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방법 논문

초점 방사선 억제와 성인 시상 하부의 신경 발생의 기능 심문

11.8K 조회수

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DOI:

10.3791/50716

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2013년 11월 14일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology, California Institute of Technology, 2Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Neurology, and Ophthalamology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Radiation Oncology & Molecular Radiation Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Radiation Oncology, University Of Washington Medical Center, 5Institute for Cell Engineering and High-Throughput Biology Center, Johns Hopkins University School of Medicine

이 논문에서

요약

성인 태생 포유류의 신경 세포의 기능은 조사의 활성 영역 남아있다. 이온화 방사선은 새로운 뉴런의 탄생을 억제한다. 컴퓨터 단층 촬영 유도 초점 조사 (CFIR)를 사용하여, 특정 신경 전구 인구 입체 해부 타겟팅 이제 성인 신경의 기능적인 역할을 평가하기 위해 사용될 수있다.

초록

성인에서 태어난 뉴런의 기능적 특성은 중요한 과제로 남아. 침략 바이러스 배달 또는 형질 전환 동물을 통해 성인 신경을 억제하는 방법은이 연구에서 어려운 결과의 해석을 혼동 가능성이 있습니다. 새로운 방사선 도구 하나는 비 침습적으로 작은 동물의 정확하고 정밀한 해부학 적 타겟팅을 통해 성인에서 태어난 뉴런의 선택 그룹의 기능을 조사 할 수 있도록하는, 그러나 부상하고있다. 초점 전리 방사선은 새로운 뉴런의 탄생과 분화를 억제하고, 특정 신경 전구 지역 타겟팅 할 수 있습니다. 성인 시상 하부의 신경 생리 학적 과정의 조절에서 활약하는 잠재적 기능의 역할을 조명하기 위해, 우리는 선택적으로 시상 하부의 중간 예하 성인에서 태어난 뉴런의 탄생을 억제하는 비 침습적 초점 조사 기술을 개발했다. 우리는 C의 omputer하는 방법을 설명 단층 촬영 유도작은 동물을 대상으로 정밀하고 정확한 해부학을 가능하게하는 F OCAL IR 방사선 (CFIR) 배달. CFIR 지역화를위한 입체 체적 이미지지도를 사용하여 방사선 량의 대상으로 nontargeted 뇌 영역에 대한 방사선 노출을 최소화하고 날카로운 빔 경계 등각 선량 분포 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 하나의 성인에서 태어난 뉴런의 기능에 관한 질문을 할 수 있지만, 또한 방사선 생물학, 종양 생물학 및 면역학 분야의 질문에 영역을 엽니 다. 이러한 방사선 도구는 침대 옆에 벤치에서 발견의 번역을 촉진 할 것이다.

서론

최근 발견은 성인 포유류의 뇌가 가소성의 놀라운 학위를받을 수 있다는 것을 증명하고있다. 성인에서 태어난 뉴런은 포유류의 뇌 (1)의 전문 틈새 시장에서 성인을 통해 생성된다. 이러한 성인에서 태어난 뉴런의 기능은 무엇입니까? 그리고 더 많은 그래서, 그들은 생리학과 행동에서 어떤 역할을합니까? 이 주제에 대한 연구는 전통적으로 측면 심실과 해마의 subgranular 영역의 subventricular 영역에 초점을 맞추고있다, 그러나, 최근의 연구는 포유 동물의 시상 하부 2와 같은 다른 뇌 영역에 신경을 특징으로했다. 신경은 출생 후 및 성인 시상 2-10에서보고되었으며, 이들 신생 시상 하부 뉴런의 기능 조사의 활성 영역 남아있다.

성인에서 태어난 뉴런의 기능적 특성은 일반적으로 신경 과학 분야의 중요한 과제로 남아. 사양의 선택적 억제IFIC 신경 전구 인구는 하나의 신경 전구 인구 11에 고유 한 사용 가능한 분자 마커의 부족에 의해 제한 남아있다. 따라서, 유전자 타겟팅을 통해이 신경 전구 세포에서 성인에서 태어난 뉴런의 선택적 삭제가 어려운 남아있다. 마찬가지로, 성인에서 태어난 뉴런을 대상으로 바이러스 전달은 환경 (12)에 손상과 염증을 도입 잠재적 교란 변수에서 겪고있다.

