이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

DmWRNexo를 특성화하기 위한 형광 기반 엑소뉴클레아제 분석, human progeroid WRN 엑소뉴클레아제의 orthologue 및 다른 뉴클레아제에 대한 응용

4.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50722

⸱

2013년 12월 23일

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Oxford

이 논문에서

요약

엑소뉴클레아제는 게놈 안정성을 보장하는 데 중요한 역할을 합니다. WRN 엑소뉴클레아제 기능의 손실은 조기 노화를 초래합니다. in vitro에서 뉴클레아제의 기질 및 기타 요구 사항을 연구하면 in vivo에서 뉴클레아제의 역할을 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 여기에서는 뉴클레아제 활성을 측정하기 위한 빠르고 재현 가능한 형광 기반 분석을 시연합니다.

초록

WRN 엑소뉴클레아제는 DNA 복제 중 또는 내인성 또는 외인성 제유전자 독소에 노출된 후 발생하는 DNA 손상을 해결하는 데 관여합니다. 이는 일시적으로 정지된 복제 분기점에서 축적될 수 있는 재조합 중간체의 축적을 방지하는 역할을 할 가능성이 높으며, 이는 WRN이 결핍된 세포의 하이퍼 재조합 표현형과 일치합니다. 인간의 경우, 엑소뉴클레아제 도메인은 DNA와 단백질 상호 작용에 중요한 추가 부위와 함께 헬리카제 활성을 가진 훨씬 더 큰 단백질의 N-말단 부분으로 구성됩니다. 대조적으로, 초파리에서 WRN(DmWRNexo)의 엑소뉴클레아제 활성은 추정 헬리카제와 구별되는 유전적 위치에 의해 암호화되어 게놈 안정성 메커니즘에서 엑소뉴클레아제 활성의 역할을 생화학적(및 유전적) 해부할 수 있습니다. 여기에서는 정제된 재조합 DmWRNexo 및 말단 표지된 형광 올리고뉴클레오티드를 사용하여 WRN 엑소뉴클레아제 활성을 측정하는 형광 방법을 보여줍니다. 이 시스템은 기질 올리고뉴클레오티드가 수개월 동안 안정적으로 유지되기 때문에 방사성 분석보다 재현성이 뛰어나며, 뉴클레아제 활성의 상세 분석을 위한 더 안전하고 비교적 빠른 방법을 제공하여 뉴클레아제 극성, 진행도 및 기질 선호도를 결정할 수 있습니다.

서론

뉴클레아제는 세포에서 손상된 DNA를 제거하고, 홀리데이 접합(Holliday junction)과 같은 비이중 구조를 분해하며, DNA 중합효소 내에 내재되어 있거나 DNA 중합효소에 외재되어 있는 DNA 복제 중 교정 능력을 제공하는 데 중요한 역할을 합니다1. 뉴클레아제는 자유 말단에서 DNA를 순차적으로 분해하거나(엑소뉴클레아제) 더 긴 DNA 분자 내에서 내부 포스포다이에스테르 결합을 절단하여(엔도뉴클레아제) 작용할 수 있습니다. 뉴클레아제 활성의 손실은 매우 특이적인 게놈 불안정성 표현형을 초래할 수 있습니다. RecQ helicase family member BLM의 돌연변이는 자매 염색체 교환의 비율이 과도하게 높아지고 암 발병률이 전 세계적으로 높아지는 반면(Payne 및 Hickson검토 2), 관련성이 높은 WRN 단백질의 돌연변이는 조기 노화를 유발합니다3; 이 두 패밀리 구성원 사이의 가장 큰 차이점은 WRN4에 3'-5' 엑소뉴클레아제 도메인이 있다는 것입니다. 게놈 안정성 유지에 있어 WRN 엑소뉴클레아제의 중요한 역할에 대한 증거는 WS 환자5의 유전자형 분석과 인간 세포의 점 돌연변이 및 결실 연구를 통해 축적되었으며, 분리된 엑소뉴클레아제도메인 6에 대한 결정학적 연구로 뒷받침되었습니다. 그러나 WRN의 엑소뉴클레아제 활성과 중앙 헬리카제 활성7 사이의 협력 및 혼선은 각각의 기능과 게놈 안정성에 대한 상대적 기여도를 구분하기 어렵게 만듭니다. 식물 및 하부 메타 동물 동물에서, WRN 엑소뉴클레아제 활성은 헬리카제 활성이 결핍된 단일 폴리펩티드에 존재합니다8-10 (Cox 및 Boubriak11에서 검토됨). 애기장대에서 이 엑소뉴클레아제가 동족 WRN 헬리카제와 협조적으로 작용하여 척추동물 WRN9에서 관찰된 결합된 효소 활성을 효과적으로 재구성한다는 것이 생화학적으로 입증되었습니다. 우리는 우수한 유전 도구를 통해 전체 유기체 수준과 발달을 통해 엑소뉴클레아제 돌연변이의 영향을 분석할 수 있기 때문에 초파리에서 WRN 엑소뉴클레아제를 연구했습니다(추정 동족 헬리카제에 영향을 미치지 않음)10,12. 또한, 우리는 재조합 초파리 WRN 엑소뉴클레아제(DmWRNexo)를 복제, 발현 및 정제하여 효소 특성의 완전한 생화학적 분석을 가능하게 했습니다13,14.

