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방법 논문

유기 용매를 사용하지 않고 트리클로산의 효과 : RBL-2H3 비만 세포 탈과립에 화학 효과를 평가하는 마이크로 분석 실험

39.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50671

⸱

2013년 11월 1일

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Biomedical Sciences, University of Maine, Orono, 2Graduate School of Biomedical Sciences and Engineering, University of Maine, Orono

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

비만 세포의 탈과립, 알레르기 중재자의 릴리스는, 알레르기, 천식, 및 기생충 방어에 중요합니다. 여기에 우리가 탈과립에 대한 약물 및 독성 물질의 영향을 평가하기위한 방법 1을 보여, 방법론은 최근 항균제 트리클로산 2의 강력한 억제 효과를 나타낸다 활용.

초록

비만 세포는 알레르기 질환과 기생충에 대한 면역 방어에 중요한 역할을한다. 일단 (알레르겐에 의해 예) 활성화, 그들은 degranulate, 프로세스가 알레르기 중재자의 exocytosis에 결과. 약물 및 독성 물질에 의한 비만 세포의 탈과립의 변조는 인간의 건강에 긍정적 또는 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. 비만 세포 기능은 쥐 염기성 백혈병 비만 세포의 사용 (RBL-2H3), 3-5 인간의 점막 비만 세포의 널리 사용되는 모델을 자세히 해부하고있다. 6 마스트 세포에서 히스타민과 협력하여 선형 출시 비만 세포 과립 구성 요소와 알레르기 중재자 β-헥 소사 미나는, 쉽게 신뢰성에 대한 의무가 마이크로 분석에서 측정 형광 강도를 산출, 형광 기질과의 반응을 통해 측정 할 수있다 높은 처리량 연구 1. 원래이 NaAl 등 1.에 의해 게시, 우리는 검사 O이 탈과립 분석을 적응F 약물 및 독성 물질과 여기에서의 사용을 보여줍니다.

트리클로산은 많은 소비자 제품에 존재하며이 효과에 대한 메커니즘은 알 수 있지만, 인간의 알레르기 성 피부 질환 7-11 치료 도움이 될 발견되었습니다 광범위한 스펙트럼 항균 에이전트입니다. 여기에서 우리는 비만 세포 탈과립에 트리클로산의 효과에 대한 분석을 보여줍니다. 우리는 최근 트리클로산 강하게 비만 세포의 기능이 영향을 미치는 것으로 나타났다. 유기 용매의 사용을 방지하기위한 노력의 일환으로, 트리클로산은 열 교반 수성 버퍼에 직접 용해되고, 결과 농도는 12 (ε 280 = 4,200 L / M / ㎠ 사용) UV-VIS 분광 광도계를 사용하여 확인됩니다. 이 프로토콜은, 더 넓게 자신의 알레르기 가능성을 비만 세포 탈과립에 미치는 영향을 결정하기 위해 다양한 화학 물질과 함께 사용할 수있는 잠재력을 가지고 있으며,.

서론

비만 세포는 높은 천식의 주요 매개체 역할을 면역 효과기 세포, 알레르기, 기생충 방어 및 발암 13-16 알갱이 있습니다. degranulate을 활성화 때까지 안전하게 세포질 과립에 알레르기와 염증 매개을 저장할 위치를 그들은 거의 모든 혈관 조직 15에 있습니다. 탈과립은 히스타민, tryptase 및 류코트리엔 15와 같은 약리학 적 활성 중재자의 릴리스에서 결과 막 바인딩 된 과립의 exocytosis에 있습니다. 유형의 시작이 처리 결과 I 기생충에 대한 방어를 장착뿐만 아니라 알레르기 천식 및 발암 응답하기 15 시작의 중요한 과민 반응.

비만 세포와 호염기구는 FcεRI 수용체 면역 글로불린 E (IgE에) 17의 높은 친화력 수용체를 표현한다. 알레르겐 또는 항원에 노출 여러 IgE에 결합 FcεRI 수용체 17의 집계를 발생하고,이 s의티로신 인산화 이벤트, 내부 상점에서 포스 C, 칼슘 유출의 활성화 및 세포 18에 칼슘의 유입의 폭포 : 탈과립 프로세스를 시작 IgE에 결합 구단 수용체의 "가교"오 -라고. 이 칼슘 유입 탈과립을 위해 필요하며, 더욱, 과립 exocytosis에 15을 초래하기 전에 막으로 과립 융합을 알립니다. 실험적으로, 칼슘 이온 운반체 상류되거나 하류로 독성 물질에 의해 경로 대상의 식별을 허용, 직접 기본적으로 모든 신호 전달은 칼슘 유입 20 단계 이전 단계를 거치지 세포막을 19 일에 걸쳐 셔틀 버스 칼슘을 사용할 수 있습니다 칼슘은 20 신호.

탈과립은 히스타민 6 함께 과립에서 선형 적으로 해제 세포의 상층 액을,에 β-헥 소사 미나의 방출을 모니터링하여 신속하고 효율적으로 측정 할 수 있지만 난의 훨씬 쉽게 분석 형광 제품에 대한 간단한 효소 기질 반응 및 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 감지합니다. 같은 프로토콜 절에 자세히 설명이 마이크로 분석은에 의해 β-형광 기판의 절단 4 methylumbelliferyl-N-아세틸-β-D-glucosaminide을 정량화 원래이 NaAl 등에 의해 개발. 강력한 방법 1을 기반으로합니다 헥 소사 미나. 트리클로산은 여기에서 강조와 함께 우리는 약물과 독성 물질의 테스트 효과 분석을 수정했습니다. 이 방법은 신뢰성 탈과립을 정량화 예를 들어, 유세포 기반의 탐지 방법 21에 저렴한 대안입니다, 안티 - 알레르기 약물의 다양한 높은 처리량 검사에 잘 자신을 빌려 잠재력을 가지고뿐만 아니라, immunotoxic 또는 극성 물질. 이 마지막 점은 21 세기 2007 년 국립 연구위원회 보고서 "독성 시험에 비추어 특히 중요하다 : 비전과 스트랫EGY "( http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=11970 는 마우스와 같은 전통적인 실험 동물의 비용 사용을 줄이기 위해 세포 배양을 활용 높은 처리량 독성 시험의 개발을지지한다). 이 NaAl 등 1.가 개발하고 우리 2로 수정 탈과립 프로토콜은, 상동 인간의 점막 비만 세포 나 호염기구에 3-5 잘 받아 들여진 모델 RBL-2H3 세포 라인을 사용합니다. (배양 RBL-2H3 세포에 대한 방법은 허친슨 등에 자세히 설명되어 있습니다. 22). 이 분석 가능성이 장착 된 비만 세포 유형에 적용 할 수 있습니다.

트리클로산 (TCS)는 병원, 개인 배려 제품, 소비자 제품 23,24에서 30 년 이상 사용되어왔다 광범위한 스펙트럼 항균이다. TCS의 항균 특성에 대한 행동의 모드는 억제 enoyl-아실 의한 것으로, 지방산 생합성의 억제입니다운반 단백질 환원 25,26. 이 같은 샤워 젤, 핸드 로션, 치약, 양치질, 0.3 % 또는 10 mM의 최대 24 농도에서 손을 비누와 같이 가전 제품의 넓은 범위에서 세계적으로 발견된다. TCS의 대폭적인 사용은 인간 27-29의 강과 하천 (30)에 검출 수준 귀착되었다. Allmyr 등에 의해 수행 연구. 27 TCS와 그 대사 산물이 혈장과 모유로 기르는 어머니의 우유 모두에 존재하는 것을 보여 주었다. 중요한 것은, TCS는 쉽게 피부에 31-37로 흡수된다. Queckenberg 등. 37 비만 세포가있는 피부에 상당한 농도의 결과, 12 시간 이내에 인간의 피부에 ~ 70 밀리미터 TCS 크림 ~ 10 %의 흡수를 발견했다.

TCS는 인간의 알레르기 성 피부 질환 7-11을 관리하기 위해 임상 적으로 표시되었지만, TCS는 알레르기 성 피부 질환을 완화하는 메커니즘은 38 알 수있다. 형광 마이크로 플레이트 분석 detaile를 사용하여D는이 비디오에서 우리는 최근에 2 μM의 낮은 농도 TCS는 크게 이러한 임상 데이터 2에 대한 잠재적 인 설명을 제공하는 비만 세포 기능과 탈과립을 꺾는 것을 보여 주었다. 이러한 임상 데이터에 대한 설명을 제공 할뿐만 아니라, 파머 등 우리의 연구 결과는. 2 TCS 칼슘 유입의 하류 신호 분자 표적으로하는 것이 좋습니다. 많은 면역 및 기타 생물 학적 과정에 신호 칼슘의 중요성으로 인해, TCS는 잠재적으로 필요한 생물 학적 과정의 다양한에 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. 사실, Udoji 등. 39 TCS는 또 다른 중요한 타고난 면역 기능, 인간의 자연 살해 세포의 세포 용해 활성을 억제 것으로 나타났다.