새로운 방사선 도구 하나는 이러한 혼동을 회피하고 작은 동물의 정확하고 정밀한 해부학 적 타겟팅을 통해 이러한 문제를 조사 할 수 있도록하는, 그러나 부상하고있다. 이온화 방사선은 새로운 뉴런의 탄생과 분화를 억제하고 비 침습적 인 방법은 신경 전구 인구에게 13-15를 대상으로 할 수 있습니다. 최근에, 우리는 우리가 (HPZ)이 시상 하부의 증식 영역이라고 포유 동물의 시상 하부 중간 예하 (ME)의 싹 영역을 설명 . 우리는 젊은 성인 여성 쥐가 높은 지방 다이어트 (HFD)를 주어진 경우, HFD 먹인 쥐에서 신경의 수준이 ME 2 지역에서 공급 컨트롤 정상 차우 (NC)보다 훨씬 높은 것으로 나타났다. 시상 하부 내 안에 성인 신경이 신진 대사와 체중을 조절 여부를 테스트하기 위해, 우리는이 과정을 방해하기 위해 노력했다. 중간 예하 규제 호르몬이 출시되는 세 번째 뇌실의 바닥에 작은 일방적 인 구조입니다. 이 뇌 영역의 다른 생리 기능을 변경하지 않고 증식 및 후속 신경 발생을 억제하기 위해, 우리는 선택적 시상 중앙값 예하 2 새로 태어난 성인 뉴런의 탄생을 억제하기 위하여 비 침습적 초점 조사 기술을 개발했다.

그룹의 숫자는 표준 지역 14-28에 신경을 억제하기 위해 방사선을 사용했다. 그러나, 이전의 방사선 학적 접근 방법은 일반적으로 ofte 넓은 지역을 대상으로, 또는 한N 실수도 어려운 명확하게 특정 신경 전구 인구의 결함으로 관찰하는 행동 결함을 연결하고, 신경이보고 된 여러 뇌 영역을 대상으로. 더 많은 대상 조사의 기능은 29 ~ 36을 대상으로 정확한 해부학을 가능하게하는 F OCAL 빔 적외선 방사 (CFIR) 배달 C의 omputer 단층 촬영 유도 영상을 결합 방사선 플랫폼에 의해 제공됩니다. 직경 0.5 mm로 작은 방사선 빔은 특정 신경 전구 인구 (35)를 대상으로 사용할 수 있습니다. 이 방법은 우리가 시상 하부 ME를 대상으로 확산을 체포하고 작은 동물에서 신경을 차단할 수 있습니다. 이러한 전구 인구에 방사선 치료 후, 생리 및 행동 검사는 성인에서 태어난 세포의 잠재적 인 기능을 조명하기 위해 수행 할 수 있습니다. 초점 타겟팅 이후 우리의 응용 프로그램에 특히 중요합니다뇌하수체는 시상 하부의 중간 예하 부근에 있습니다, 뇌하수체의 조사는 호르몬 기능에 영향을 미칠 이후에 결과를 혼동 할 수 있습니다.

신경 다음과 같은 조사의 억제를위한 생물학적 기초는 여전히 불분명하게 남아있다. 이전 방사선 연구는 넓은 지역에 빔에 의존하고, 신경의 억제는 염증 반응 14, 37을 통해 매개되는 결론을 내렸다. 따라서 그것은 상당한 염증 반응을 연상하지 않기 때문에 높은 초점 조사가, 신경 발생을 억제 할 수 있을지 불확실하다. 그러나, 해마에서 고전 신경성 지역의 우리의 그룹에 의해 최근의 연구는 10 Gy의 복용량을 가진 매우 초점 조사는 조사 35 후 최소 4 주 동안 신경을 억제 할 수 있음을 증명하고있다.

