방법 논문

Transsynaptic는 콜레라 독소와 바이오틴 덱스 트란 아민 두 번 라벨로 이어 (僞) 바이러스에 주변 대상에서 추적

DOI:

10.3791/50672

⸱

2015년 9월 14일

 ,  , 
1Department of Neurobiology, Duke University Medical Center, 2Howard Hughes Medical Institute

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transsynaptic tracing은 다중 시냅스 회로를 통해 주변 대상을 조절하는 중심 원심성을 분석하기 위한 강력한 도구가 되었습니다. 여기에서는 시냅스경이 횡단하는 광견병 바이러스를 활용하여 기능적인 뇌 회로를 식별하고 국소화하는 프로토콜을 제시한 다음, 식별된 뉴런 그룹 간의 회로에서 특정 연결을 검증하기 위한 고전적인 요로 추적 기술을 제시합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transsynaptic 추적은 다중 시냅스 회로를 통해 주변 대상을 조절하는 중앙 efferents를 분석하는 데 강력한 도구가되고있다. 이 접근법은 가장 광범위 돼지 병원체 (僞) 바이러스 (PRV) (1)을 이용하여 뇌에 사용되어왔다. PRV는 인간을 비롯한 영장류를 감염시키지 않으므로 가장 일반적으로 작은 포유류, 특히 설치류 연구에 사용된다. (僞) 균주 PRV152는 증강 된 녹색 형광성 단백질 (EGFP) 리포터 유전자를 발현하고 만 역행 떨어져 감염 부위에서 2,3- 시냅스 연결의 계층 순서를 기능적 시냅스 십자가. 기타 PRV 균주는 별개의 미생물 학적 특성을 가지고 두 방향 (PRV-베커와 PRV-카플란) 4,5에서 전송 될 수있다. 이 프로토콜은 PRV152 독점적으로 다룰 것이다. 근육과 같은 말초 부위에서 바이러스를 제공함으로써, t로 바이러스의 침입을 제한 할 수있다뉴런의 특정한 세트를 통해 그 뇌. eGFP는 뇌 전반에 걸쳐 신호의 결과적인 패턴은 처음에 감염된 세포에 연결된 뉴런을 해결. (僞) 바이러스와 transsynaptic 추적의 분산 특성이 어려운 식별 된 네트워크 내에서 특정 연결을 해석한다, 우리는 사용하여 식별 세포 사이의 연결을 확인하기위한 바이오틴 덱스 트란 아민 (BDA)와 콜레라 독소 서브 유닛 B (CTB)를 사용하는 민감하고 신뢰할 수있는 방법을 제시한다 PRV152. 그들은 말초 돌기 6-11 포함한 세포 과정을 계시하는데 효과적이기 때문에 옥시다아제 및 DAB (3,3'- 디아 미노)와 BDA 및 CTB의 면역 검출을 선택 하였다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transsynaptic 추적은 다중 시냅스 회로를 통해 주변 대상을 조절하는 중앙 efferents를 분석하는 데 강력한 도구가되고있다. 이 방법은 가장 광범위 특히 약독 화 균주 PRV-Bartha은 1961에서 설명 돼지 병원체 (僞) 바이러스 (PRV)을 이용하여 쥐의 뇌에서 사용되어왔다 (12). 여기서는 특정 근육의 운동 피질 표현을 식별하기위한 프로토콜을 제시 또는 강화 된 녹색 형광 단백질 (eGFP는) 2 리포터 유전자 발현 (僞) 재조합 바이러스 균주 (PRV152)를 사용하여 근육 그룹. 한 방법은 간 시냅스가 기능 회로 3,4,13 내의 다른 신경 세포를 감염시킬 것을 전염성 자손을 생산 neurotropic 바이러스의 동작을 이용한다. PRV-Bartha과 동종이다 PRV152은 단지 거리에 감염 사이트 3,5 <에서 역행 시냅스 연결의 계층 순서를 통해 시냅스를 교차/ SUP>. 정확하게 감염의 외주 위치를 제어함으로써, 그 운동 뉴런의 특정 서브 세트를 통해 뇌에 바이러스의 침입을 제한 할 수있다. 바이러스 순차적으로 연결된 뉴런의 체인을 감염 같이, eGFP는 뇌 전반에 걸쳐 신호의 결과적인 패턴은 처음에 감염된 세포에 접속되어 신경 네트워크를 해결할 것이다.