알레르기 성 피부 질환 (또는, 반대로, immunotoxicant 등)의 치료 원조로의 잠재력을 넘어, TCS는 장애 물질 40-49 내분비 할 수 있습니다. 따라서, 용액이 화학 물질을 준비하는 방법에 대한 명확한 절차 I독성 학자의 관심의. TCS는 작은 소수성 분자이기 때문에, 유기 차량은 종종 물에 용해성하기 위해 사용됩니다. TCS가 테스트되었습니다 가장 독성 연구에서, 준비는 에탄올, 아세톤 또는 석유 2,50,51 등의 유기 용매의 도움으로 물에 용해를 포함하고있다. 그러나 종종 이러한 용매 번하여 테스트 화학 물질 데이터를 51의 해석을 복잡하게, 자신 생물학적으로 활성 상태입니다. 사실, Rufli 등에 따라. 52 등 53, 그것은 수생 독성 실험을위한 테스트 솔루션은 독성 아티팩트를 생성하는 화학 용제의 가능성으로 인해, 화학적 방법을 통해 물리적 인 방법을 사용하여 준비하는 것이 좋습니다. 우리는 이전 TCS는 0.24 % 에탄올 / 물 (권 / 권)에 녹여 30 분 꺾 RBL 비만 세포의 탈과립 2 초음파 것으로 나타났습니다. 0.24 %보다 높은 농도의 에탄올 비만 세포 degra을 저해하는 표시되었습니다nulation 54,55 - 예 독성 연구에서 유기 용제의 잠재적 인 혼란 함을 주죠 효과.

뿐만 아니라 그것은 생물체 또는 연구에 사용되는 세포에 대한 용매의 영향을 고려하는 것이 중요하지만, 또한이 시험 화학 물질 자체에 용매의 효과를 모니터링하는 것이 중요합니다. 예를 들어, Skaare 등. 51 기름에 용해 함수의 완전한 손실이 발생하면서 폴리에틸렌 글리콜의 TCS를 (일반적으로 치약 및 구강에서 발견) 용해하는 건강한 여성 여성 안티 박테리아 및 안티 플라크 효과를 약화 것으로 나타났습니다. 따라서, 다른 용매의 능력 TCS 등 독성 물질 및 약물을 조절하는 효과를 분석 설계에 고려되어야한다. 오일이나 맛 첨가제의 사용은 다양한 제품 50,51에서 TCS의 효과를 방해 할 수 있습니다.

유기 용제를 사용하는 필요성을 제거하기위한 노력의 일환으로, 우리는 유기 졸의 사용을 제거하여 TCS 2 용해 우리의 방법에 따라 개선배출. 본 프로토콜에서는, 우리는 열 (≤ 50 ° C)과 수성 버퍼에 직접 TCS 과립을 분해 한 후 UV-VIS 분광 광도법으로이 TCS 주식의 농도를 확인합니다. TCS는 40 μM (최대 물에 용해하기 때문에 이러한 개선이 가능 http://www.epa.gov/oppsrrd1/REDs/2340red.pdf ) 50 ° C (가열시 분해에 저항하기 위해 표시되었습니다 http:/ / oehha.ca.gov/prop65/public_meetings/052909coms/triclosan/ciba3.pdf ) 56,57. TCS도 강하게 4,200 L / 몰 / CM 12의 몰 흡광 계수와 280 nm의 58에서 흡수하는 것으로 알려져 있습니다대로 우리는 또한 UV-VIS 분광 광도계의 장점이 있습니다.

이 프로토콜은 저렴한 비용과 신속한 확인 등 유기 용제의 도움없이 버퍼에 TCS 과립을 분해 할 수있는 간단하면서도 효과적인 방법을 제공합니다농도, 그리고 비만 세포 탈과립에 화학 효과를 모니터링하기위한 강력한 형광 마이크로 플레이트 분석을 설명합니다.

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프로토콜

모든 버퍼 조리법이 프로토콜 텍스트의 끝에서 테이블에 포함되어 있습니다.

DAY 1 :

1. 세포의 준비

  1. 가장자리 효과를 방지하기 위해 레이아웃을 테스트 샘플을 중심으로 96 - 웰 플레이트 설치 계획을 계획합니다. 할당 세 각 TCS 농도 시험 (항원 또는 이온 운반체의 ± 탈과립 자극제)뿐만 아니라, triplicates 자연 릴리스 (아무 탈과립 자극제), 최대 버전 (0.2 % 트리톤 X-100 [TX] 세제 용해) 등을위한 복제 우물 배경 샘플 (더 셀이 포함되지 않습니다)을 위해 예약되어 있습니다. 각 복제 실험의 날, TCS 샘플 농도의 새로운 무작위 레이아웃을 선택합니다.
  2. 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 RBL 미디어 (레시피 테이블에서 제공)와 트립신.
  3. 좋은 치유의 일반적인 징후 T-25 플라스크에 RBL 세포 (2-4 최종 통과 이후의 일 그리고 그들은 해동 된 이후 3~4개월 미만) 확인일 : 적절한 매체의 색상으로 표시 산도, 그리고 백탁의 부족. 플라스크 오염이되어 있고 세포가 제대로 합류 건강 나타나며, 주로 부착되었는지 확인하기 위해 광학 현미경 플라스크를 놓습니다. 세포가 마이코 플라스마 오염 약 6 주마다 22 확인해야합니다.
치료 Triplicates
자극, 0 μM TCS A7, B7, C7, F4, G4, H4
자극 0.001 μM TCS F6, G6, H6
자극, 0.1 μM TCS A4, B4, C4
자극, 1 μM TCS A6, B6, C6
자극, 5 μM TCS F5, G5, H5
자극, 10 μM TCS A3, B3, C3
자극, 15 μM TCS A5, B5, C5
자극, 20 μM TCS G7 F7, H7
자극 플러스 최고 [TCS] F3, G3, H3
자연, 아니 TCS는 (조롱을 포함하지 않음) A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8
TX-100, 아니 TCS는 D10, D11, D12 E10, E11, E12
더 셀없고, 배경, 플러스 최고 [TCS] G10, G11, G12, H10, H11, H12

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  1. 무균 조직 배양 (TC) 후드에 RBL 세포 플라스크를 가져 가라. 세포는 로봇에 부착되어플라스크의 탐. TC 후드에서 작업 표준 무균 기술을 사용하여, 멸균 피펫 플라스크에서 모든 미디어를 제거합니다 세포가 플라스크의 바닥에 붙어 남아 있습니다. 다음으로, 2 ML 트립신로 플라스크를 씻어,이 씻어 버린다.
  2. 플라스크의 바닥을 커버 정확히 2 ㎖ 트립신을 추가합니다. 5 분 ° C 배양기에서 세포가 플라스크의 바닥에서 분리 할 수​​ 있도록 37에 넣습니다.
  3. 5 분 후, 세포를 느슨하게 오픈 손바닥으로 플라스크의 측면을 누르십시오. 즉시 플라스크 떨어져 세포를 씻어 18 ML RBL 미디어를 추가하고 트립신을 해소 할 수 있습니다. 즉시 플라스크에서 세포 미디어 트립신 혼합물을 가지고 새로운 멸균 50 ML 튜브 (이 튜브의 전체 볼륨이 이제 20 ML이다)로 전송할 수 있습니다.
  4. 부드럽지만 철저하게 혼합 한 후,이 튜브에서 세포 현탁액의 50 μl를 제거하고 계산하는 샘플입니다 1.5 ML 살균 microcentrifuge 관에 전송합니다. 이 샘플을 취할뿐만 아니라, 50 ML0, 벤치 탑에 TC 후드의 세포 미디어 트립신 혼합물을 포함하는 관.
  5. 500 XG에서 13 분 동안 원심 분리기 50 ML 튜브를 (적절한 균형) 회전,이 힘 과립 세포를 효과적으로.
  6. 스핀 시간 동안 회전하기 전에 고립 된 샘플에서 세포를 계산합니다. 이 작업을 수행하려면 먼저 1.5 ML 튜브에 세포의 50 μL에 판 블루 염색의 50 μl를 추가하고 부드럽게하지만 철저하게 섞어 아래 배 피펫. 즉시 유리 hematocytometer이 혼합물의 10 μl를 전송하고, 제조업체의 지침에 따라 그리드 영역에서 세포를 계산합니다. 합리적인 통계 결과에 대한 최소 100 세포를 계산합니다.
  7. 위로 TC 후드에 아래로 회전 한 세포에서 뜨는을 제거합니다.
  8. 세포 관 모자, 세포를 느슨하게 튜브의 하단에있는 펠렛을 가볍게.
  9. 세포 수에 따라 0.5 × 10 6 세포 / ML의 농도를 산출하는 트립신 세포에 미디어를 추가 할 수 있습니다.
  10. 도금 과정 중에 부유 세포를 유지하기 위해 잘 조심스럽게 섞는다. Pipetman를 사용하여 플레이트 템플릿 시트에 따라 96 - 웰 플레이트 (평면, 블랙 하단)에서 /에 100 μl의 세포를 넣어. 세포는 세 우물의 각 집합 후 체계적인 오류 및 혼합을 방지하기 위해 우물에 추가하는 방법을 랜덤이 추가됩니다. 배경 샘플 표시된 우물에 세포를 넣어하지 않도록합니다.
  11. 일단 모든 셀이 전송되었습니다 접시에 접시에 뚜껑을 배치하고 하룻밤 (37 ° C / 5 % CO 2) 배양기로 전송합니다. 표준 멸균 방법에 따라 정리합니다.