in vitro 뉴클레아제 분석은 전통적으로 방사선 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행되었으며, 아크릴아미드 겔4,8,15에서 제품의 래더링을 찾아 분해를 평가했습니다. 민감하기는 하지만, 이러한 분석은 표지된 기질의 방사성 붕괴로 인해 매일 정량적으로 재현할 수 없습니다. 또한 방사성 시약의 취급 및 폐기는 심각한 환경 및 건강 문제를 야기합니다. Radiolabel의 소싱 또한 점점 더 문제가 되고 있습니다. 최근의 대안적인 방법은 질량 분석법16에 의해 최종 분해 생성물의 양을 평가합니다. 그러나 시간이 많이 걸리고(며칠 소요), 특수 장비가 필요하며, 판독값은 최종 산물(단일 뉴클레오티드)의 양이므로 효소 진행성과 같은 측면의 민감한 측정이나 일부 뉴클레오티드, 염기서열 또는 변형으로 인해 뉴클레아제 일시 중지 또는 중단이 발생하는지 여부를 결정하는 데 적합하지 않습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 기존의 겔 기반 분석을 형광 올리고뉴클레오티드 기질과 함께 사용하도록 조정하여 장기간에 걸쳐 재현성 있게 사용할 수 있는 안정적으로 표지된 기질을 생성하여 다양한 조건에서 뉴클레아제 활성을 직접 비교할 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