신경 추적하는 바이러스를 사용하는 부가적인 이점은 감염된 세포 내에서 리포터 단백질 (이 경우 eGFP는)의 증폭이다. 이 신호 증폭에도 희소 돌기의 검출 감도의 허용 레벨을 제공한다. 예를 들면, 수염을 제어 안면 운동 뉴런에 vibrissa 모터 피질에서 희소 돌기 급속도로 표현 녹색 형광 단백질 (14)을 사용하여 래트에서 발견되었다; 이전의 연구는 리포터 유전자 증폭 11, 15 않고 고전 추적기를 사용하여이 투사를 찾지 못했습니다. 불행하게도많은 바이러스 추적 벡터는, 인용 된 연구에서 사용 된 것과 같은, 다중함으로써 시냅스 회로 추적을위한 이들의 사용을 제한하는, 시냅스 교차하지 않는다.

모터 회로에 참여하는 세포의 네트워크를 식별하기위한 고유 한 장점을 제시하고 있지만, transsynaptic의 분산 특성은 PRV-152 곤란 회로 내의 특정 연결을 해석하게하여 추적. 따라서, 우리는 바이오틴 덱스 트란 아민 (BDA)와 콜레라 독소 B 서브 유닛 (CTB)를 사용하여 이중 라벨에 의해 PRV-152을 사용하여 식별 회로 내의 특정 연결을 검증하기위한 간단한 방법을 제시한다. BDA와 CTB의 병용은 신경 6-8,11의 특정 세트 사이의 연결을 추적하는 잘 확립 된 방법입니다. 함께 사용되는 경우, 이들 두 추적자 2 색 DAB (3,3'- 디아 미노) 프로 시저 (16)를 사용하여 동일한 구역으로 시각화 될 수있다. 고 분자량 BDA (BDA10kDa)은이 프로토콜을 선택한 것이 Y 때문에신경 과정 6, 7의 상세한 라벨을 ields. BDA10kDa의 추가 장점은 다음과 같습니다 :이 우선적으로 선행 성 방향 6-8로 운송된다; 이는 이온 삼투압 또는 압입 6-8에 의해 전달 될 ​​수있다; 그것은 단순한 아비딘 - 바이오틴 HRP (ABC) 프로 시저 (17)에 의해 시각화 될 수있다; 그것은 빛 또는 전자 현미경 6,7,18에 의해 촬영 할 수 있습니다. 이 원위 수상 돌기 10,19 포함 세포 과정을 공개 효과적이기 때문에 퍼 옥시 다제 및 DAB와 CTB의 면역 화학적 검출의 motoneurons의 역행 라벨 선택되었다. 우리는 최근 생쥐의 보컬 모터 경로를 확인하고 이전에 20 부재로 가정 된 후두 운동 신경, 1 차 운동 피질에서 스파 스 연결을 나타 내기 위해이 방법을 사용했다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

참고 : 모든 동물 절차를 검토하고 듀크 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 보관 (僞) 바이러스

  1. 우리는 1 × 109 PFU / m의 역가에 프린스턴 대학에서 박사 린 Enquist의 실험실에서 라이브 바이러스 (PRV152)을 얻었다. 바이러스를 생성하는 2 프로토콜을 발표되었다.
  2. 적절한 바이오 안전성 조건에서 -80 ° C에서 BSL-2 바이오 안전성 캐비닛과 가게 내부 튜브 당 20 μL에서 바이러스를 나누어지는.
  3. 바로 주입하기 전에 PRV의 나누어지는을 녹여.

근육에 주사 2. 수술 준비

  1. (100 ㎎ / ㎏ 케타민 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진) 케타민 - 자일 라진의 근육 내 주사하여 전신 마취를 유도하고 이소 플루오 란을 사용하여 적절한 마취 평면을 유지한다.
  2. 안과 연고와 각막을 보호합니다.
  3. T 준비머리를 트리밍과 교류 Betadine의 스크럽 70 % 알코올 (3 사이클의 최소)로 수술 부위를 소독하여 무균 기술에 따라 그 수술 부위. 수술 영역을 커버하는 멸균 커튼을 사용하십시오. 절차 전반에 걸쳐 무균 기술을 준수해야합니다.
  4. 피부 절개를 확인하고 관심있는 근육을 알 수있다. 예를 들어, 첫 sternohyoid 근육의 상부 부분을 제거 할 필요가있다 cricothyroid 후두 근육에 액세스한다.
  5. VetBond 조직 접착제와 어떤 횡단 근육을 밀봉합니다.