DAY 2 :

2. 트리클로산의 준비

  1. 표시된 500 ML 삼각 플라스크에 눈금 실린더, 측정 250 ML의 Tyrodes 버퍼 (레시피 테이블에서 제공)를 사용하여 "TCS-버퍼입니다."교반 막대를 추가합니다. TCS와 함께 사용을 위해 지정된 바, 온도계를 저어 유리를 사용합니다.
  2. 또한이 시간에 측정 250별도의 500 mL의 삼각 플라스크에 넣고 ML의 Tyrodes 레이블이 "제어 버퍼입니다."사용 유리, 바, TCS에 대한 지정되지 않다 온도계를 저어. 교반 막대를 추가합니다.
  3. TCS 과립 0.0022 g을 달아 "TCS-buffer"라는 플라스크 (250 ML Tyrodes 버퍼를 포함하는)에 전송할 수 있습니다. 효율적으로 삼각 플라스크에 과립을 전송하기 위해 모든 TCS가 전송되었는지 확인하고, 배의 무게를 씻어 측정 250 ML의 Tyrodes에서 10 ㎖를 사용합니다.
  4. 장소 "TCS-버퍼"조합 열판 / 자기 저어 접시에 플라스크와는 manageably 빠른 속도로 저어 설정합니다. 일단 잘 혼합이 TCS의 주가는 명목상 30 μM (실제 농도는 가열 후 계산됩니다) 될 것입니다. (화학 물질 흄 후드있는 모든 믹싱 작업을 수행합니다.)
    1. 또한이 시간에, 두 번째 조합 열판 / 자기 저어 접시에 "제어 버퍼"플라스크 (아무런 TCS를 포함하지 않음) 배치하고 비슷한 속도로 저어로 설정합니다.
  5. 나중에 사용하기 위해 램프를 따뜻하게 UV / 마주 램프를 켭니다.
  6. 지속적으로 교반하면서 50 ° C에 "TCS-버퍼"솔루션을 가열한다. 일단 90 분 동안 온도, 시간에. 90 분 동안 자주 50 ° C 온도와 적절한 교반 속도를 지속적으로 모니터.
    1. 동시에 ° C 연속 교반과 함께 50 "제어 버퍼"솔루션 (일반 Tyrodes 버퍼의 단지 250 ML입니다) 가열한다. 50에 도달하면 시간 온도 (50 ° C에서 보관) 및 교반을 모니터링하는 둘 중에 ° C, 90 분의 시간.
  7. 90 분의 끝에, 핫 플레이트 및 벤치 탑로 전송 떨어져 삼각 플라스크를 모두 가져 가라.
  8. 빈 기계는 가열 "TCS-버퍼"액 1 mL를 스캔하기 전에 가열 "제어 버퍼"솔루션 1 ML에 UV / 광도계의 파장 스캔 기능을 사용하여. , 스펙트럼의 모양을 확인280 nm의 D 레코드 흡광도 값입니다. 농도를 결정하기 위해, 맥주 램버트 방정식을 사용 (A 280 = ε 280 ℓ C) ε을 사용하여 4200 280 L / 몰 / cm 12 1cm의 ℓ.
  9. TCS 농도를 결정한 후, 추가 0.249 g 소 (BSA) "TCS-버퍼"솔루션의 나머지 249 ML에, 잘 혼합 혈청 알부민.에게
    1. 동시에, "제어 버퍼"솔루션의 나머지 249 ML에 0.249 g BSA를 추가하고 잘 섞는다.

DAY 2 :