중간 예하 성인 태생의 시상 하부 신경 세포의 기능을 심문하기 위해, 우리는 정밀 방사선 D를 사용ME에게 신경 발생을 억제하기 위해 작은 직경 방사 빔과 조합 CT 영상을 제공 할 evice. 360 °의 범위에서 회전 갠트리에 장착 X-선 튜브를 사용하여, 우리는 방사선 치료 동안 동물 대상의 회전 방향 (도 1)에게 허용 로봇을 제어 표본 스테이지의 사용으로 아크 빔 마이크로 조사 빔 전달 . 고분해능 X 선 검출기는 갠트리 수평 위치 (33)에있을 때 화상을 획득하는데 사용된다. 본 연구의 경우, CT 이미지는 0.20 mm의 등방성 복셀 크기로 재구성되었다. 동물이 처리 위치에있는 동안 온보드 CT 영상은 대상의 식별을 허용했다. 목표는 우리의 상용 방사선 플랫폼에 포함 된 CT 탐색 용량 계획 소프트웨어를 사용하여 지역화했다. CT 영상에 의해 우리의 투자 수익 (ROI)을 국산화 한 후, 동물은 네 개의 DEG가 로봇 시편 단계에서 적절한 치료 위치로 이동했다자유리스 (X, Y, Z, θ). 갠트리 로봇 단계 각도의 조합을 통해, 빔은 동물에 거의 모든 방향으로부터 전달 될 ​​수 있고, 정위 아크 같은 치료는 29이 가능합니다. 이들 및 다른 이미징 연구를 들어, 마우스는 이동을 규제하면서 이소 플루 란 마취 기체의 전달을 허용 고정화 장치에 배치 하였다. 고정 침대 CT 호환 가능하며, 로봇 표본 스테이지 (34)에 연결합니다.

우리는 CFIR는 연구 분야의 여러 개념의 진보를 제공 할 것으로 기대합니다. 우리는이 기술의 원리의 증거로 시상 하부 중간 예하의 방사선 학적 타겟팅을 사용하지만, CFIR은 원칙적으로 어떤 작은 모델 생물의 몸의 모든 지역을 대상으로 할 수 있습니다. 신경 과학에서, 예를 들어, 우리는이 기술 EXIS에 제안되어 활발히 증식 전구 개체군의 기능을 평가하기 위해 사용될 수있는 구상같은 지역 postrema 38, 39, subfornical 기관 (40), 뇌하수체 (41)와 같은 다른 circumventricular 기관에서 t. 성인 신경의 기능 역할에 관한 및 행동의 원인이되는 역할을 식별하는 오랜 논쟁은 이제 더 잘 해결할 수 있습니다. 가수에서,이 방법은 선택적으로 특정 뇌 영역에서 신경 발생을 억제하는 능력에 의해 방해 된 새소리 (42)의 견고하고 계절 동작을 유지 성인 신경의 역할을 해결할 수있다. 이 강력한 행동 모델을 이해하는 것은 다른 성적 동종 이형의 행동을 규제하는 성인 신경의 역할에 새로운 통찰력을 흘리다 수 있습니다. 또한, 신진 대사 필드에 CFIR는 간세포 증식의 역할과 신진 대사와 에너지 균형의 역할의 측면을 탐구 할 수 있습니다. 여러 연구 분야의 개념 사전의 가능성이 기술의 도입에 의해 강화된다.

, 우리는 초점 조사 빔의 대상으로 정밀 해부에 대한 CFIR의 기능을 보여줍니다. 우리가 처음에 우리의 연구에이 작은 동물 방사선 연구 플랫폼 (SARRP)을 개발하지만, 다른 유사한 장치는 이제 유사한 CT 유도 초점 조사 43, 44을 달성 할 수있는 상업적으로 이용 가능하다. 따라서, 우리는 오히려 SARRP에 대한 구체적인 것보다 모든 연구 플랫폼에 필요한 단계를이 CFIR 프로토콜을 일반화. 신경 발생을 억제하기 이전 방사선 접근법 이상의 CFIR의 장점은이 기술이 지역화 입체적인 체적 화상 안내를 허용하고 선량 타겟팅, 등각 선량 nontargeted 뇌 영역에 대한 노출을 최소화하고, 높은 정밀도 빔 형상을 가진 등각 선량 분포를 허용한다는 아르 날카로운 빔 경계. 우리는 특정 해부 영역에 용량을 대상으로 CT 유도 이미징을 사용하는 방법을 간략하게 설명하고, 이에 따라, 어떻게 방사선 시각화γ-H2AX, DNA 이중 가닥 나누기 35, 45 ~ 48의 마커에 대한 면역 조직 화학 염색을 이용하여 직접 조직에 분포 복용량. 신경성 틈새 시장을 선택적으로 조사를 위해이 방법을 사용하면 생리와 질병에 새로운 성인에서 태어난 뉴런의 기능적 역할을 드러내는 중요한 의미를 가질 수있다.