근육에 PRV 3. 주입

  1. 34 G 스테인리스 스틸 바늘을 부착, 갓 해동 PRV 용액을 10 μL NanoFil의 마이크로 실린 체제를로드, 조심스럽게 정위 장치에 마운트.
  2. 천천히 죽은 공간을 취소하고 그 솔루션은 마이크로 실린 팁을 종료 확인합니다. bioharzard 폐기물 등의 유체 폐기하십시오.
  3. 정위 microp 사용ositioning 장치는주의 깊게 관심의 근육에 마이크로 실린 팁을 배치하고 약간의 붓기가 보일 때까지 천천히 근육을 입력합니다. 근육과 볼륨의 크기에 따라 달라질 분사량이 분사된다. 예를 들어, 4 NL / 초의 속도로 200 NL (1 μL 전체)의 다섯 주사 cricothyroid 근육을 채우기 위해 동일한 부위에 약 1 분 이격되어야한다. 관심 옆 근육 주사기 (여기서는 횡 cricoarytenoid)를 이동 및 주입 절차를 반복한다. 한 번만 각 근육에 구멍.
  4. 5 분 후에 마이크로 실린 후퇴.
  5. VetBond 조직 접착제를 사용하여 밴드의 틈을 밀봉합니다.
  6. 모든 주사가​​ 완료된 후, VetBond 조직 접착제를 사용하여 상처를 닫는다. 지역 institional 동물 사용 지침, 봉합이나 상처 클립에 따라이 사용될 수있다.
  7. 흉골 드러 누움까지 동물을 모니터하고 진통, 음식, 물을 제공하고, Y가 요구 신경우리의 기관 동물 사용 지침.
  8. 실험적으로 결정된 생존 시간 후 (이 경우 90 시간이 2 라벨 ND 피질 뉴런을 주문하기 위해), 펜토 바르 비탈 과다에 의해, 동물을 희생하고, 0.1 M PBS에서 4 % 포름 알데히드 이어 0.9 % 염수로 transcardially 관류.
  9. 제거하고 24 시간 동안 4 % 포름 알데히드의 뇌를 사후 수정.
  10. 최소 48 시간 동안 30 %의 자당을 함유하는 인산염 버퍼에 뇌를 Cryoprotect.

eGFP는 4. 면역 화학적 검출

  1. 슬라이딩 마이크로톰에 40 μm의에서 섹션을 잘라 0.1M PBS에 떠있는 부분을 저장합니다. 장착 섹션을 더럽히는 경우가 더 얇은 섹션, 30 μm의 예를 위해 사용될 수있다.
  2. 빛으로부터 보호 PBS에서 0.3 % H 2 O 2에서 30 분 동안 섹션을 끄다.
  3. PBS는 VECTASTAIN 엘리트 키트 정상 염소 혈청 0.3 % 트윈 20을 포함하는 30 분 동안 섹션이 아닌 특정 항원을 차단 (키트를 VE).
    4. 품어 토끼에서 3.5 시간 동안 안티 - eGFP는 (1000 1) 섹션을 차단.
  4. 실온에서 키트를 VE에서 다음 염소 항 - 토끼 이차 항체에 1 시간 동안 그들을 품어, 5 분 동안 섹션에게 PBS에 세 번 씻으십시오.
  5. 제조업체의 지침에 따라 키트를 VE에서 ABC 솔루션을 준비합니다.
  6. 실온에서 키트를 VE에서 다음 ABC 용액에 1 시간 동안 그들을 반응, 5 분 동안 섹션에게 PBS에 세 번 씻으십시오.
  7. 0.05 % DAB (3, 3'-미노)와 0.015 %의 H 2 O 2를 포함, 10 분 동안 인산 버퍼에 절을 세 번 씻어 인산염 버퍼에 8 분, pH가 7.4에 대한 개발.
  8. 등급 알코올 일련 마운트 SuperFrost 플러스 슬라이드 섹션 및 이들을 탈수 (70 %, 95 %, 100 %, 5 분마다 100 %).
  9. 두 크실렌 세척 (5 분마다)를 통해 섹션을 취소하고 Permount 장착 매체와 슬라이드를 coverslip에.
  10. 이미지 현미경에 장착 된 부분. DAB 반응 생성물 insid전자 세포는 갈색 나타납니다. 디지털화 된 이미지는 미세 공정을 강조 반전 색이 될 수 있습니다.