3. RBL-2H3 세포를 사용하여 항원 자극 탈과립의 분석

  1. 시작하기 전에 사용중인 모든 버퍼의 pH를 확인하고 흐린 명확하고 있지 않은지 확인 :이 Tyrodes 버퍼, 나트륨 아세테이트 버퍼, 글리신 탄산염 버퍼 (조리법 테이블에서 제공)가 포함되어 있습니다.
  2. 37 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 RBL 미디어 트립신.
  3. BT를 (1 MG / ML 확인0; Tyrodes 버퍼 BSA) : 0.05 g BSA + 50 ML Tyrodes 버퍼 (X2). 37 ° C의 물을 욕조에 넣습니다.
  4. 확인 0.2 % 트리톤 X-100 : BT의 3.136 ML + 64 μL 10 % 트리톤 X-100 (트리톤 X-100은 0.2 %이다의 최종 농도). 반전으로 잘 섞는다하지만, 소용돌이하지 않습니다. 37 ° C의 물을 욕조에 넣습니다.
  5. . TCS, 온수 Tyrodes 버퍼 (단계 "2"이상) 주의 준비를 시작합니다 "TCS-버퍼"와 "제어 버퍼"솔루션은 50 ° C 및 교반에 도달 할 때까지 다음 단계 (IgE의 노출)를 시작하지 마십시오 90 분 가열 / 교반 시간의 처음 70 분.
  6. 두 솔루션은 70 분 동안 50 ° C에서 교반되고 나면, (물론 100 μL /) 감응 할 샘플 우물 RBL 미디어에서 0.1 ㎍ / ㎖ 방지 DNP 마우스 IgE에 (시그마)를 확인합니다. 4에 저장 될 때 IgE의 주식이 30 일 이상이어야한다 ° C, 재고가 얼마나 오래된 기록합니다. 혼합 쓸어 넘겨 있지만, 소용돌이하지 IgE의 작업을 수행.
  7. TC 후드 아래,50 ML 튜브에 6 ML RBL 미디어에 0.6 μL IgE의 주식 (재고 1 MG / ML입니다)를 추가합니다. 제 50 ML 튜브에 만 일반 RBL 미디어 (nonsensitized 샘플 의도) 6 ML을 추가합니다.
  8. 싱크대에 96 - 웰 플레이트 (1 일에 준비되었다)에서 모든 미디어를 덤프하고, TC 후드 아래에 접시를 가져옵니다.
  9. 무작위로 100 μL 미디어 / (48 우물 총) 자극해야한다 우물에 IgE의 혼합물을 추가합니다. 이 혼합물은 "TX"및 "배경"샘플 "자연"에 대한 것이 아닙니다.
  10. 무작위 자발성 "TX", ""및 "배경"우물에 100 μL 일반 RBL 미디어를 추가 할 수 있습니다.
  11. 접시에 접시 뚜껑을 넣은 다음 1 시간 동안 37분의 2 ° C 배양기 5 % CO에 판을 이동합니다.
  12. 3.24-1 시간 배양 동안 같이 3.13를 따르십시오.
  13. 벤치 탑에서 항원 희석을 준비합니다. 1.6 MG / ML 주식 DNP-BSA + 850 μL & # 0.53 μl를 추가160, BT는 1 ㎍ / ㎖의 항원 농도를 얻을 수 있습니다. 소용돌이와 혼합이 주식을 반전.
  14. 일단 "TCS-버퍼"와 "제어 버퍼는"가열 한 후 50 90 분 동안 교반 ° C는 (단계 2.6로 이동 - 2.8.1) TCS 프로토콜에 대한 준비의 나머지 계속 진행합니다. BSA는 모두 솔루션에 용해 후 아래 계속합니다.
  15. ± 자세, ± TCS와 노출 버퍼를 준비하고 시작합니다. 첫째, "TCS 버퍼"솔루션 (이미 90 분 동안 가열 교반되어있는), 새로운 50 ML 원뿔 튜브 50 ML 전송의 249 ML 샘플에서. 이 50 ML의 나누어지는 20 μl를 제거하고 0.0004 ㎍ / ㎖ DNP-BSA의 최종 항원 농도 이전 준비 1 ㎍ / ㎖ 항원의 20 μL로 교체합니다. 소용돌이와 반전.
    1. 레이블이 "관 1, 높은 TCS / + AG는 / + BT."그것은 희석 가장 높은 TCS 농도를 노출하는 데 사용됩니다.
  16. "제어 버퍼"솔루션의 249 ML 샘플에서, 새로운 50 ML 튜브에 50 ML을 전송합니다. 이 새로운 50 ML 나누어지는 20 μl를 제거하고 0.0004 ㎍ / ㎖ DNP-BSA의 최종 항원 농도 이전 준비 1 ㎍ / ㎖ 항원의 20 μL로 교체합니다. 소용돌이와 반전.
    1. 레이블이 "관이 없음 TCS / + AG는 / + BT". TCS의 희석 및 0 μM TCS 농도에 노출을 위해 사용.
  17. 이제 "TCS-버퍼"솔루션의 50 ML를 꺼내 또 다른 50 ML 튜브에 넣어. 이 새로운 50 ML의 나누어지는의 20 μl를 제거하고 일반 BT의 20 μL로 교체합니다. 소용돌이와 반전. 어떤 항원이 추가되지 않습니다.
    1. 이 "관 3, 높은 TCS / 없음 AG는 / + BT."이것은 배경에 사용됩니다. 레이블을
  18. 다른 50 ML 튜브 "제어 버퍼"솔루션의 50 ML을 전송합니다. 이 지점에서 20 μl를 꺼내 W 50-ML의 나누어지는 및 일반 BT의 20 μL로 교체합니다. 소용돌이와 반전. (어떤 자세가 추가되지 않습니다.)
    1. 이 "관 4, 없음 TCS / 없음 AG는 / + BT."이것은 배경 및 자연 시료에 사용됩니다. 레이블을
BSA TCS 항원
튜브 1 figure-protocol-2 고 [] figure-protocol-3
관 (2) figure-protocol-4 NO figure-protocol-5
관 (3) / files/ftp_upload/50671/check.jpg "폭 =" "15px /> 고 [] NO
관 (4) figure-protocol-6 NO NO
  1. 계산하고 "TCS-버퍼"주식의 농도를 결정한 후 희석 볼륨을 기록합니다. 각 희석 농도 총 부피는 1 ML해야하며, 살균 microcentrifuge 관에 준비해야한다. 보정 P2 및 P1000 Pipetman를 사용합니다.
집중 높은 트리클로산 + Tyrodes + BSA 0.0004 ㎍ / ㎖ 자세
(위에서 튜브 1) 		BT 0.0004의 ㎍ / ㎖ 자세 가열
(위에서 튜브 2)
20 μM
15 μM
10 μM
5 μM
1 μM
0.1 μM
0.001 μM
0 μM (플레이트의 상단) ----------------------- 500 μL 플러스 또 다른 500 μl를
0 μM (접시 아래) ----------------------- 500 μL 플러스 또 다른 500 μl를
  1. 1 시간 IgE에 배양 한 후 배양 접시를 꺼내 싱크대에 모든 미디어를 던져. (참고 : 시험 물질이 소비자 제품 TCS보다 더 독성이 알려진 경우, 유해 폐기물 처리가 필요할 수 있습니다.)
  2. Combitip을 사용하여 무작위 BSA-Tyrodes 버퍼 (200 96 - 웰 플레이트에 세포를 씻어잘 / μL). 첨부 된 세포를 방해하지 않도록하기 위해, 오히려 직접 연결된 셀 위에보다 우물의 측면에 세척 버퍼를 해제합니다. 프로세스를 두 번 반복합니다.
  3. 응용 프로그램 소용돌이에 대한 치료를 준비하고 오른쪽 판에 추가하기 전에 희석을 반전합니다.
  4. 판의 윗부분부터 시작하여 : 무작위 해당 우물에 200 μL 항원 솔루션의 각 (TCS의 정확한 농도)의 triplicates를 추가합니다. 판의 아래로 계속합니다. 접시에 모두 "조롱"을 "제어 버퍼"솔루션 플러스 자세를 (위의 "관 2"에서)를 추가합니다.
  5. 해당 우물에 적합한 솔루션 200 μl를 추가합니다 :
    1. 0.2 % 트리톤 X-100 "TX"으로 지정한 우물의 200 μl를 추가합니다.
    2. 다음으로, "배경 (BKGD) 최고 TCS"접시에 표시된 3 우물에 튜브 3의 200 μl를 추가합니다.
    3. 마지막으로, 200 μl를 추가합니다관의 4 ~ 6 우물은 "자발적."라는
  6. 37 ° C / 5 % CO 2에서 1 시간 동안 접시를 품어.
  7. 1 시간 배양 중 : 얼음의 두 개의 버킷을 (인큐베이터에서 "오래된"접시 하나 새 접시 하나)하세요. 해동 4 methylumbelliferyl-N-아세틸-β-D-glucosaminide 상온에서 (4-MU)의 경우 최대가 빛에 민감하기 때문에 호일에두고 40 분에.
    1. 일단 4-MU 재고가 해동, 4-MU 작업 솔루션 구성 : 150 μL 주식 + 차가운 아세테이트 버퍼의 14.85 ML (표와 레시피) 소용돌이와 반전. 호일에 싸서 50 ML의 원심 분리기 튜브,와 사용할 때까지 얼음에 보관하십시오.
    2. Combitip을 사용하여 무작위 NEW 레니에 블랙 96 - 웰 플레이트 (얼음 양동이 # 2)의 각 우물의 맨 아래에 100 μL 감기 4-MU 작업 솔루션을 추가합니다. 무작위 트리톤 X-100 우물에서 무작위로 접시의 바닥에서, 판의 상단에서 임의로 작업 솔루션을 추가하여 첫 번째 시작,그리고 마지막으로 무작위로 배경 우물에서.
    3. 다음 단계 P200 팁 새로운 상자를 얻을.
  8. 1 시간 보육의 끝에 대한 잘 돌고 아래로 (부드럽게 거품을 도입하지 않음) 4 배 얼음 양동이 # 1, 피펫 상층 업에 인큐베이터에서 세포 판을 넣어 혼합 좋지만 혼합하면서 세포 닿지 않도록 . 체계적으로, 기판 (샘플 같은 순서가 원래대로 밖으로 계획)와 함께 새 접시에 각각 잘 곳에서 25 μL 샘플을 꺼냅니다. 때 새 잘 거품을 도입하지 않고, 철저하게 샘플을 혼합 아래로 피펫.
  9. 37 ° C / 5 % CO 2에서 30 분 알을 품다.
  10. 30 분 부화 후, 무작위로 325 μL 총 우물을 채우기 위해 당 잘 감기 글리신 탄산 버퍼 200 μl를 (Combitip을 사용)을 추가합니다. (트리톤 X-100 유출을 방지하기 위해, 트리톤 X-100 샘플이 외에도 마지막으로 확인). (클린 P10 피펫과 포크 읽기 플레이트 전에 거품을 확인테 팁) 모든 거품을 팝업합니다.
  11. 형광 플레이트 리더 (섹션 4로 이동)에서 접시를 실행합니다.

DAY 2 :

4. 형광 플레이트 리더 지침 및 데이터 분석

  1. GEN5 프로그램 및 열려있는 실험 섹션을 엽니 다.
  2. 플레이트 리더 및 인서트 플레이트 (왼쪽 상단 모서리는 A1입니다)를 켭니다.
  3. 프로토콜 figure-protocol-7 순서 figure-protocol-8 사용자 정의 측정 값을 설정 참조하십시오. 각 우물에서 원시 형광 데이터를 수집하기 위해 샘플에 대해 아무것도, 복제 등을 추가하지 마십시오.
  4. 최고 50 % 미만 "정상 속도" "," ", 형광", "이익 40", "흥분 40분의 360", "배출 40분의 460,"광학 위치를 끝점을 선택합니다 "를 읽어." 광학 위쪽 오프셋 : 7mm. 아무 흔들림 없음, 지연, 아니 동역학, 잘, 모니터, 온도 : 보육 전문가.
  5. 플랫 블랙 바닥 (레니에 96도, 편평한 바닥) 플레이트 96도를 선택합니다.
  6. 플레이트 레이아웃 거래 : 프로토콜 figure-protocol-9 플레이트 레이아웃입니다. 반복, 희석 등을 표시하지 않고 샘플을 설정합니다
  7. 판 figure-protocol-10 읽어보십시오.
  8. 파일을 저장 Excel로 데이터 파일을 내 보냅니다 "엑셀"버튼을 클릭합니다. 플레이트 레이아웃 및 매트릭스에 대해이 작업을 수행합니다. 컴퓨터와 USB 드라이브에 파일을 저장합니다.
  9. Excel에서 트리톤 X-100 우물 등 모든 샘플의 평균 배경 독서를 뺍니다.
  10. 평균 트리톤 X-100 값으로 각 값 (이미 배경 공제받은)을 나누어 상대 %의 탈과립을 계산 후 백분율하기 위해 100을 곱합니다.
  11. 평균은 모든 triplicates 및 표준 편차를 계산합니다. 같은 엑셀 그래프 데이터 값 ± 표준 편차를 의미한다. 통계적 테스트를 위해 GraphPad에 의해 프리즘 소프트웨어로 지금 이동합니다.