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프로토콜

동물 사용

표준 관리 및 사용 프로토콜에 대한 기관의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 얻습니다. 이전에 (그림 2) 2 바와 같이 현재의 프로토콜은, 5.5-10 주 이전 성인 C57BL6 / J 마우스에 초점 조사 연구를 위해 개발되었습니다. 그러나, 다른 연령대와 작은 동물 종 (쥐, 햄스터, 땅 다람쥐 등)도 이용 될 수있다, 효과적인 마취 프로토콜과 관심 (ROI)의 영역의 식별을 허용 방사선 기준 아틀라스를 사용할 수 있는지 제공.

1. CT 유도 방사선 플랫폼의 교정

각 콜리메이터 크기와 사용되는 X-선 튜브 필터의 종류에 미리 방사선 플랫폼에서 방사선 량에 대한 필름 기반의 교정을 수행합니다. 방사선 선량 계획 소프트웨어 (49)를 이용하실 사용 원하는 목표 부위에 조사 아크 빔을 대상으로하기 위해서는방사선 량에 따라 필요한 배달 시간을 계산하는 대부분의 상용 방사선 플랫폼에서 전자, 마우스의 CT 스캔에 따라 관심 (ROI)의 영역의 깊이, 그리고 로봇 플랫폼의 회전 속도,이에 대한 자세한 내용은 생략된다 이 프로토콜들은 방사선 플랫폼 사이의 차이로. CT 영상과 ventrobasal 시상 하부 2 (그림 3) 시각화의 목적을 위해, 1mm 알 여과와 0.4 mm의 초점 자리 100 KVP의 빔 에너지 X-선 튜브를 운영하고 있습니다. HPZ의 초점 조사의 경우, 치료에 0.6 cm의 조직 깊이에 방사선의 10 Gy의를 제공하기 위해, 225 KVP, 13mA에서 X-선 튜브, 0.15 mm 구리의 여과 1-mm 초점 자리를 작동 4.6 분의 시간. 다른 로아 사이의 대상으로하는 것은 다른 매개 변수를 계산해야합니다.