PRV 추적에 의해 발견 된 뇌 영역으로 트레이서 사출 5. 수술 준비

  1. (100 ㎎ / ㎏ 케타민 10 ㎎ / ㎏ 자일 라진) 케타민 - 자일 라진의 근육 내 주사하여 전신 마취를 유도하고 이소 플루오 란을 사용하여 적절한 마취 평면을 유지한다.
  2. 안과 연고와 각막을 보호합니다.
  3. 적절한 정위 프레임에 머리를 고정합니다.
  4. 머리를 트리밍과 교류 Betadine의 스크럽 70 % 알코올 (3 사이클의 최소)로 사이트를 소독하여 무균 기술에 따라 수술 부위를 준비합니다.
  5. 두피 절개를 확인하고 관심있는 뇌 영역을 통해 피부를 철회.
  6. 해당 정위 좌표에 작은 개두술을 수행합니다. 예를 들어, PRV는 추적을 식별 laryngeally 연결 운동 피질의 좌표N 성인 마우스는 1.2 mm의 측면과 브레 그마 0.2 mm의 주동이 있습니다.

뇌에 바이오틴 덱스 트란 아민 6. 주입

  1. 멸균 생리 식염수 333 μL에서 BDA의 25 밀리그램 (10,000 MW)을 용해하여 7.5 % 바이오틴 덱스 트란 아민 (BDA)를 준비합니다.
  2. 계획 주사에 대한 충분한 BDA 솔루션 Nanoject II의 마이크로 피펫 시스템을로드합니다.
  3. 천천히 죽은 공간을 취소하고 그 솔루션은 마이크로 피펫 팁을 종료되어 있는지 확인합니다.
  4. 마이크로 위치 정위 장치를 사용하는 것은주의 깊게 관심 뇌 영역에 마이크로 피펫 팁을 낮추고 BDA 천천히 주입. 영역의 크기에 따라 주사 속도가 표시되도록 조정한다. 예를 들어, 4.6 NL의 12 주사 떨어져 0.2 MM (rostro-꼬리 방향) 성인 쥐의 laryngeally 연결 운동 피질을 충당하기 위해 네 개의 다른 위치에있을 제작한다. 최종 주입 부피는 관심 뇌 영역의 크기에 따라 조정되어야레이블이 뇌 조직을 통해 레이블 뉴런의 과정을 따라 확산에 의해 주입 코어에서 확산 할 수 있음을 염두에두고.
  5. 치과 용 시멘트를 이용하여 개두술을 밀봉하고 VetBond 조직 접착제를 이용하여 두피에 상처를 닫는다.
  6. 흉골 드러 누움까지 동물을 모니터링하고 진통제, 음식, 물을 제공하고 기관 동물 사용 지침에서 요구하는 신경.

근육 콜레라 독소 B 서브 유닛의 사출 7.

  1. 멸균 생리 식염수 100 ㎕에 CTB 1mg을 용해시켜 1 % 콜레라 독소 B 서브 유닛 (CTB)를 준비한다.
  2. 엿새 동안 뇌에 BDA 주입 한 후, 근육에 PRV 주사에 대해 상술 한 바와 같이, 수술 준비를 수행합니다.
  3. 34 G 스테인리스 스틸 바늘을 부착, CTB 용액을 10 μL NanoFil의 마이크로 실린 체제를로드, 조심스럽게 정위 장치에 마운트.
  4. 이전에 해제로 관심의 근육 (들)에 microinjections를 수행PRV에 대한 스 크라이 빙.
  5. 흉골 드러 누움까지 동물을 모니터링하고 진통제, 음식, 물을 제공하고 기관 동물 사용 지침에서 요구하는 신경.
  6. 사흘 CTB 주입 후, 펜토 바르 비탈 과다하여 동물을 희생하고, 0.1 M PBS에서 4 % 포름 알데히드 이어 0.9 % 염수로 transcardially 관류.
  7. 제거하고 24 시간 동안 4 % 포름 알데히드의 뇌를 사후 수정.
  8. 최소 48 시간 동안 30 %의 자당을 함유하는 인산염 버퍼에 뇌를 Cryoprotect.