DAY 2 :

5. RBL-2H3 세포를 사용하여 이온 운반체 자극 탈과립의 분석

  1. "세포의 준비"에 대한 프로토콜 (제 1, 일 1)와 "트리클로산의 준비"(제 2 일 2)에 따라, 위에서 지시했다. 이온 운반체 자극에 대한 플레이트 레이아웃 예제는 다음과 같습니다.
치료 Triplicates
자극, 0 μM TCS A7, B7, C7, F4, G4, H4
자극 0.001 μM TCS F6, G6, H6
자극, 0.01 μM TCS F3, G3, H3
자극, 0.1 μM TCS A4, B4, C4
자극, 1 μM TCS A6, B6, C6
자극, 5 μM는 [TCS F5, G5, H5
자극, 10 μM TCS A3, B3, C3
자극, 15 μM TCS A5, B5, C5
자극, 20 μM TCS G7 F7, H7
DMSO, 아니 TCS와, 자연은 (Mock를 포함) A10, A11, A12, B10, B11, B12 A1, A2, A8, B1, B2, B8, C1, C2, C8, F1, F2, F8, G1, G2, G8, H1, H2, H8
TX-100 DMSO와 함께, 아니 TCS는 D10, D11, D12 E10, E11, E12
더 셀 배경 없으며, DMSO와 더불어 최고 [TCS] G10, G11, G12, H10, H11, H12

figure-protocol-11
큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .

  1. 시작하기 전에 사용중인 모든 버퍼의 pH를 확인하고 그들은 명확하고 흐린 있지 않은지 확인. Tyrodes, 아세트산 나트륨 버퍼, 그리고 글리신 탄산염 버퍼 (조리법 테이블에서 제공).
  2. 50 ML의 tyrodes 버퍼에 0.05 g BSA를 첨가하여 잘 섞어 소용돌이로 교반하여 BT의 한 50 ML 원뿔 튜브를 준비합니다. 37 ° C의 물을 욕조에 품어.
  3. 10 % 트리톤 X-100-4.704 ML BT의 96 μl를 추가하여 0.0032 % DMSO (최종 칼슘 이온 운반체 차량의 농도)로 0.2 % 트리톤 X-100을합니다. 잘 섞는다. 다음으로,이 솔루션의 0.155 μl를 꺼내 버립니다. 지금은 100 % DMSO의 0.155 μL에 다시 추가합니다.
  4. 이온 운반체 유리 병에 신선한 100 % DMSO 400 μL를 추가하고 혼합로 소용돌이 분말 A23187 이온 운반체의 5 MM의 주식 (2.5 밀리그램 / ML)를 준비합니다. 일단 솔루션,1.5 ML 원뿔 튜브, 기록 내용과 오늘의 날짜 및 만료 (준비로부터 3 개월 -20 ° C에서 제대로 저장)로 전송할 수 있습니다.
    1. 또는 얼음에 오늘 냉동 주식을 사용하는 경우, 해동, 및 5 mM의 A23187 이온 운반체 잘 혼합하고 깨끗한 지 확인합니다. 소용돌이, 영화, 사용하기 전에이 주식을 반전. #이 A23187의 준비와 롯의 기록 날짜입니다.
  5. 일단 "TCS-버퍼"와 "제어 버퍼가"가열 90 분 동안 교반되어, TCS 프로토콜 (단 2.6-2.8.1로 이동)를위한 준비의 나머지 부분을 계속합니다. BSA는 모두 솔루션으로 잘 혼합 한 후 나머지 프로토콜 단계를 계속 진행합니다.
  6. "TCS-버퍼"솔루션의 249 ML 샘플에서, 새로운 50 ML 원뿔 튜브 50 ML을 전송합니다. 50 ML의 나누어지는의 1.8 μl를 제거하고 5 밀리미터 이온 운반체 주식의 1.8 μl를 추가합니다. 소용돌이 8 초 동안 3 배와 3 배 반전. 최종 이온 운반체의 농도는 180 nm의. A23187이 농도 스톡 힘에 따라 달라질 수 있습니다, 그리고 A23187 이온 운반체 선량 반응은 RBL-2H3에 noncytotoxic로 확인 된 약 20 %의 최대 릴리스의 탈과립 수준을 이끌어 A23187의 농도를 확인하는 것이 좋습니다 세포 독성 분석에 의해 세포 (2).
    1. 레이블이 "관 1, 높은 TCS / + 이온 운반체 / + BT가."희석 가장 높은 TCS 농도에 노출에 사용됩니다.
  7. "제어 버퍼"솔루션의 249 ML 샘플에서, 새로운 50 ML 원뿔 튜브 50 ML을 전송합니다. 50 ML의 나누어지는의 1.8 μL를 가지고 5 밀리미터 이온 운반체 주식의 1.8 μL에 다시 추가합니다. 소용돌이 8 초 동안 3 배와 3 배 반전. 최종 이온 운반체의 농도는 180 nm 정도이다.
    1. 레이블이 "관 2 아니오 TCS / + 이온 운반체 / + BT."이것은 희석 및 0 μM TCS 농도에 사용됩니다.하지
  8. R의 249 ML 샘플에서 20, TCS 버퍼 "솔루션, 새로운 50 ML 원뿔 튜브 50 ML을 전송합니다. 새로운 50 ML의 나누어지는의 1.8 μL를 가지고 100 % DMSO의 1.8 μl를 추가합니다. 소용돌이 8 초 동안 3 배와 3 배 반전 없음, 이온 운반체가 추가됩니다.
    1. 레이블이 "관 3, 높은 TCS / 없음 이온 운반체 / + BT / + DMSO는"; 배경에 사용됩니다.
  9. "제어 버퍼"솔루션의 249 ML 샘플에서, 새로운 50 ML 원뿔 튜브 50 ML을 전송합니다. 새로운 50 ML의 나누어지는의 1.8 μL를 가지고 100 % DMSO의 1.8 μl를 추가합니다. 소용돌이 8 초 동안 3 배와 3 배 반전. 더 이온 운반체가 추가되지 않습니다.
    1. 레이블이 "관 4, TCS / 없음 이온 운반체 / + BT / + DMSO 없음"; 자연 방출 샘플에 사용됩니다.
BSA TCS 이온 운반체 추가 100 % DMSO
튜브 1 "SRC ="/ files/ftp_upload/50671/check.jpg "폭 ="15px "/> 고 [] figure-protocol-12 NO
관 (2) figure-protocol-13 NO figure-protocol-14 NO
관 (3) figure-protocol-15 고 [] NO figure-protocol-16
관 (4) figure-protocol-17 NO NO 에크 마크 "FO : 콘텐츠 너비 =" "SRC ="/ files/ftp_upload/50671/check.jpg "폭 =" "15px />에서 .1
  1. 계산하고 "TCS-버퍼"주식의 농도를 결정한 후 희석 볼륨을 기록합니다. 보정 P2 및 P1000 Pipetman를 사용합니다. 각 희석 농도 총 부피는 1 ML해야하고, 살균 microcentrifuge 관에 준비되어야한다 :
집중 높은 트리클로산 + Tyrodes + BSA +180 nm의 A23187 (위에서 튜브 1) BT +180 nm의 A23187을 (위에서 튜브 2) 가열
20 μM
15 μM
10 μM
5 μM
1 μM
0.1 μM
0.001 μM
0 μM (플레이트의 상단) ---------------------------------- 500 μL 플러스 또 다른 500 μl를
0 μM (접시 아래) ---------------------------------- 500 μL 플러스 또 다른 500 μl를
  1. 인큐베이터 어제 도금 셀 및 싱크에 용지 빈을 가져 가라. Combitip을 사용하여, 무작위 BT (200 μL / 잘)로 96 - 웰 플레이트에 세포를 씻으십시오. 세차를 두 번 반복합니다.
  2. 응용 프로그램 소용돌이에 대한 치료를 준비하고 오른쪽 판에 추가하기 전에 희석을 반전합니다. 판의 윗부분부터 시작하여 : 무작위 correspo 200 μL의 triplicates TCS의 정확한 농도를 각각 추가잘 nding. 판의 아래로 계속합니다. 접시에 모두 "조롱"을 "제어 버퍼"솔루션 플러스 A23187 (위 "관 2"에서)를 추가합니다.
  3. 해당 우물에 적합한 솔루션 200 μl를 추가합니다 :
    1. 0.2 % 트리톤 X-100 "TX"으로 지정한 우물의 200 μl를 추가합니다.
    2. 다음으로, "배경 (BKGD) 최고 TCS"접시에 표시된 3 우물에 튜브 3의 200 μl를 추가합니다.
    3. 마지막으로, 표시 관 (4) 여섯 우물의 200 μl를 추가 "자발적인을."
  4. 37 ° C / 5 % CO 2에서 1 시간 동안 접시를 품어.
  5. 1 시간 배양 중 : 얼음의 두 개의 버킷을 (인큐베이터에서 "오래된"접시 하나 새 접시 하나)하세요. 해동 4 methylumbelliferyl-N-아세틸-β-D-glucosaminide 상온에서 (4-MU)의 경우 최대가 빛에 민감하기 때문에 호일에두고 40 분에.
    1. 일단 4-MU 재고가 해동, 4-MU 작업 soluti입니다 메이크업에 : 150 μL 주식 + 차가운 아세테이트 버퍼의 14.85 ML (표와 레시피) 소용돌이와 반전. 호일에 싸서 50 ML의 원심 분리기 튜브,와 사용할 때까지 얼음에 보관하십시오.
    2. Combitip을 사용하여 무작위 NEW 레니에 블랙 96 - 웰 플레이트 (얼음 양동이 # 2)의 각 우물의 맨 아래에 100 μL 감기 4-MU 작업 솔루션을 추가의 상단에서 임의로 작업 솔루션을 추가하여 첫 번째 시작 무작위 무작위 트리톤 X-100 우물에서 접시의 바닥, 내 마지막으로 무작위로 배경 우물에서 접시.
    3. 다음 단계 P200 팁 새로운 상자를 얻을.
  6. 1 시간 배양의 끝에서 믹싱 좋지만 세포 닿지 혼합 동안 잘 돌고 아래로 (부드럽게 거품을 도입하지 않음) 4 배 얼음 양동이 # 1, 피펫 상층 업에 인큐베이터에서 세포 판을 넣어 . 체계적, SA의 기판 (동일한 순서로 새 접시에 각각 잘 곳에서 25 μL 샘플을 꺼내mples는 원래대로) 밖으로 계획. 때 새 잘 거품을 도입하지 않고, 철저하게 샘플을 혼합 아래로 피펫.
  7. 37 ° C / 5 % CO 2에서 30 분 알을 품다.
  8. 30 분 부화 후, 무작위로 325 μL 총 (트리톤 X-100 유출을 방지하기 위해, 지난 트리톤 X-100 샘플이 추가 확인)에 우물을 채우기 위해 잘 당 200 μL 차가운 글리신 탄산염 버퍼 (Combitip을 사용)을 추가합니다. 독서 플레이트 전에 거품 (모든 거품을 팝업하는 깨끗한 P10 피펫 팁 포크)를 확인합니다.
  9. (제 4의 모든 단계를 따르십시오) 형광 플레이트 리더에 접시를 실행합니다.