  1. 이전에 2 바와 같이 중간 예하에있는 신경에 높은 지방 다이어트의 효과를 공부하는 경우, 4 주 된 여성 C57B를 얻을잭슨 마우스 실험실에서 L6 / J 마우스, 케이지 당 집 네 마우스. 오주 이전에 높은 지방 다이어트에 보통 중국 사람 음식을 전환합니다. 마우스는 새로운 주거와 음식에 적응 할 수 있습니다. 5.5 주 이전에 CFIR 처리를 수행합니다. 교통 방사선 플랫폼을 포함하는 작업 방에 과목. 전송하는 동안 스트레스 수준을 최소화합니다. 이소 플루 란 가스 마취 챔버를 준비합니다. 그런 다음, 챔버에 하나의 마우스를 추가합니다. 병렬, 후 처리를 위해 가열 패드 (낮은 설정)를 준비하고 있습니다.
  2. 마우스 풋 패드 압축에 응답에서 더 이상 없다하면, 방사선 플랫폼의 제목을 가져오고 로봇 단의 고정 침대에 배치합니다. 물린 가드 (그림 1D)에 피사체의 코 콘 마취 컵에 입, 치아를 놓습니다. 고정 침대에 마우스 평면을 배치하고 응답하지 않는 문제를 계속 유지하고 있는지 확인합니다. 그렇다면, 거즈 테이프로 침대에 마우스를 아래로 테이프. 침대에 마우스를 아래로 테이핑 동안머리는 수평 평면에 수평하게되어 있는지 확인합니다. 이는 귀를 인상하고 평준화하는 경우 볼에 의해 결정될 수있다. 마우스가 올바른 위치에 오면, 리드 보호막을 닫는다.
  3. 마우스 제목의 3 차원 해부학 적 구조 검사를 제공하는 (이 플랫폼이 서로 다른 것) 실험의 방사선 플랫폼에 내장 된 소프트웨어를 사용하여 컴퓨터 단층 촬영 검사를 취득. 마우스 헤드가 수평면에 수평하게되어 있는지 확인합니다. 피사체의 머리가 수평 될 때까지 1.3 -하지 않으면 반복 1.2 단계를 반복합니다.
  4. CT 영상에서 ROI를 확인합니다. 도 3e에 도시 된 바와 같이 45 ° 각도를 수평면에 사용 ROI에서 두개골 표면에의 거리를 계산한다.
  5. 내장 소프트웨어를 사용하여,도 4a에 도시 된 바와 같이 위에서 마우스 피사체의 X-선을 가지고 간다. 그런 다음, 방사선 플랫폼에서 마우스를 제거 가열 패드에 넣어 활성화 될 때까지 모니터링 할 수 있습니다.
  6. 관상 CT 이미지에서 배달 투약을 결정하기 위해 적어도 세 가지 마우스의 평균 투자 수익 (ROI)의 해부학 적 깊이를 계산합니다. 조사의 10 Gy를가 ventrobasal의 시상 하부에 투여 한 이전 연구 2에서 예를 들어, (45 ° 각도) 두개골의 투자 수익 (ROI)의 깊이는 0.66 cm (그림 3E 참조). 것을 알면, 연구자들은 ROI하고자 노출량을 달성 치료 적절한 회전 속도와 길이를 계산하기 위해 자신의 플랫폼에 설치된 방사선 량 계획 소프트웨어 (DPS)를 사용했다.
  7. 용량 계획 소프트웨어로 치료 기간 및 로봇 스테이지의 회전 수를 결정한 후, 물 상당 플라스틱 모의 - 마우스 모델에 포함 GAFchromic 방사선 성 필름으로 계산 파라미터 선량 분포를 측정한다. 이 작업을 수행하는 네 개의 수직으로 적층 물에 해당하는 플라스틱 블록 29 등 사이에 세 GAFchromic 방사선에 민감한 필름을 포함도 4b에 도시.
  8. 로봇 무대에 GAFchromic 필름을 포함하는 모의 마우스 모델을 배치하고 새로 계산 된 매개 변수를 사용하여 초점 조사 빔을 실행합니다. 예를 들어, ventrobasal 시상 하부, 입력을 대상으로 0.15 mm의 구리 필터 225 KVP의 파라미터, ROI를 달성하기 13mA, 1-mm 직경의 방사선 빔 조정, 45 ° 갠트리 각도 1.3 ° / sec의 회전, 및 4.6 분 10 Gy의 방사선의 선량.
  9. 조사 후, 패턴 및 방사선 노출량의 강도에 대한 영화를 확인하십시오. ventrobasal의 시상 하부에 대응하는 등각 위의 필름, 등각 필름에 작은 선명 자리하고 등각 아래의 영화에서 가벼운 반지 어두운 반지 콘을 대상으로 열거 된 매개 변수를 사용하여 360 °의 각도 회전 조사 빔 행정부는 (그림 4B)을 준수해야합니다.
  10. 매개 변수가 교정 된에서 마우스 과목의 X-레이를 통해 등각 GAFchromic 필름을 슈퍼 임 포즈culated. 그림 (C)에 도시 한 바와 같이 등각의 조사 초점은 원하는 ROI 영역과 중첩한다.

다른 방법 : 뇌의 투자 수익 (ROI)을 대상으로 어려움이 지속되면, 요오드 대비 CT 이미지에서 심실의 시각화를 향상시키기 위해 막내 주입 사용합니다. 간결성을 위해,이 절차는이 프로토콜 중 남아 있지만, 이전에 (35), (50)을 설명한다. 요오드 대비 추가 심실 랜드 마크 (그림 5A)을 제공 할 것입니다.

