검출 시각화 및 아메바 모델 시스템에서 활성 산소 종의 생성을 정량

요약

우리는 정량적 연구를위한 각종 아메바 및 포유류의 세포 모델에 적용 할 수있는 활성 산소 종 (ROS)의 측정을위한 일련의 프로토콜을 채택.

초록

활성 산소 종 (ROS)는 동적으로 상호 전환 또는 하나 촉매 또는 자발적으로 제거하는 반응과 짧은 수명, 산소 함유 분자의 범위를 포함한다. 때문에 대부분의 ROS와 그 소스와 세포 내 현지화의 다양성의 짧은 제품 수명에 완전한 그림은 프로토콜의 조합을 사용하여주의 측정에 의해 얻어 질 수있다. 여기에서, 우리는 OxyBurst 그린 (OBG)를 사용하여 세 가지 다른 프로토콜의 집합 코팅 구슬, 또는 dihydroethidium (DHE)를 제시하고 Amplex UltraRed (AUR)는 질적 및 양적 같은 Dictyostelium의 등 전문 식세포의 다양한 ROS를 모니터링 할 수 있습니다. 우리는 동적으로 단일 세포 수준에서 intraphagosomal ROS의 생성을 시각화하는 비즈 코팅 절차 및 사용 OBG 코팅 구슬과 라이브 현미경을 최적화. 우리는 E.에서 지질 다당류 (LPS)를 확인 Dictyostelium의에서 ROS의 생성을위한 자극제로 대장균. 또한, 우리는 거라고eveloped 실시간 정량적으로 각각 세포 내 과산화물 및 세포 H ₂ O _2의 생산을 측정하기 위해 DHE와 AUR를 사용하여 중간 처리량 분석.

서론

활성 산소 종 (ROS)는 같은 호스트 방어, 신호, 조직 개발 및 부상에 대한 응답뿐만 아니라 고혈압과 암과 같은 생물 학적 과정의 다양한 참여하고 있습니다. 잘 공부 phagosomal의 NADPH 산화 효소 기계는 호중구 'phagosomes를 ¹ 섭취 박테리아를 죽이고, 산화 버스트로 알려진 신속한 ROS 생성에 최선을 다하고 있습니다. 또한, 미토콘드리아 호흡 사슬의 부산물로서 전자의 누출은 이전에는 ROS의 규제 소스에 대한 책임을 져야하는 것으로 생각되었다. 그러나 최근에는 마우스 대 식세포 ² 박테리아의 intraphagosomal 살인에 기여하는 중요한 메커니즘으로 확인되었다. 최근 몇 년 동안, 사회 아메바, Dictyostelium의는 타고난 면역 반응의 세포 고유의 메커니즘을 연구 할 수있는 강력하고 인기있는 모델이되고 있습니다. 실제로, Dictyostelium의 인간 식세포는 molecula 보전의 놀라 울 정도로 높은 수준을 공유박테리아, 말림을 감지하고 ^{3,4 살인에} 대한 책임을 R의 기계. 단백질과 같은 NADPH 산화 효소, 카탈라제, 슈퍼 옥사이드 dismutases으로 ROS의 생산 해독 관련 효소의 동족체는, 인간과 Dictyostelium의

프로토콜

1. 시각화 및 phagosomes를있는 ROS 생산의 질적 측정

OBG - 코팅 된 비드를 미리 준비한다. 비즈 코팅 절차 및 한천 오버레이 기술은 출판 참조 ^5,14에서 적응됩니다.