같은 섹션에서 BDA와 CTB 8. 검출

  1. 마이크로톰에 40 μm의에서 섹션을 잘라 0.1M PBS에 떠있는 부분을 저장합니다.
  2. 빛으로부터 보호 PBS에서 0.3 % H 2 O 2에서 30 분 동안 섹션을 끄다.
  3. 제조업체의 지침에 따라 키트를 VE에서 ABC 솔루션을 준비합니다.
  4. 다음 실온에서 ABC 용액에 1 시간 동안 그들을 반응, 5 분 동안 PBS에 절을 세 번 씻으십시오.
  5. 10 분 동안 인산염 완충액 섹션 세 번 씻고, 0.05 % DAB (3,3'- 디아 미노 벤지딘), 0.015 %의 H 2 O 2, 및 0.05 %의 염화 니켈을 함유하는 인산염 완충액에서 8 분, pH가 7.4에 대해 개발한다. 세포 내부의 DAB 반응 생성물은 검은 나타납니다.
  6. VECTASTAIN 엘리트 키트 정상 토끼 혈청 트윈 20 0.3 %를 포함하는 PBS에서 30 분 동안 차단 섹션.
  7. 실온에서 : 품어 염소에 2 시간 동안 안티 CTB (10,000 1) 섹션을 차단.
  8. 실온에서 키트를 VE에서 다음 토끼 항 염소 이차 항체에 1 시간 동안 그들을 품어, 5 분 동안 PBS에 절을 세 번 씻으십시오.
  9. 제조업체의 지침에 따라 키트를 VE에서 ABC 솔루션을 준비합니다.
  10. 다음 실온에서 ABC 용액에 30 분 동안 그들을 반응, 5 분 동안 PBS에 절을 세 번 씻으십시오.
  11. 0.05 % DAB (3, 3을 포함, 10 분 동안 섹션을 인산염 완충액에 세 번 씻어 인산염 버퍼에 최대 8 분, pH가 7.4에 대한 개발'-diaminobenzidine)와 0.015 %의 H 2 O 2. 세포 내부의 DAB 반응 생성물 갈색 나타납니다.
  12. 등급 알코올 일련 마운트 SuperFrost 플러스 슬라이드 섹션 및 이들을 탈수 (70 %, 95 %, 100 %, 5 분마다 100 %).
  13. 두 크실렌 세척 (5 분마다)를 통해 섹션을 취소하고 Permount 장착 매체와 슬라이드를 coverslip에.
  14. 이미지 현미경에 장착 된 부분.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

eGFP는 위해 염색하는 것은 근육에 PRV152를 주입 한 후 일차 운동 뉴런에 약 72 시간을 약한 신호를 보여주는 시작해야한다. 복제 및 바이러스의 transsynaptic 교통 titer-과 시간에 따라 4입니다. 약 90 시간 주입 후, eGFP는 염색은 2 차 순서에 감염된 세포에 강력한 신호를 공개합니다. 긴 생존 시간은 3 차 및 고차 세포를 공개하지만 생존 시간은 약 오일 접종 후 PRV의 치사에 의해 제한됩니다.

그림 1a는 PRV152는 후두 운동 신경, 일곱 후두 근육의 두 가지로 PRV152의 주사 후 94 시간 주택 핵 ambiguus에 eGFP는 표현에 감염된 신경을 보여줍니다. 바이러스가 감염된 근육, 같은 설하 핵 다른 phonatory 운동 신경 풀을, 신경을 분포시키다 신경을 통해 뇌에 입력하기 때문에, eGFP는을 표명하지 아니합니다 (그...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PRV152 4,21 이용한 실험을 계획 할 때 고려되어야 문제들이있다. 가장 중요한 것은, (僞) 바이러스는 치명적이다. 앞서 언급 한 바와 같이, 인간을 비롯한 영장류가 감염에 민감하지 않지만 적절한주의가 다른 동물을 보호하기를 기울여야한다. 성인 마우스는 일반적으로 5-7일 감쇠 PRV152 균주 접종 후 생존. 따라서, PRV152 1 주일 이상 생존 시간을 필요로 실험에 적합하지 않습니다. 또한, 감염된 동물은 일반적으로하여 정상적인 동작의 관찰을 필요로하는 실험 PRV152의 유용성을 제한, 생존 기간 동안 질병의 징후를 표시합니다.