2. 조사 빔의 정확도를 결정

또한 조직이, 35, 51에서 방사선 빔의 직접적인 시각화에 의해 CFIR 빔의 정확도를 확인한다. 이렇게하려면 γH2AX (51), 히스톤 단백질과 DNA 이중 가닥 나누기의 초기 마커를 검출하는 면역 조직 화학 염색을 수행합니다. 마우스 과목 transcardially 관류 및 조사 1 시간 이내에 수정해야합니다. 다음 irradiΥH2Ax의 ATION, DNA의 수리를 신속하게 계속 발생 및 수준은 35 현저하게 감소한다.

  1. 1.3 - 반복 1.1 단계를 반복합니다.
  2. 타겟은 CT에서 식별 된 후, 마우스 피사체 방사선 대금 빔이 대상을 정렬하는 로봇 제어하에 이동한다. 입력 계산 된 매개 변수 (회전 속도 및 치료의 길이가 원하는 용량을 달성하기 위해) 용량 계획 소프트웨어로 단계 1.6에서 치료를 시작합니다. 마우스가 수직 중심 축으로 회전하는 동안 갠트리가 수직에서 45 ° 지적과 치료가 제공됩니다.
  3. 조사 후, 마우스 주제에 transcardial 관류를 수행합니다. 일시간 52 내 관류를 수행합니다. 4 % PFA / PBS에서 관류, 침수 수정의 두뇌를 따라 부드럽게 4 ℃에서 하룻밤 바위
  4. 다음 날 아침, 파라 포름 알데히드 정착액을 제거하는 PBS 배에서 5 분 세척. 그런 다음, 4 ℃에서 로커에 1X PBS의 30 % 자당에 젖어
  5. 조심스럽게 4 ° C (우리를 바위ually 12 ~ 16 시간), 뇌 튜브의 바닥에 침몰 할 때까지. 이 cryoprotection 단계 역할을합니다. 뇌가 침몰하면, 초과 30 % sucrose/1x PBS 전송을 방지하기 위해 천공 숟가락으로 머리를 제거합니다. 빠르게 드라이 아이스에 매체를 동결에 포함. 피펫 팁과 동결 매체를 소용돌이 및 플라스틱 금형에 머리를 맞 춥니 다.
  6. 일단 완전히 냉동, 저장을 위해 -20 ° C 냉동고에 뇌 블록을 전송할 수 있습니다.
  7. 면역 조직 화학 염색을 수행 할 것입니다 날, 절은 관상으로 40 μm의 두께로, 얇은 붓으로 PBS를 포함하는 24 - 웰 플레이트에 떠. 섹션은 대상 지역의 조사 범위를 결정하기 위해 면역 염색에 대한 올바른 직렬 위해 보관해야합니다.
  8. 항원 검색 단계에 대비하여 물을 욕조에 80 ° C에 Prewarm 0.01 M 구연산 나트륨 용액. 동시에, 구연산 나트륨이 켜져있는 동안에는 5 분 세척 0.01 M PBS에 3 배 수행합니다.
  9. 구연산 나트륨 용액을 80 ° C에서되면, 뇌의 부분을 물속에 내가N 시트르산 나트륨 완충액. 1 시간 동안 80 ° C의 물을 욕조에 둡니다.
  10. 섹션을 제거하고 구연산 나트륨 용액을 실온에 도달 할 수 있도록, 다음 0.01 M PBS 세 5 분 세척을 수행합니다.
  11. 5 % 정상 염소 혈청을 포함하는 PBS - 트리톤에서 1 시간 동안 뇌의 부분을 차단합니다.
  12. 4 ℃에서 마우스 항 - 포스 포-H2AX 차 항체의 1:700 농도 5 % 정상 염소 혈청을 포함하는 PBS - 트리톤의 하룻밤 뇌 섹션을 품어
  13. 다음 날, 15 분 세척 0.01 M PBS - 트리톤의 3 배 수행합니다.
  14. PBS - 트리톤 2 시간 동안 1:500 농도에서 488 nm의 fluorphore가 결합 염소 항 - 마우스 이차 항체와 5 % 정상 염소 혈청을 포함하는 뇌의 부분을 품어.
  15. 15 분 세척 0.01 M PBS - 트리톤의 3 배 수행합니다.
  16. 핵을 시각화하는 10 분 동안 4 ', 6 - diamidino -2 - 페닐 인돌 (DAPI) 얼룩 (PBS에서 1:5,000)를 수행합니다. 그런 다음, PBS로 5 분 동안 뇌의 부분을 세척하십시오.
  17. 정전 채널을에 탑재arged 현미경은 PBS에 떠있는 부분에 슬라이드. 과량의 PBS를 닦아 슬라이드가 건조 할 수 있습니다. 장착 매체를 이용하여 커버 슬립을 슬라이드 및 슬라이드 실온에서 밤새 어두운 곳에서 건조 할 수있다.
  18. 형광 현미경으로 시리얼 코로나 섹션의 사진을 촬영합니다. ΥH2Ax 면역 염색 (녹색) 조사 사이트를 나타냅니다. DAPI (파란색) 핵 얼룩 (그림 5B)입니다.