1. 1.5 ML 튜브에 3.0 μm의 카르 실리카 비드 (약 1.8 × 10 ⁹ 구슬) 1 ㎖ 현탁액을 추가, 비즈 빠른 스핀과 소용돌이로 교반하여 1 ㎖의 PBS로 3 배 씻는다.
2. 25 ㎎ / ㎖ 시안 아미드를 (공유 BSA를 prelabeled 바인딩 카르 실리카 비드를 활성화하는 방법)를 포함하는 PBS 1 ㎖에 구슬을 재현 탁, 15 분 동안 바퀴에 품어.
3. 커플 링 버퍼의 1 ㎖로 세척 배 빠른 스핀으로 (0.1 M 붕산 나트륨, 산도 8.0) (또는 5 초 동안 테이블 탑 미니 원심 분리기의 최대 속도로 원심 분리기 또는 테이블 톱 원심 분리기에서 1 분 2,000 XG에 원심 분리기)와 과량의 시안 아미드를 제거하는 텍싱.
4. C 500 μL로 세척 구슬을 혼합OxyBurst 그린 (OBG) H2HFF (디 하이드로-2 ', 4,5,6,7,7'- hexafluorofluorescein)-BSA의 1 ㎎을 함유하는 버퍼를 oupl....

결과

된 phagosomes에 ROS의 생성은 현미경 (파일 S1)에 의해 성적으로 동적으로 시각화 할 수 있습니다. 알렉사 형석 594에 의해 방출되는 적색 형광은 pH를 구분하고 OBG의 산화 녹색 채널의 형광을 증가하는 동안, phagosomal 환경에서 일정하게 유지된다. 체외의 방출 스펙트럼은 산화 nonoxidized OBG 코팅 비드 산화 후의 강도의 상당한 증가를 나타내는,도 1b에 비교된다. 라이브 이벤트의 시각화를 용이하게하기 위해, 두 채널이 흡수 1 분 이내에 야생형 AX2 세포에 의해 합병 식균 작용 동안 오렌지 적색에서 결과 색상 변경됩니다. 녹색 형광의 증가는의 phagosome에 가능 직접 ROS의 생성을 나타냅니다. 마이크로 플레이트 리더, 세포 내 과산화물의 매체 처리량 정량적 측정 세포 및 H를 사용하여 ₂ O ₂ 생산 Figu에 나타낸다각각 2C

토론

전술 한 방법에 비해, OBG 분석법 동적 대신 세포 집단에서 보통 ROS 신호 측정, 단일 세포 수준에서 phagosomal ROS 생성의 과정을 시각화한다. 이러한 인구 평균 방법은 비동기 식균 작용에 의한 중요 정보를 모호하게하는 경향이있다. 우리는 성공적으로 Dictyostelium의에 DHE와 AUR 분석을 적용하고 프로토콜을 최적화. 가장 중요한 것은, 우리는이 두 가지 분석에 의해 측정 된 유형과 ROS의 세포 내 현지화를 지정했습니다. 이와 함께, Dictyostelium의에 대한 ROS 측정 프로토콜의 전체 집합은 선천성 면역, 세포 분화 및 세포 내 신호로 ROS와 관련된 세포 메커니즘을 연구하기 위해 유용하고 강력한 시스템을 제공합니다.

OBG 분석의 경우, 코팅 된 비드의 제조는 실험의 성공에 중요하다. 때문에 포유류의 수용체 매개 식세포 이해의 복잡성N 전지, 입자는 섭취를 트리거 (예 : IgG를 포함).......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
REAGENTS
OxyBURST Green H2HFF BSA	Invitrogen	O-13291
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-20004
Carboxylated silica beads	Kisker Biotech	PSi-3.0COOH
HL5C 매체	ForMedium	HLC0102
LoFlo 매체		LF1001
Bacto 한천	BD	204010
디 하이드로 에티	듐 시그마	37291-25MG
Amplex UltraRed	Invitrogen	A36006
양 고추 냉이 과산화 효소	Roche	10108090001
Diethyldithiocarbamate (DEDTC)	시그마	D3506-100G
카탈라제	시그마	C9322-1G
시안아미드	시그마	187364-25G
지방다당류	시그마	L2630-25G
EQUIPMENT
ibidi μ-접시 35 mm, 높은	ibidi	81156	광학적으로 투명한 플라스틱으로 만든 바닥
MatTek 접시 35 mm	MatTek corporation	P35G-1.5-14-C	바닥은 유리 커버슬립
홀 셀 카운터	Merck Millipore PHCC00000
White 96 웰 플레이트	Nunc	236108
원심분리기	SORVALL	Legend RT
Microplate 리더	BioTek	Synergy Mx