1. 기질 올리고뉴클레오티드의 제조

  1. 맞춤형 올리고뉴클레오티드를 합성합니다.
    1. 5' 공액 플루오레세인 분자를 가진 하나의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 설계하십시오. 이것은 모든 기질의 중추 역할을 할 것입니다. (이것은 3'-5' 엑소뉴클레아제에 대한 것입니다. 5'-3' 극성 엑소뉴클레아제의 경우 3'-conjugated backbone strand를 사용합니다.) 극성을 알 수 없는 경우 3'와 5'를 모두 테스트해야 합니다.
    2. 형광 표지된 올리고뉴클레오티드에 어닐링될 때 선택되는 이중 기질이 형성되도록 상보적인 가닥을 설계합니다. 상보적 가닥은 형광단에 접합되어 있지 않습니다. 주문할 때 PAGE-purification을 지정하십시오(탈염으로는 충분하지 않음).
    3. 올리고뉴클레오티드 스톡은 10mM, 1nmol/μl, -20°C 및 어두운 곳에 보관합니다.
  2. 백본 표지 올리고뉴클레오티드를 각 상보적 인 표지되지 않은 올리고 뉴클레오티드와 1 : 1.2 몰 비율로 혼합합니다 : 표지되지 않은 완충액 (10 mM Tris-HCl pH 7.6, 1 mM EDTA pH 8.0, 50 mM NaCl). (참고: 1:1 비율이 가장 바람직하지만 라벨링된 모든 가닥이 바인딩되는 것이 더 중요합니다. 1:1 - 1:1.5의 비율이 작동할 수 있습니다.)
  3. 수조 또는 열 블록을 95 ° C로 가열하고 어닐링 혼합물을 3 분 동안 넣은 다음 전원을 끄고 전체를 30 ° C 이하로 천천히 (1 ° C / 분) 냉각시킵니다.
  4. 0.05% w/v 과황산암모늄(APS) 및 0.005% v/v TEMED로 중합된 1x Tris-Borate-EDTA(TBE, 89mM Tris 염기, 89mM 붕산, 2mM EDTA)의 천연 10% 폴리아크릴아미드 겔(10% 19:1 아크릴아미드:비스-아크릴아미드)에서 생성된 이중 기판을 실행하여 라벨링된 올리고뉴클레오티드의 완전 어닐링을 확인합니다. PhosphorImager를 통해 시각화합니다(아래 섹션 5 참조).

2. 아크릴아미드 겔의 제조

  1. 젤 주조 시스템(예: 16cm x 18cm 플레이트와 1.5mm 스페이서가 있는 Hoefer SE400 젤 리그)을 설정합니다.
    1. 유리판과 스페이서는 세제와 물을 사용하여 철저히 청소하십시오. 일관된 젤 형성을 방해할 수 있는 손가락의 기름으로 플레이트를 더럽히지 않도록 깨끗한 장갑을 착용하십시오.
    2. 다량의 증류수(탈이온수)로 플레이트를 헹구어 세제 잔여물을 제거한 다음 보푸라기가 없는 티슈(예: Kimwipes)로 닦습니다.