3. 마우스의 준비 초점 조사에 대한 주제

ΥH2Ax 면역 염색 결과를 확인합니다. 일단 교정에 만족하고, 조사 빔의 대상으로 실험을 진행합니다. 이 시점에서, (빔 전달의 완료에 설치 동물에서) 마우스를 치료하기 위해 필요한 총 시간은 1-mm 빔 10 Gy의 치료를 위해 약 10 ~ 15 분이다.

  1. 잭슨 마우스 연구소에서 4 주 된 C57BL6 / J 암컷 생쥐를 주문하십시오. 주택 개의 케이지 당 마우스 및 정상 차우에서 음식을 전환오주 이전에 높은 지방 다이어트에. 귀 펀치 마우스는 그들에게 고유 한 식별 기호를 제공합니다. 매일 쥐의 상태를 모니터링합니다. 참고 : 그들은 CT에 아티팩트를 줄이 될 것 같은 금속 마커를 사용할 수 없습니다.
  2. 쥐에게 방사선 또는 가짜 치료 전날 무게. 스플릿 방사선 또는 모의 치료 두 코호트에 마우스와는 코호트 간의 중량의 유의 한 차이가 없음을 확인. 마우스 6 주 된 경우 치료의 날에, 마우스를 모두 닫고 다시 무게를 측정하고 그 질량을 기록한다. 조심스럽게 방사선 플랫폼에 모두 동료를 수송한다. 스트레스 수준을 최소화하기 위해주의하십시오.
  3. 이소 플루 란 가스 마취 챔버를 준비합니다. 이 생쥐, 모의 대조군 소정의 조사 그룹에서 하나, 다른 마취. 수술 후 치료에 대한 낮은 설정에서 설정 한 전기 패드를 준비합니다.
  4. 조사를받을 수있는 마우스 1.4 - 1.2 단계를 따릅니다. 치료가 진행되는 동안 가짜 마우스의 경우, 마취 챔버에 마우스를 유지. 쉬르 만들기대상이 CT에 확인 후 주변 방사선에 대한 효과가 방사선 배달 빔이 목표를 정렬하는 로봇 제어 마우스 대상을 이동, 높은 반영 될 수 있도록 전자가 마취 챔버는 CFIR 플랫폼 부근에 있습니다. 입력 용량 계획 소프트웨어에 매개 변수 (회전 속도 및 치료의 길이)를 계산 하였다.
  5. 조사 처리가 완료되면, 가열 패드에 가짜 및 조사 된 마우스 모두를 반환하고, 그들이 깨어 때까지 모니터링 할 수 있습니다.
  6. 동물 시설에 가짜 및 조사 된 마우스 모두를 반환합니다. 매일 모니터링합니다. 매 30 주 마우스의 무게를. 초기 BrdU의 노출 다음 BrdU의 및 신경 세포 마커 1 개월 면역 조직 화학 염색의 colabeling로 그룹 사이에 대상 시상 하부의 증식 영역의 조사를 확인하려면 BrdU를 복강 내 주사를 관리 (50 ㎎ / ㎏) 삼일 후 처리 및 검사 신경 (그림 6) 2.

