서, 또한 적응 면역 반응 <....

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프로토콜

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1. 제브라 피쉬의 관리 및 유지 보수

  1. 축산 질량 스폰 성인 제브라 피쉬는 이전에 13을 설명했다. 이전 14 기술로 만들어지는 배아를 수집합니다.
  2. 미세 주입은 (원하는 경우) : 같은 유전자 제품을 과다 발현하는 유전자의 제품의 mRNA를 넉다운하는 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드와 Microinject 1-4 세포 단계의 제브라 피쉬 배아 이전 15 설명했다.
    1. 모의의 적절한 풀을 유지 컨트롤을 주입 (최소 48 생활, 모의 실험적으로 조작 물고기는 96 웰 마이크로 플레이트를 채우기 위해 필요한 제어 물고기 48 생활을 주입).
  3. 배아를 유지 : 달걀 물에 28 ° C에서 깊은 배양 접시에있는 배아를 성장 원하는 발달 단계 (호흡 버스트 응답이 제브라 피쉬 배아에이 프로토콜을 사용하여 검출되지 때까지 (60 ㎍ / ㎖의 인스턴트 오션 바다 소금 물을 멸균 증류수) 젊은 2 일 이상)이 수정 (12)을 배치한다. 참고 :이 O를하고있다1 - 페닐 -2 - 티오 우레아 (PTU) 또는 golden/slc24a5 돌연변이 제브라 피쉬의 사용 중 하나를 통해 제브라 피쉬 배아에 색소 침착을 방지하는 것은 상당히 ....

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결과

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여기에, 우리는 48에서 제브라 피쉬 배아에서 호흡 버스트 응답 (야생 형, AB 배경을) 비교 데이터를 72 시간 포스트 수정 (HPF)를 제공합니다. 우리의 통제 그룹과 우리의 실험 그룹과 72 HPF 배아로 행동 48 HPF의 배아. 사용 된 표본의 크기는 24 유엔에 의한 배아 발달 단계 당 24 PMA에 의한 배아했다. (상대 형광 단위 (RFU)에서) 천연 형광 판독 값을 4 시간 PMA의 첨가 후 마이크로 플레이트를 판독함으로써 얻어졌다. 천연 형광 값은 표 1에 제공된다. 원시 형광 값은 한 72 HPF의 배아를 제외하고 (: 48 HPF = 758 RFU, 72 HPF = 230 RFU 수단)으로, 72 HPF 유엔에 의한 배아보다 48 HPF 유엔에 의한 배아에서 지속적으로 높았다. 이 두 샘플 내의 변동성 (표준 편차 : 48 HPF = 549 RFU ± 72 HPF = 513 RFU ±) 거의 동일했지만, 72 HPF 그룹은 평균 (표준 deviatio에 대한 더 많은 변화n.......

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토론

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식세포의 기본 기능은 병원균을 감지 침몰하고 파괴하는 것입니다. 적절한 호흡 버스트를 생성하는 식세포의 능력은이 기능을 위해 중요하다. 따라서, 호흡 버스트 응답의 정량화는 개인 및 / 또는 실험 조작에 대한 응답의 그룹 사이에 일반적으로 선천성 면역의 건강과 기능의 비교를 할 수 있도록 한 방법입니다. 여기서 우리는, 유도의 양, 개인 제브라 피쉬 배아의 그룹 간의 호흡 버스트 반응을 비교하는 프로토콜을 설명합니다. 요컨대, PMA는 효소 NADPH 옥시 다제에 의한 ROS의 생산을 초래한다. 이러한 ROS는 비 형광 염료에 작용 및 형광 화합물을 형성하도록 산화. 마이크로 플레이트 리더 각 웰에 상대적인 형광을 검출하기 위해 사용된다. PMA 유도에 생성 된 형광은 호흡 버스트 잠재력과 제브라 피쉬 배아의 일반적인 선천성 면역 건강의 지표입니다. fluores의 정규화 수준의 비교짝 t-검정을 사용하여 PMA 유도 군간 cence는 제브라 피쉬의 그룹 사이 호흡기 버스트 전위에 상당한 차이가 있는지를 결정하는데 사용될 수있.......

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공개 사항

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저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

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저자는 김 실험실, 도움이 토론과 데이터 공유를위한 제브라 피쉬의 관리 및 유지 보수, 로버트 윌러에 대한 마크 NILAN의 과거와 현재 회원을 인정, 그리고 NIH 보조금 3RO1GM087308-02S1과 1P20RR024475-01A2와 메인 농업 및 산림 것 자금 역 (공개 번호 3303)를 실험.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
인스턴트 오션 바다 소금인스턴트 오션SS15-10
H2DCFDA시그마 알드리치35845-1G
PMA피셔BP6851
DMSO시그마 알드리치D2438-5X10ML
트리카인 S MS222웨스턴 케미컬100그램
DMEM/F-12, 페놀 레드 라이프 테크놀로지스 없음11039-021
딥 페트리 접시VWR89107-632
플라스틱 이송 피펫Fisher13-711-7M
#5 Dumont 집게전자 현미경 과학72700-D
1.7ml 마이크로 원심분리기 튜브Axygen10011-724
15ml 원추형 원심분리기 튜브VWR21008-918
5 ml 혈청학 피펫Greiner Bio One606180
Synergy 2 다중 모드 마이크로플레이트 리더BioTekContact BioTek
Black 96 웰 마이크로플레이트VWR82050-728
25 ml 멸균 저장조VistaLab3054-2003
P200 피펫터GilsonF123601
멀티채널 피펫터VWR89079-948
피펫 팁VWR89079-478

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Medzhitov, R., Janeway, C. A. Jr Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response. Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).
  2. Lam, S. H., Chua, H. L., et al. Development and Maturation of the....

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