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결과

50 가열하면 ° C 90 분, TCS에 대한 UV-VIS 흡수 스펙트럼은 그림 1에서 보는 바와 같이 280 nm의 피크 ~ 260, 300 nm의 사이에 강한, 부드러운 곡선을 생산하고 있습니다. 280 nm에서 발표 몰 흡광 계수는 4,200 L / 몰 / ㎠ 12 년부터 UV-VIS 분광 광도계는, 따라서 농도를 계산하는 데 이용 될 수있는 중요한 도구입니다. 우리는 TCS는 50 ° C 가열 (데이터가 표시되지 않음)에 따라, 전체 탈과립 실험의 기간 동안 용액 빠지지 않는 것으로 나타났습니다.

수성 버퍼에 직접 TCS를 해산이 가열 방법을 사용하면, 우리는이 NaAl 등의 최적화 된 형광 기반의 분석을 사용하여 비만 세포 탈과립에 TCS의 효과를 조사 하였다. 1이 분석은 돛대에서 풀어 β-헥 소사 미나의 수준을 기록 형광 기판 제품을 감지하여 한 시간 배양 한 후 세포. DNP-BS에 의해 degranulate을 자극 여부항원

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토론

2004 년,이 NaAl 등. 1 탈과립의 높은 처리량 테스트를 위해 비만 세포 바이오 센서를 개발했다. 그것은 우리가 우리의 TCS 연구에 대한 적응이 비디오에 설명 한 강력한 분석이다. 이전이 NaAl 등에 1. 분석은 비만 세포의 탈과립은 정기적으로 β-헥 소사 미나 59-61 통해 평가하지만, 이러한 초기의 방법은 하나의 샘플을 한 번 읽은하는 형광 분석기를 이용하고 있었다. 중요한 것은,이 NaAl 하였다. 자신의 마이크로 플레이트 리더를 활용하여 더 높은 처리량 방법 및 샘플 형광에 한 번에 하나를 읽은하는 이전 방법과 설정 직접적인 일치. 요컨대,이 NaAl 등 1. 크게뿐만 아니라 워크 플로에 ​​몇 가지 변화를 통합하여, 높은 처리량 마이크로 플랫폼에 적응하여 속도, 전력, 단순 및 분석의 신뢰성을 향상 시켰습니다. 여기에, 우리는 또한 특히, 여기에 다양한 테스트 화학 물질의 연구에이 분석...

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공개 사항

우리는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

LMW 및 RHK는 생명 과학 및 엔지니어링 (GSBSE)의 UMaine의 대학원에 의해 지원됩니다 RHK는 메인 농업 및 산림 실험 역에 의해 지원되었다. 추가 자금은 일반 의료 과학 국립 연구소 (NIH P20-GM103423), 메인 농업 및 산림 시험장 (허가 번호 ME08004-10, JAG), 타이드 센터 (NSF 그랜트 # 1,008,498)를 상승 메인 ADVANCE의 대학에 의해 제공되었다 및 PhRMA 재단 (JAG)에서 약리학 / 독성학의 연구 스타터 부여합니다. 우리는 Drs에 감사드립니다. 항원 세포 데이비드 Holowka와 바바라 베어드. 우리는 히나 Hashmi, 알레한드로 벨 레즈, 장비 및 명령에 대한 도움말 앤드류 Abovian에 감사합니다. 이 메인 농업 및 산림 시험장 간행물 번호 3311입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글

RBL-2H3 셀

ATCCp align="center">CRL-2256

우리가 사용한 셀은 선물이었지만 ATCC에서도 구할 수 있습니다

Triclosan/Irgasan

Sigma

72779

CAS# 3380-34-5

저습도 환경에서 보관해야 합니다

Trypsin

Gibco

25300-054

CAS# 3380-34-5

EMEM

Lonza

12-611F

태아 소 혈청

Atlanta Biologicals

S11150

겐타마이신 설페이트

Lonza Biological Sciences

17-518

알부민, 소 혈청

Calbiochem

12659

CAS# 9048-46-8

Surfact-Amps X-100 (Triton X-100; 10% 용액)

피어스

28314

CAS# 9002-93-1

HEPES

J.T 베이커

4153-01

CAS# 75277-39-3

염화마그네슘

VWR

BDH0244-500G

CAS# 7791-18-6

D-(+)-포도당

Biomedicals

152527

CAS# 50-99-7

염화칼륨 결정

J.T 베이커

3046-01

CAS# 7447-40-7

염화칼슘 dihyrdate

Acros Organics

207780010

CAS# 10035-04-8

글리신

> 시그마

G8898

CAS# 56-40-6

4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide (4-MU)

EMD Biosciences

474502-250MG

CAS # 37067-30-4

<		p align="center">Wrap in foil – 빛에 민감함

Anti-DNP Mouse IgE

Sigma

D8406

시약의 농도는 1mg/ml입니다. 부분 표본 25 &마이크로; 엘  시약을 별도의 마이크로 원심분리기 튜브와 파라필름에 넣습니다. 부분 표본을 -20 °에 저장하십시오. C는 사용되지 않고 2-8°C에서 사용되는 부분 표본을 저장합니다. C 1 개월 이상 .< / p>

DNP-BSA< / p >

코넬 대학교 데이비드 홀로 카 박사와 바바라 베어드 박사의 선물

< / p>

제안 : 생명 과학 DNP-BSA 카탈로그 # A2301<8 / a>< / p>

< / p>

칼슘 이오노 포어 A23187< / p>

시그마

C75-22-1mg< / p>

Ionophore는 400 µ를 첨가하여 분말로 만들어졌습니다. 엘  신선한 100% DMSO를 이오노단 바이알에 넣고 -20°C로 유지합니다. C

참고: 만료 날짜가 3개월이 지난 ionophore를 성공적으로 사용했습니다

DMSO

Sigma

D2650

CAS# 67-68-5

아세트산

VWR

BDH3094-2

CAS# 64-19-7

무수 탄산나트륨

Sigma

222321

CAS# 497-19-8

염화나트륨

Sigma

71376

CAS# 7647-14-5

<		p align="center">

염산

VWR

BDH3026

CAS# 7647-01-0

참조 버퍼, pH 7

VWR

BDH5046

참조 버퍼, pH 10

VWR

BDH5072

참조 버퍼, pH 4

VWR

BDH5018

pH 전극 스토리지 솔루션

VWR

14002-828

Equipment:

DU 7500 분광 광도계

Beckmann

더 이상 판매되지 않음

Synergy 2 플레이트 리더

Gen5 마이크로플레이트 데이터 수집 및 분석 소프트웨어 사용

BioTek

모듈 S

혈구계

Hausser Scientific

3110

>

7 x  7 CER HOT/STIR 120 V

핫 플레이트/마그네틱 교반 플레이트

VWR

97042-634

Centrifuge

Eppendorf

5430

< / p>

조직 배양 수조< / p>

VWR

모델 # 89032-206< / p>

< / p>

조직 배양 생물 안전 캐비닛 < / p>

SafeGARD (TC 후드) < / p >

The Baker Company

Model# SG403A-HE

조직 배양 인큐베이터

ThermoScientific

Model# 3598

Pipetman

VWR

>

범위: P2-P1000

Balance

Mettler Toledo

Model# AG204

pH meter

Symphony/VWR

Model# SB70P

Pipet-Aid

Drummond Scientific

4-000-100

>

Combitip 디스펜서

Eppendorf

4981 000.019

조리법:

아세테이트 완충액, pH 4.4

0.12M 아세트산을 만들고 10N NaOH로 pH 4.4로 적정합니다. 이것은 MilliQ 물 1L에 5.3ml 빙하 아세트산입니다 : (1 L) * (0.12 mol / L) * (60 g / mol) * (ml / 1.37 g) = 5.3 ml 빙하의 밀도는 1.37 g / ml이기 때문에

멸균 필터를 고압 증기 멸균 유리 병에 넣으십시오 < / p>

기판 (4-MU) < / p>

Sigma M-2133, 250 mg, C18H21NO8, FW 379.4 CAS (37067-30-4) -20°C에 보관; C 주식 : DMSO에서 0.12 M (1 ml DMSO에서 46 mg), 37 °로 따뜻한; C, 와류, 따뜻한 물로 수조 초음파 발생기에서 10 분 초음파 처리, 다시 와류

각 실험에 대해 아세테이트 완충액 (100x 희석)에서 기질의 새로운 용액을 만들고 아세테이트 완충액에서 1.2 mM의 최종 농도를 만듭니다 < / p>

글리신 탄산 완충액, pH 10 < / p>

26.7 g 글리신 47.1 g 무수 탄산 나트륨 1 L에 탈 이온수를 추가합니다. pH를 10

멸균 필터를 고압증기멸균 유리병

Tyrodes(2L), pH 7.4

135mM NaCl: 15.78g(또는 1M 270ml) 5mM KCl: 1M 스톡 10ml 1.8mM CaCl2: 0.5 M 스톡 7.20 ml 1 mM MgCl2: 0.5 M 스톡 4.00 ml 5.6 mM 포도당: 2.02 g (1 M 11.2 ml) 20 mM HEPES: 1 M 스톡 40 ml 농축 HCl pH 사용 ~9.7-7.4

멸균 필터를 고압증기멸균 유리병에 넣

RBL 세포 매체

해동 소 태아 혈청 (FBS, -20 ° C) 37°C에서 약 4시간 동안; C 수조: 표준 멸균 기술을 따르십시오: L-글루타민(Earle' 포함)과 함께 1L의 최소 필수 배지(MEM)를 꺼내십시오. s salts) MEM을 약간 부어 800ml MEM을 만들고 200mL의 따뜻한 FBS를 추가합니다. 멸균 피펫이 있는 배지 1L에 겐타마이신 설페이트 항생제 1ml를 추가합니다. 세포 배양 전용으로 오토클레이브 처리되고 표시된 배지 병만 사용합니다.

멸균 필터 (0.2 mm)를 고압클레이브 유리 병에 넣

사용된 플라스틱 재료:

200 µ 엘  96 rack

VWR

53509-009

polypropylene

1,000 µ 엘  HighRecovery가 있는 멸균 에어로졸 피펫 팁

VWR

89003-420

<		p align="center">폴리에틸렌

10 µ 엘  마이크로 팁 저 바인딩 멸균 < / p>

VWR

14217-704 < / p>

폴리 프로필렌 < / p>

높은 G-force를 위한 일회용/원추형 미세 원심 분리기 튜브

VWR

20170-038

폴리프로필렌

일회용/졸업식/원뿔형/멸균 50 ml  스크류 캡이 있는 원심분리기 튜브

VWR

21008-178

polypropylene

일회용/점진/원추형/멸균 15 ml  스크류 캡이 있는 원심분리기 튜브

VWR

21008-103

polypropylene

CELLSTAR 조직 배양 처리 T-25 플라스크 w/ 필터 캡

Greiner Bio One

690175

폴리스티렌

CELLSTAR 조직 배양 처리된 T-75 플라스크 w/ 필터 캡

Greiner Bio One

658175

polystyrene

CELLSTAR 10 ml  종이/플라스틱으로 감싼 혈청학 피펫

Greiner Bio One

607180

폴리스티렌

CELLSTAR 2 ml  종이/플라스틱 래핑 혈청학 피펫

Greiner Bio One

710180

폴리스티렌

CELLSTAR 5 ml  종이/플라스틱 래핑 혈청학 피펫

Greiner Bio One

606180

polystyrene

CELLSTAR 25 ml  종이 / 플라스틱 포장 혈청 피펫 < / p >

Greiner Bio One

760180< / p>

polystyrene < / p

>

1 cm 큐벳 < / p >

N / A

N / A< / p>

폴리스티렌< / p>

CELLSTAR, 96W Microplate, Tissue-Culture Treated, Black, with Lid

96-well Plate

Greiner Bio One

655086

폴리스티렌

Combitips

Eppendorf

022266501< / p >

폴리 프로필렌 / < / p > < 정렬 = "중심">폴리에틸렌 < / p >

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참고문헌

  1. Naal, R., Tabb, J., Holowka, D., Baird, B. In situ measurement of degranulation as a biosensor based on RBL-2H3 mast cells. Biosens. Bioelectron. 20, 791-796 (2004).
  2. Palmer, R. K., et al. Antibacterial agent triclosan suppresses RBL-2H3 mast cell function. Toxicol. Appl. Pharmacol. 258, 99-108 (2012).
  3. Fewtrell, C., Kessler, A., Metzger, H. Comparative aspects of secretion from tumor and normal mast cells. Adv. Inflam. Res. 1, 205-221 (1979).
  4. Metzger, H., et al. The receptor with high-affinity for immunoglobulin-E. Annu. Rev. Immunol. 4, 419-470 (1986).
  5. Seldin, D. C., et al. Homology of the rat basophilic leukemia-cell and the rat mucosal mast-cell. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 3871-3875 (1985).
  6. Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunological release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast-cells. J. Immunol. 123, 1445-1450 (1979).
  7. Kjaerheim, V., Barkvoll, P., Waaler, S. M., Rolla, G. Triclosan inhibits histamine-induced inflammation in human skin. J. Clin. Periodontol. 22, 423-426 (1995).
  8. Barkvoll, P., Rolla, G. Triclosan reduces the clinical symptoms of the allergic patch test reaction (APR) elicited with 1-percent nickel sulfate in sensitized patients. J. Clin. Periodontol. 22, 485-487 (1995).
  9. Tan, W. P., Suresh, S., Tey, H. L., Chiam, L. Y., Goon, A. T. A randomized double-blind controlled trial to compare a triclosan-containing emollient with vehicle for the treatment of atopic dermatitis. Clin. Exp. Dermatol. 35, e109-e112 (2010).
  10. Sporik, R., Kemp, A. S. Topical triclosan treatment of atopic dermatitis. J. Allergy Clin. Immunol. 99, 861(1997).
  11. Wohlrab, J., Jost, G., Abeck, D. Antiseptic efficacy of a low-dosed topical triclosan/chlorhexidine combination therapy in atopic dermatitis. Skin Pharmacol. Physiol. 20, 71-76 (2007).
  12. Wong-Wah-Chung, P., Rafqah, S., Voyard, G., Sarakha, M. Photochemical behaviour of triclosan in aqueous solutions: Kinetic and analytical studies. J. Photochem. Photobiol. A Chem. 191, 201-208 (2007).
  13. Blank, U., Essig, M., Scandiuzzi, L., Benhamou, M., Kanamaru, Y. Mast cells and inflammatory kidney disease. Immunol. Rev. 217, 79-95 (2007).
  14. Gri, G., et al. Mast cell: an emerging partner in immune interaction. Frontiers in Immunology. 3, (2012).
  15. Kuby, J. Immunology. , W.H. Freeman. (1997).
  16. Farrell, D. J., et al. Intrahepatic mast-cells in chronic liver-diseases. Hepatology. 22, 1175-1181 (1995).
  17. Cookson, W. The alliance of genes and environment in asthma and allergy. Nature. 402, 5-11 (1999).
  18. Ferris, C. D., Huganir, R. L., Supattapone, S., Snyder, S. H. Purified inositol 1,4,5-triphosphate receptor mediates calcium flux in reconstituted lipid vesicles. Nature. 342, 87-89 (1989).
  19. Foreman, J. C., Mongar, J. L., Gomperts, B. D. Calcium ionospheres and movement of calcium ions following physiological stimulus to a secretory process. Nature. 245, 249-251 (1973).
  20. Siraganian, R. P., Kulczycki, A., Mendoza, G., Metzger, H. Ionophore A-23187 induced histamine-release from mast-cells and rat basiphil leukemia (RBL-1) cells. J. Immunol. 115, 1599-1602 (1975).
  21. Demo, S. D., et al. Quantitative measurement of mast cell degranulation using a novel flow cytometric annexin-V binding assay. Cytometry. 36, 340-348 (1999).
  22. Hutchinson, L. M., et al. Inorganic arsenite inhibits IgE receptor-mediated degranulation of mast cells. J. Appl. Toxicol. 31, 231-241 (2011).
  23. Dann, A. B., Hontela, A. Triclosan: environmental exposure, toxicity and mechanisms of action. J. Appl. Toxicol. 31, 285-311 (2011).
  24. Jones, R. D., Jampani, H. B., Newman, J. L., Lee, A. S. Triclosan: A review of effectiveness and safety in health care settings. Am. J. Infect. Control. 28, 184-196 (2000).
  25. Levy, C. W., et al. Molecular basis of triclosan activity. Nature. 398, 383-384 (1999).
  26. McMurry, L. M., Oethinger, M., Levy, S. B. Triclosan targets lipid synthesis. Nature. 394, 531-532 (1998).
  27. Allmyr, M., Adolfsson-Erici, M., McLachlan, M. S., Sandborgh-Englund, G. Triclosan in plasma and milk from Swedish nursing mothers and their exposure via personal care products. Sci. Total Environ. 372, 87-93 (2006).
  28. Allmyr, M., et al. The influence of age and gender on triclosan concentrations in Australian human blood serum. Sci. Total Environ. 393, 162-167 (2008).
  29. Geens, T., Neels, H., Covaci, A. Distribution of bisphenol-A, triclosan and n-nonylphenol in human adipose tissue, liver and brain. Chemosphere. 87, 796-802 (2012).
  30. Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in US streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environ. Sci. Technol. 36, 1202-1211 (2002).
  31. Black, J. G., Howes, D. Percutaneous absorption of triclosan from toilet preparations. J. Soc. Cosmet. Chem. 26, 205-215 (1975).
  32. Black, J. G., Howes, D., Rutherford, T. Percutaneous absorption and metabolism of Irgasan DP300. Toxicology. 3, 33-47 (1975).
  33. Kanetoshi, A., et al. Acute toxicity, percutaneous-absorption and effects on hepatic mixed-function oxidase activities of 2,4,4'-trichloro-2'-hydroxydiphenyl ether (Irgasan(R) DP300) and its chlorinated derivatives. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 23, 91-98 (1992).
  34. Sandborgh-Englund, G., Adolfsson-Eric, M., Odham, G., Ekstrand, J. Pharmacokinetics of Triclosan in man. J. Dental Res. 81, 0937(2002).
  35. Sandborgh-Englund, G., Adolfsson-Erici, M., Odham, G., Ekstrand, J. Pharmacokinetics of triclosan following oral ingestion in humans. J. Toxicol. Environ. Health A. 69, 1861-1873 (2006).
  36. Lin, Y. J. Buccal absorption of triclosan following topical mouthrinse application. Am. J. Dent. 13, 215-217 (2000).
  37. Queckenberg, C., et al. Safety of Triclosan after Dermal Administration. Antimicrob. Agents Chemother. 54, 570-572 (2010).
  38. Breneman, D. L., Hanifin, J. M., Berge, C. A., Keswick, B. H., Neumann, P. B. The effect of antibacterial soap with 1.5% triclocarban on Staphylococcus aureus in patients with atopic dermatitis. Cutis. 66, 296-300 (2000).
  39. Udoji, F., Martin, T., Etherton, R., Whalen, M. M. Immunosuppressive effects of triclosan, nonylphenol, and DDT on human natural killer cells in vitro. J. Immunotoxicol. 7, 205-212 (2010).
  40. Ahn, K. C., et al. In vitro biologic activities of the antimicrobials triclocarban, its analogs, and triclosan in bioassay screens: Receptor-based bioassay screens. Environ. Health Perspect. 116, 1203-1210 (2008).
  41. Foran, C. M., Bennett, E. R., Benson, W. H. Developmental evaluation of a potential nonsteroidal estrogen: triclosan. Mar. Environ. Res. 50, 153-156 (2000).
  42. Gee, R. H., Charles, A., Taylor, N., Darbre, P. D. Oestrogenic and androgenic activity of triclosan in breast cancer cells. J. Appl. Toxicol. 28, 78-91 (2008).
  43. Helbing, C. C., van Aggelen, G., Veldhoen, N. Triclosan Affects Thyroid Hormone-Dependent Metamorphosis in Anurans. Toxicol. Sci. 119, 417-418 (2011).
  44. Ishibashi, H., et al. Effects of triclosan on the early life stages and reproduction of medaka Oryzias latipes and induction of hepatic vitellogenin. Aquat. Toxicol. 67, 167-179 (2004).
  45. Kumar, V., Chakraborty, A., Kural, M. R., Roy, P. Alteration of testicular steroidogenesis and histopathology of reproductive system in male rats treated with triclosan. Reprod. Toxicol. 27, 177-185 (2009).
  46. Matsumura, N., et al. Effects of nonylphenol and triclosan on production of plasma vitellogenin and testosterone in male South African clawed frogs (Xenopus laevis. Biol. Pharm. Bull. 28, 1748-1751 (2005).
  47. Veldhoen, N., et al. The bactericidal agent triclosan modulates thyroid hormone-associated gene expression and disrupts postembryonic anuran development. Aquat. Toxicol. 80, 217-227 (2006).
  48. Raut, S. A., Angus, R. A. Triclosan has endocrine-disrupting effects in male western mosquitofish, Gamusia affins. Environ. Toxicol. Chem. 29, 1287-1291 (2010).
  49. Park, H. G., Yeo, M. K. The toxicity of triclosan, bisphenol A, bisphenol A diglycidyl ether to the regeneration of cnidarian, Hydra magnipapillata. Mol. Cell. Toxicol. 8, 209-216 (2012).
  50. Vandhanaa, S., Deepa, P. R., Aparna, G., Jayanthi, U., Krishnakumar, S. Evaluation of suitable solvents for testing the anti-proliferative activity of triclosan - a hydrophobic drug in cell culture. Indian J. Biochem. Biophys. 47, 166-171 (2010).
  51. Skaare, A. B., Kjaerheim, V., Barkvoll, P., Rolla, G. Does the nature of the solvent affect the anti-inflammatory capacity of triclosan? An experimental study. J. Clin. Periodontol. 24, 124-128 (1997).
  52. Rufli, H. Introduction of moribund category to OECD fish acute test and its effect on suffering and LC50 values. Environ. Toxicol. Chem. 31, 1107-1112 (2012).
  53. Hutchinson, T. H., Shillabeer, N., Winter, M. J., Pickford, D. B. Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review. Aquat. Toxicol. 76, 69-92 (2006).
  54. Toivari, M., Maki, T., Suutarla, S., Eklund, K. K. Ethanol inhibits IgE-induced degranulation and cytokine production in cultured mouse and human mast cells. Life Sci. 67 (00), 2795-2806 (2000).
  55. Kennedy, R. H., Pelletier, J. H., Tupper, E. J., Hutchinson, L. M., Gosse, J. A. Estrogen mimetic 4-tert-octylphenol enhances IgE-mediated degranulation of RBL-2H3 mast cells. J. Toxicol. Environ. Health A. 75, 1451-1455 (2012).
  56. Fort, D. J., et al. Triclosan and Thyroid-Mediated Metamorphosis in Anurans: Differentiating Growth Effects from Thyroid-Driven Metamorphosis in Xenopus laevis. Toxicol. Sci. 121, 292-302 (2011).
  57. Fiori, J., et al. Macromolecular Symposia. in Brazilian Polymer Congress. Pinto, J. C. 299-300, 26-33 (2011).
  58. Mezcua, M., et al. Evidence of 2,7/2,8-dibenzodichloro-p-dioxin as a photodegradation product of triclosan in water and wastewater samples. Anal. Chim. Acta. 524, 241-247 (2004).
  59. Soto, E. O., Pecht, I. A monoclonal-antibody that inhibits secretion from rat basophilic leukemia-cells and binds to a novel membrane component. Journal of Immunology. 141, 4324-4332 (1988).
  60. Pierini, L., Harris, N. T., Holowka, D., Baird, B. Evidence supporting a role for microfilaments in regulating the coupling between poorly dissociable IgE-Fc epsilon RI aggregates and downstream signaling pathways. Biochemistry. 36, 7447-7456 (1997).
  61. Aketani, S., Teshima, R., Umezawa, Y., Sawada, J. Correlation between cytosolic calcium concentration and degranulation in RBL-2H3 cells in the presence of various concentrations of antigen-specific IgEs. Immunol. Lett. 75, 185-189 (2001).
  62. Koo, N., Kim, K. M. Distinct effects on M-2-type pyruvate kinase are involved in the dimethylsulfoxide-induced modulation of cellular proliferation and degranulation of mast cells. Arch. Pharmacal Res. 32, 1637-1642 (2009).
  63. Senyshyn, J., Baumgartner, R. A., Beaven, M. A. Quercetin sensitizes RBL-2H3 cells to polybasic mast cell secretagogues through increased expression of Gi GTP-binding proteins linked to a phospholipase C signaling pathway. J. Immunol. 160, 5136-5144 (1998).
  64. Yang, C. Z., Yaniger, S. I., Jordan, V. C., Klein, D. J., Bittner, G. D. Most Plastic Products Release Estrogenic Chemicals: A Potential Health Problem that Can Be Solved. Environ. Health Perspect. 119, 989-996 (2011).

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