    3. 마지막으로 70% 에탄올을 뿌리고 닦아내십시오 - 유리판이 깨끗하면 삐걱거려야 합니다. 마지막 에탄올이 증발할 수 있도록 똑바로 세워 두십시오.
    4. 젤 형성 장비의 나머지 부분을 증류수(필요한 경우 세제를 먼저 사용)로 청소하고 건조시킵니다.
    5. 유리판과 스페이서를 겔 형성 장비에 조립하여 시스템이 누출되지 않는지 확인합니다.
  2. 젤 용액을 원하는 폴리아크릴아미드 비율로 준비합니다.
    1. 뉴클레아제 분석의 경우, 1x TBE에 8M 요소가 포함된 변성 14% 폴리아크릴아미드 겔을 사용합니다.
    2. 100ml(누출이 많은 2개의 젤에 충분)를 만들려면 넓은 비커에 48.05g의 요소를 넣고 35ml 40% 19:1 아크릴아미드 용액과 10ml 10x TBE(890mM Tris, 890mM 붕산, 20mM EDTA, pH 8.3, NaOH)를 추가합니다. 주의: 장갑을 착용하십시오 - 아크릴아마이드는 강력한 신경독입니다. 교반 막대와 마그네틱 교반 플레이트를 사용하여 요소를 용해합니다(시간이 좀 걸립니다).
    3. 용해되면 100ml에 milliQ-탈이온수를 추가합니다. 0.22μm 멤브레인을 사용하여 필터 살균합니다. 즉시 사용하지 않을 경우 흡입 장비를 사용하여 잠시 가스를 제거하고 어두운 곳에 보관하십시오(며칠 보관). 요소가 침전되므로 냉장 보관하지 마십시오.
  3. 겔을 중합하고 주조합니다.
    1. 우레아-아크릴아미드를 취하고 0.5ml 10%(w/v) 과황산암모늄(APS, 증류수로 구성)과 50μl TEMED를 추가합니다. 용기를 천천히 소용돌이쳐 공기(중합을 억제함)를 전달하지 않고 혼합하고 젤 포머에 붓습니다. 빨리 행동하지 않으면 붓기가 끝나기 전에 젤이 굳을 수 있습니다.
    2. 적절한 빗을 추가하여 샘플 로딩을 위한 웰을 형성합니다(분석할 겔 리그 및 샘플 번호에 따라 선택됨(예: 15개 또는 29개의 톱니 빗은 Hoefer 겔 리그와 함께 사용하기에 적합함). 빗 이빨 아래에 기포가 없는지 확인하십시오.
    3. 설정하도록 두십시오. 누출을 모니터링합니다. 완전 중합은 대기와의 접촉으로 인해 빗에서 지연됩니다. 웰이 단단해지면 나머지 젤이 굳어집니다.
    4. 빗을 제거하고 물과 피펫을 사용하여 중합되지 않은 아크릴아마이드를 헹굽니다.
  4. 달리기를 위해 젤을 설정하십시오.
    1. 캐스트 젤을 겔 러닝 시스템에 넣고 적절한 양의 1x TBE 러닝 버퍼를 하부 챔버와 겔 웰에 추가합니다. 이제 젤을 로드할 준비가 되었습니다.

