우리는 바코드 DNA 라이브러리 및 대규모 병렬 "다음 세대"염기 서열 임상 종양 표본의 주요 암 관련 변이의 검출에 대한 후속 하이브리드 기반의 엑손 캡처의 준비에 대해 설명합니다. 대상 엑손 시퀀싱 따라서 낮은 주파수 변이를 검출하는 높은 감도를 산출, 높은 처리량, 낮은 비용, 그리고 깊은 순서 범위의 혜택을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
키 종양 변이를 감지하고 조사하는 노력이 암 환자에 대한 적절한 치료를 촉진하는 중요한 입증했다. 높은 처리량의 설립, 대규모 병렬 "차세대"순서는 많은 이러한 돌연변이의 발견을 원조하고있다. 이 기술의 임상과 번역 유틸리티를 강화하기 위해, 플랫폼은 높은 처리량, 비용 효율적이며 성능이 저하되거나 손상된 DNA의 소량을 얻을 수있다 (FFPE) 조직 샘플 포함 된 포르말린 고정 파라핀과 호환되어야합니다. 여기, 우리는 대규모 병렬 염기 서열 냉동 및 FFPE 종양에서 암 관련 변이의 검출 대상 엑손 기반의 하이브리드 캡처 다음에 바코드 및 다중 DNA 라이브러리의 준비에 대해 설명합니다. 이 방법은 서열 변이의 식별을 가능하게 번호 변경을 복사하고, 모든 대상 유전자를 포함하는 구조 재 배열을 선택합니다. 대상 엑손 염기 서열은 t을 제공합니다그는 따라서 낮은 주파수 변이를 검출하는 높은 감도를 부여, 높은 처리량, 낮은 비용, 그리고 깊은 순서 범위의 혜택을 제공합니다.
서론
키 종양 유전자와 종양 억제 유전자의 "드라이버"종양 유전자 이벤트의 식별은 많은 암 (1)의 진단과 치료에 필수적인 역할을한다. 대규모 병렬 "차세대"염기 서열을 이용하여 대규모 연구 노력은 최근 몇 년에있는 많은 암 관련 유전자의 식별을 가능하게했다. 그러나 이러한 시퀀싱 플랫폼은 일반적으로 이와 같은 (FFPE) 종양 샘플 포함 된 포르말린 고정 파라핀 등의 보존 조직에서 DNA 돌연변이의 특성 및 분석의 주요 제한 포즈, 냉동 조직에서 분리 된 DNA의 많은 양을 필요로한다. 효율적이고 안정적으로 FFPE 종양 샘플에서 "실행 가능한"게놈 정보의 특성을 향상 노력은 이전에 둑 표본의 후 향적 분석을 가능하게하고 또한 암 관리에 대한 개별적인 접근 방식을 권장합니다.
전통적으로, 분자 Diagnostic 연구소는 DNA 돌연변이 프로파일에 대한 생어 시퀀싱 및 실시간 PCR 등의 시간이 소요되는, 낮은 처리량 방법에 의존하고있다. 더 최근에, 멀티 플렉스 PCR 또는 질량 분석 유전자형을 이용한 높은 처리량 방법은 키 암 유전자 3-5 재발 체세포 돌연변이를 조사하기 위해 개발되었다. 이러한 접근법은, 그러나, 단지 미리 지정된 "핫스팟"돌연변이는 종양 억제 유전자에서 불....
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프로토콜
1. DNA 및 시약 준비
참고 :이 프로토콜은 24 샘플 (예를 들면 12 종양 / 보통 쌍)의 동시 처리 및 분석을 설명하지만, 작고 큰 일괄 작업에 적용 할 수 있습니다. DNA 샘플은 FFPE 또는 냉동 조직, 세포 학적 표본, 또는 혈액에서 파생 수 있습니다. 일반적으로, 동일 환자에서 종양 및 정상 조직 둘 상속 다형성에서 체세포 돌연변이를 구별하기 위해 함께 파일링한다. 프로토콜은 즉시 DNA 추출을 따라 시작된다.
- 나누어지는 50 ~ 250 NG 1X 트리스-EDTA에 희석 샘플 당 추출 된 DNA (산도 8.0) 별도의 Covaris 둥근 바닥 튜브에 50 μL의 최종 볼륨에 버퍼 (250 권장 NG).
- 10 듀티 계수, 175 PIP 및 버스트 당 200주기 360 초 : 다음 전단 설정에 Covaris E220 악기의 DNA 전단.
- 실온으로 AMPure XP를 구슬로 장식한다 (표 2) 해동. 모든 BU 해동이전에 적절한 단계에 얼음 ffers과 효소.
2. 도서관 준비 - 최종 수리 모듈
- 샘플 당 다음 볼륨을 사용하여 살균 microce....
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결과
24 바코드 일련의 라이브러리 (12 종양 정상 쌍)의 한 수영장은 279 암 유전자의 모든 단백질 코딩 엑손에 해당하는 프로브를 사용하여 캡처 및 2 × 75 BP는 HiSeq 2000 흐름 세포의 단일 차선에 읽는 순서가되었다. 종양과 정상 라이브러리는 2:1의 비율로 풀링했다. 동결 된 종양 DNA 시료 풀의 샘플 성능 메트릭은 배향 율, 단편 크기 분포에 대한 대상 캡처 특이성, 및 표적 범위를 의미 포함한,도 1에 나타낸다. 예 체세포 돌연변이, 삽입, 삭제 및 복사 번호 변경은 그림 2-4에 나와 있습니다.
그림 1. 시퀀스 성능 메트릭의 .......
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토론
우리의 영향 분석은 높은 정렬 속도, 높은 곳에서 목표 속도, 높은 대상 범위 및 검출 돌연변이, 삽입이나 삭제, 및 번호 변경을 복사에 대한 높은 감도를 생산하고 있습니다. 우리는 냉동 모두의 시퀀스 DNA에 미치는 영향 분석의 능력을 증명하고 낮은 DNA 입력 FFPE 샘플을 보관했다. 키 암 관련 유전자의 엑손 타겟 시퀀싱을 수행함으로써, 하나함으로써 저주파 변이를 감지하는 능력을 최대화 이러한 가장 중요한 유전자의 엑손 서열에 대해 매우 깊은 커버리지를 달성 할 수있다. 바 코딩과 멀티플렉싱의 사용은 높은 처리량, 샘플 당 낮은 비용, DNA의 낮은 입력 양을 수 있습니다.
대상 접근 방식의 이점은 모든 엑손이 돌연변이 검출에 균일하게 충분히 덮여 캡처 프로브는 최적화 가능한 것입니다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 우리의 디자인은 279 유전자의 4535 개의 엑손을 포함한다. 에 반복적 인 개선에 따라우리의 디자인은, 일반적인 시퀀싱 실.......
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공개 사항
박사 버거는 기초 의학, 암 진단 회사에서 컨설팅 비용과 연구 기금을 받았다.
감사의 글
우리는 기술 지원을 박사 아그네스 알레와 MSKCC 유전체학 코어 실험실 감사합니다. 이 프로토콜은 제프리 Beene 암 연구 센터와 농부 가족 재단의 지원으로 개발되었다.
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재료
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참고문헌
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat. Rev. Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
- Thomas, R. K., Baker, A. C....
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