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결과

평가 CT 유도 타겟팅 및 정확도

시스템의 기계적 교정은 다양한 각도에서 빔 모두가 한 점에서 교차하는 것을 확보하는 데 아주 중요합니다. 교정은 엔드 - 투 - 엔드 얼라인먼트 정밀도가 0.2 mm (29) 인 것으로 측정되었다 반자동 이미징 기반 방법으로 수행 하였다. 시상 하부 중간 예하 구조의 볼륨이 작기 때문에 이러한 정확도는 매우 중요하다. 이 교정을 테스트하기 위해, 우리는 물에 해당하는 플라스틱 모형 마우스 모델 35 (그림 4B)에 포함 GAFchromic 방사선 성 필름으로 선량 분포를 측정 하였다. 간단히 마우스 피사체의 CT 스캔을 찍은, 우리 ventrobasal 시상 대상 사이트가 확인되었다. 배송 및 회전 속도를 계산하고, 적절한 시준 및 여과를 10 Gy의 방사선이 전달되었다되도록 부착 하였다. 물 equivalen에서 디자인 목업 마우스 모델 GAFch...

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토론

CT 유도 초점 조사 (CFIR)은 CT-가이드 (32)를 사용하여 로봇 제어에 작은 동물 대상으로 방사선 필드를 제공 할 수있는 소설과 전체 시스템 접근 방식입니다. 작은 동물 모델에 매우 집중 빔을 제공하는 CFIR의 기능은 실험실 연구와 임상 번역을 연결하는 새로운 연구의 기회를 제공합니다. 이 논문은 특히 시상 하부의 신경 전구 인구를 대상으로 정확한 방사선 전달을위한 CFIR 방법을 설명합니다. 우리는 면역 조직 화학 염색에 의해 X-선 필름을 통해 뇌 조직에 방사선 전달의 특이성을 측정하고 확인하는 방법을 여기에 보여줍니다.

또,이 기술은 특정 뇌 영역에서 신경 발생을 억제하는 방법을 보여준다. 우리는 우리가 인접 구조물에있는 신경의 수준을 변경하지 않고, 중간 예하에 신경을 ventrobasal의 시상 하부를 대상으로하고, 억제 할 수 있다는 것을 보여줍니다. M의 억제E의 신경은 신진 대사와 활동의 변화뿐만 아니라, 가짜 치료 그룹에 비해 조...

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공개 사항

JW는 Xstrahl, 주식 회사와 연구 자금 및 상담 계약을 체결 한

감사의 글

우리는 기술적 인 조언과 지원을위한 C. Montojo, J. 레예스, 그리고 M. 갑옷 감사합니다. 이 작품은 (DAL에) 건강 보조금 F31의 NS063550의 미국 국립 연구소, 바질 오코너 초보 학술 상과 (SB에) Klingenstein 기금과 NARSAD에서 교부금에 의해 지원되었다. SB는 의학 연구에 WM 켁 고유 젊은 학자.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
SARRP 연구 플랫폼XstrahlRS225Ahttp://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
SARRP 조사 벙커Xstrahl선택 사항이지만 방사선 노출은 대체 납 차폐
GAF 크롬 필름IPSGAFchromic ETB2로 포함되어야 합니다.
마우스 팬텀Gammex457Gammex에서 0.5cm x 30cm x 30cm 고형 슬라브를 구입하여 원하는 크기로 자릅니다.
마우스 anti-phospho-histone H2AX Ser139 항체Millipore, Inc.05-636클론 JBW301
고지방 설치류 다이어트연구 다이어트D12492i칼로리의 60%를 지방으로 조사해야 하며, 음식
IsofluraneBaxter Healthcare Corporation10019-360-40
0.01 M 구연산나트륨Fisher Scientific500ml 탈이온수에 용해된 구연산나트륨 1.471g
Superfrost Plus 슬라이드Fisher Scientific12-550-15
DAPIFisher Scientific핵 원염색
실장 매체Fisher ScientificVectashield 또는 Gelvatol이 선호
은 됩니다.

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