3. His-tagged 재조합 DmWRNexo 단백질의 준비

  1. DmWRNexo 단백질의 박테리아 발현
    1. 접종 루프를 사용하여 -80°C로 유지되는 글리세롤 스톡의 표면을 긁어내어 박테리아를 수집합니다(박테리아는 pIVEX2.3d-DmWRNexo로 변형된 E. coli T7 Iq LysY(NEB)임). 50μg/ml 암피실린을 함유한 LB-한천 플레이트(트립톤 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 5g, 증류수와 pH 7.4로 조정한 1L로 최대 1L로 만든 한천 15g)에 암피실린을 넣습니다. 37 ° C에서 밤새 뒤집어 배양합니다.
    2. 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하여 50ml LB(트립톤 10g, 효모 추출물 5g, 증류수로 최대 1L까지 만든 NaCl 5g)에 50μg/ml 암피실린(물로 만들고 0.22μm까지 필터 멸균)을 보충합니다. 하룻밤 동안 220rpm 37°C에서 흔들면서 성장합니다.
    3. LB-ampicillin 1.8L(적절한 통기를 보장하기 위해 2L 원뿔형 플라스크 3개에 각각 600ml의 분취량)를 하룻밤 동안 50ml 배양하고 OD600 ~ 0.8로 성장시킵니다. IPTG를 최종 농도 0.7mM에 첨가하고 4-8시간 동안 진탕하면서 26°C(단백질 응집 방지를 위해)에서 배양합니다.
    4. 8,000rpm, 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 수확합니다 - 각각 300ml 세포 현탁액이 있는 6 x 500ml 멸균 플라스틱 원심분리기 병을 사용합니다. 상등액을 버리고 펠릿을 원래 LB-amp의 소량(10ml)에 재현탁하고 15ml Falcon 튜브로 옮긴 다음 5,000rpm에서 다시 스핀하여 세포를 펠렛화합니다 - 상등액을 다시 제거하고 -80°C에서 동결합니다(용해에 도움이 됨).
  2. 세균성 세포 용해
    1. 1ml 5M NaCl, 1ml 1M DTT, 200μl 1M 벤자미딘 및 1ml 10mg/ml 라이소자임(증류수에 재현탁액)을 함유하는 3.2ml 용해 완충액을 구성합니다.
    2. 300ml 박테리아 현탁액에서 파생된 각 펠릿에 320μl 용해 완충액을 추가합니다. 가능한 한 많이 재현 중단하십시오 - 'sawn-off' p1000 팁을 사용하여 저어주고 위아래로 피펫팅합니다. 얼음 위에서 20분 동안 배양합니다. 100μl 용해 완충액을 추가로 추가하고 잘 혼합한 다음 재현탁된 용해물을 가능한 한 많이 마이크로분리 튜브로 옮깁니다(점성이 매우 높아 피펫팅이 어렵습니다).
    3. 4°C의 예냉각된 마이크로퓨지 로터에서 14,000rpm으로 용해물을 30분 동안 원심분리한 다음 상층액을 재조합 단백질이 포함된 깨끗한 마이크로분리 튜브로 가져갑니다.
  3. His-trap 정화
    1. 시약 준비: 컬럼 분획을 수집하는 데 사용할 40mM, 60mM, 100mM, 300mM 및 500mM 농도의 이미다졸 각각에 대해 5개의 마이크로분리 튜브를 라벨링합니다(예: 라벨 40-1, 40-2, 40-3 등). 얼음에 튜브를 뚜껑이 열린 랙에 보관하십시오(그러나 다른 모든 것을 준비하는 동안 깨끗하게 유지하려면 접착 필름 또는 이와 유사한 것으로 느슨하게 덮으십시오). 1x PBS (8g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24g KH2PO4, pH 7.4로 조정하고 증류수로 최대 1L)를 희석제로 사용하여 25ml 범용 튜브에 20mM 이미다졸 25ml와 다른 농도의 이미다졸 10ml 스톡을 구성합니다.
    2. 적절한 부피의 2M 이미다졸 원액을 사용하여 박테리아 용해물을 20mM 이미다졸로 조정하고 20mM 이미다졸을 사용하여 부피를 최소 1ml(<5ml)로 조정합니다.