또한, PRV152는 세포 독성 면역 반응 (22)을 트리거합니다. 바이러스의 복제 및 전송 시간에 따른 4 titer-하고 있기 때문에, 신경의 패턴 비라의 면역 검출에 의해 밝혀세포는 감염의 단계를 통해 진행으로 L 단백질 또는 eGFP는 리포터 유전자는 생존 기간의 과정을...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 후두 수술 기술을 가르치는, 고베 대학, 일본의 박사 토시오 테라지마 감사와 PRV-Bartha를 공급하는 프린스턴 대학의 박사 린 Enquist. 연구는 에리히 D. 자비스에 NIH 개척자 상 DP1 OD000448와 구스타보 Arriaga에 NSF 대학원 연구 활동 상에 의해 지원되었다. 적절하게 적립 이전의 연구에서 수치 저널의 편집 정책에 따라 PLoS의 하나 오픈 액세스 크리에이티브 커먼즈 라이선스 (CC-BY)에서 사용된다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약/재료회사카탈로그 번호코멘트
NanoFil microinjection systemWorld Precision InstrumentsIO-Kit34 G option
Stereotaxic frameDavid Kopf InstrumentsModel 900
Nanoject II Auto-Nanoliter InjectorDrummond Scientific Company3-000-204
슬라이딩 마이크로톰LeicaSM2010 R
[header]
VetBond3M1469SB
Isofluorane (Forane)Baxter 
Betadine 면봉 스틱Cardinal Health2130-01200 카운트
Permount 마운팅 매체Fisher ScientificSP15-500
SuperFrost Plus 슬라이드Fisher Scientific12-550-15
Biotinylated dextran aminesInvitrogenD-195610,000 MW
Pseudorabies virusLaboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University)PRV152역가 >1 x 107
Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat)List Biological Laboratories703
Cholera Toxin B SubunitList Biological Laboratories103B
Anti-eGFPOpen BiosystemsABS4528
3, 3'-diaminobenzidineSigma-AldrichD590510 mg 정제
에탄올시그마-알드리치E7023200 증거
포름알데히드시그마-알드리치F87754%과산화수소로 희석
시그마-알드리치H341030%
케타민 HCl & 자일라진 HCl시그마-알드리치K413880 mg/ml & 6 mg/ml
니켈 클로라이드시그마-알드리치339350
인산염 완충액시그마-알드리치P36191.0 M; pH 7.4
인산염 완충 식염수시그마-알드리치P549310x; pH 7.4
펜토바르비탈나트륨 시그마-알드리치P376150 mg/ml 용량
자당, 시그마-알드리치S9378
트윈 20시그마-알드리치P1379
크실렌,시그마-알드리치, 534056조직학적 등급
VECTASTAIN Elite, ABC 키트Vector LaboratoriesPK-6101 (토끼); PK-6105 (염소)
옵틱스케어 안과 연고Vet Depot1017992
이름 1001936060, , , , , , , ,

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Card, J. P., Enquist, L. W. Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, John Wiley & Sons Inc. Hoboken, NJ, USA. Multiple values selected 1.51-1.5.28 (2001).
  2. Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).
  3. Aston Jones, G., Card, J. P. Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations. Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).
  4. Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).
  5. Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice. Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).
  6. Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. Pathway tracing using biotinylated dextran amines. Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).
  7. Reiner, A., Honig, M. G. Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10). Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).
  8. Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies. Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).
  9. Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer. Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).
  10. Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods. Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).
  11. Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements. The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).
  12. Bartha, A. Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus. Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).
  13. Kuypers, H., Ugolini, G. Viruses as transneuronal tracers. Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).
  14. Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing. The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).
  15. Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. Input output organization of the rat vibrissal motor cortex. Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).
  16. Hsu, S. M., Soban, E. Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).
  17. Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).
  18. Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).
  19. Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).
  20. Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds. PLoS ONE. 7 (10), e46610(2012).
  21. Card, J. P. Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).
  22. Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes. Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).
  23. Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density. The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).
  24. Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits. The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).
  25. Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

BDAB

관련 논문