    3. Luer Lock이 있는 5ml 또는 10ml 주사기를 사용하여 1ml His-Trap 컬럼(Amersham)을 10ml MilliQ 물로 세척한 다음 PBS로 구성된 20mM 이미다졸 10ml를 통과시켜 컬럼을 평형화합니다(위의 3.3.1단계 참조).
    4. 용해물을 컬럼에 로드합니다. 용해물이 컬럼에 로드되면 상당한 역압이 발생할 수 있습니다. 이것은 지극히 정상입니다. 주사기에 너무 많은 힘을 가하고 싶은 유혹을 느끼지 말고 꾸준하고 균일한 압력을 유지하십시오. 용해물이 컬럼에 들어갈 때 가벼운 색상 변화를 보는 것이 일반적입니다. Sterilin 옥주 병(7ml 용량)에 흐름을 모아 얼음에 보관하십시오.
    5. 20mM 이미다졸 10ml로 컬럼을 세척하고 이를 '세척'이라고 표시된 얼음 위의 25ml 범용 튜브에 수집합니다.
    6. 컬럼을 통해 40mM 이미다졸 5ml를 통과시켜 각 마이크로분리 튜브(40.1, 40.2, 40.3 등으로 표시됨)에 1ml 분획을 수집합니다. 1ml를 측정할 수 있으므로 주사기의 플런저를 주의 깊게 관찰합니다.
    7. 지금 다시 각 소금 농도에 5 x 1 ml 분수를 모으는 60 mM, 100 mM, 300 mM 및 500 mM imidazole의 각각 5 ml를 순차적으로 통과하십시오.
  4. column fraction 분석
    1. 점 얼룩 : 니트로 셀룰로오스 시트에 각 열 분획의 2 μl를 점으로 찍습니다 (또한 로드, 흐름 및 세척) - 부드러운 연필을 사용하여 그리드로 미리 설정하면 더 쉽습니다). 자연 건조시키십시오. 0.2% v/v Tween 20으로 PBS로 구성된 5% 무지방 분유를 실온에서 15분에서 1시간 동안 차단하여 점 블롯을 처리한 다음 PBS-Tween에서 여러 번 세척하고 PBS-Tween에서 1:500으로 희석된 HRP-anti-his 항체로 30-60분 동안 배양합니다. PBS-Tween 다음에 PBS로 광범위하게 세척하고 Hyperfilm MP에서 시각화된 향상된 화학발광(ECL)을 사용하여 결합 항체를 검출합니다. 이 dot blot은 SDS-PAGE 분석 전에 피크 분획에 대한 훌륭한 아이디어를 제공하며 필요한 경우 후속 정제 단계를 알릴 수 있습니다(예: 단백질 안정성이 문제인 경우 dot blot 결과를 기반으로 피크 분획을 풀링하고 겔 여과 컬럼에 바로 로드할 수 있습니다. 아래 3.5단계 참조).
    2. SDS-PAGE : 50 μl 2x SDS-PAGE 로딩 염료 (4 % w / v SDS, 20 % v / v 글리세롤, 120 mM Tris-HCl pH 6.8, 200 mM DTT)를 포함하는 표지 된 마이크로 분리 튜브에 각 컬럼 분획의 50 μl를 수집합니다. 이 샘플을 95-100°C에서 5분 동안 끓입니다(가열된 뚜껑이 없는 핫 블록을 사용하는 경우 튜브가 가열될 때 '폭발'하는 것을 방지하기 위해 좁은 게이지 주사기 바늘로 각 튜브의 뚜껑에 작은 구멍을 만드십시오). 각 컬럼 분획 10μl를 10% SDS-PAGE 미니겔로 주입하고 Coomassie brilliant blue로 염색하여 단백질의 피크 분획률과 % 순도를 확인합니다. 필요한 경우, SDS-PAGE에 의해 분리 된 단백질을 니트로 셀룰로오스로 옮김으로써 his 태그가 지정된 단백질에 대한 웨스턴 블롯도 가능합니다. PBS-0.2% Tween 20에서 5% 무지방 우유로 멤브레인을 막은 다음 점 블롯에 대해 HRP 접합 항-his 항체(1:500)로 세척하고 프로브합니다.
  5. 순도를 높이기 위해 his-trap 컬럼의 피크 분획을 풀링하여 염 증가에서 용출된 Superdex 75 겔 여과 컬럼에 로드할 수 있습니다(앞서 설명한 바와 같이 Boubriak et al.13 및 Mason et al. 14).

4. 뉴클레아제 분석

  1. 기판의 작업 재고를 만드십시오.
    1. 반응당 20 pmol 기질을 사용하므로(이는 해결해야 할 질문에 따라 달라질 수 있음) 편리한 작업 재고는 200 pmol/μl(즉, 10x)입니다. 작업 재고는 소량의 어닐링 버퍼 (10 mM Tris-HCl pH7.6, 1 mM EDTA pH 8.0, 50 mM NaCl) 또는 10 mM Tris-HCl pH 7.0 (최대 pH 8.5, 뉴클레아제에 따름) 효소 민감도 또는 분석에 따라 염 또는 EDTA가없는
      2. .
    2. 4 °C에서 어두운 곳(호일로 싸서 보관)하십시오. 기질은 duplex integrity 또는 형광 신호의 손실 없이 몇 주 동안 지속됩니다.
  2. 비색 분석에 의한 엑소뉴클레아제 단백질 농도 분석 또는 Abs260에서 UV 분광법을 분석합니다.
    1. -80 °C의 작은 부분 표본에 보관하십시오.
    2. 샘플이 한 번 동결/해동된 경우 단백질 미스폴드 비율이 5%라고 가정하고(또는 분석할 각 단백질에 대해 경험적으로 정의) 그에 따라 농도를 조정합니다.
    3. 두 번의 동결/해동 주기 후 엑소뉴클레아제 활성을 분석하기 위해 단백질을 폐기하고 각 실험에 대한 단백질 상태를 기록합니다.
  3. 샘플에 대한 마스터 믹스(MM) 수량을 설계, 실험 및 계산합니다.
    1. 샘플 간 변동을 줄이기 위해 테스트 중인 샘플에 공통적인 모든 구성 요소(일반적으로 효소 또는 기질을 제외한 모든 것)를 포함하는 MM을 만듭니다.
    2. MM을 구성할 때 피펫팅 오류를 허용합니다(예: (N + 0.1N) 샘플에 대해 충분하게 만들어 N 샘플에 대한 부피 계산).
    3. 효소 1 pmol과 기질 20 pmol을 포함하는 20 μl/샘플의 총 부피에서 반응을 설정합니다(최적화 전 기본값 - 분명히 양은 테스트 대상에 따라 다릅니다. 예를 들어 효소 농도의 테스트 효과를 테스트하는 경우 효소 양을 변경합니다). DmWRNexo의 경우, 뉴클레아제 활성을 위한 최적의 완충액은 40mM Tris-HCl pH 8.0, 4mM MgCl2, 5mM 디티오트레이톨, 0.1mg/ml 분자생물학 등급 BSA를 포함하는 것으로 경험적으로 밝혀졌습니다.
  4. 반응을 설정합니다.
    1. 모든 시약은 4°C(얼음 양동이 또는 크라이오랙)로 유지합니다.
    2. 마스터 믹스를 구성하고 적절한 수의 멸균 DNase가 없는 0.5ml 마이크로분리 튜브로 분취합니다. 초기 기질을 시각화하기 위해 효소가 없는 대조군을 포함합니다(비분해 대조군).
    3. 효소 활성에 적합한 온도로 열 블록을 설정합니다(37°C, 최종 시점 30분이 DmWRNexo에 최적이지만 이는 다양한 온도 및 시간 범위에서 선택한 효소의 활성을 비교하여 경험적으로 결정해야 할 수도 있음). 완충액에 일반적으로 존재하는 잠재적인 효소 억제제는 신중하게 검사해야 합니다(예: EDTA는 과잉 ATP14와 마찬가지로 DmWRNexo를 억제하며, 이는 아마도 뉴클레아제 활성에 중요한 Mg2+의 킬레이트화에 의한 것으로 추정됨). 고농도의 이미다졸(>300mM)도 DmWRNexo 효소 활성에 영향을 미치지 않으며 형광을 소멸시키지도 않습니다.
    4. STOP 용액(80% 포름아미드, 1x TBE)을 구성합니다. 이것은 3배입니다. 여기에는 필요한 경우 브로모페놀 블루와 같은 염료가 포함될 수 있습니다. RT에 보관하십시오.
    5. 가열 블록 근처에 다음을 설정하십시오 : 반응 혼합물에 첨가 할 최종 시약 (일반적으로 효소); 1-10 μl 피펫터 및 팁, 타이머, cryorack 또는 얼음 양동이, STOP 용액.
  5. 반응을 시작합니다.
    1. 첫 번째 튜브에 효소를 추가하는 타이머를 설정합니다. 튜브를 열 블록에 놓습니다.
    2. 적절한 간격으로 나머지 튜브에 효소를 계속 첨가하십시오. (15초는 STOP 용액만 완료하면 되는 간단한 반응에 충분합니다.) 효소가 첨가되자마자 가열 블록에 넣으십시오.
  6. 반응을 멈춥니다.
    1. 타이머가 정확한 시간(예: 15분)에 도달하면 첫 번째 샘플에 10μl STOP 용액을 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 얼음 위/냉동 선반에 즉시 놓으십시오.
    2. 각 반응이 정확히 동일한 배양 시간을 갖도록 적절한 시간 간격과 설정된 순서와 동일한 순서로 반응을 계속 중지합니다.
  7. 이제 샘플이 준비된 변성 겔에 로드할 준비가 되었습니다.
    1. 정확한 피펫팅을 위해 겔 로딩 팁을 사용하여 각 샘플의 절반(또는 전체)을 로드합니다. 반응에 사용된 올리고뉴클레오티드 수준에서, 반응의 절반은 시각화를 위한 양호한 출력을 제공하고 반복을 실행할 수 있습니다(예: 초기 겔이 올바르게 실행되지 않는 경우).
    2. 염료(예: 브로모페놀 블루)가 포함된 1x STOP 용액을 하나 이상의 레인에 로드하여 겔이 어떻게 작동하는지 확인하는 것이 편리합니다.
    3. 알려진 크기의 형광 올리고뉴클레오티드는 크기 마커로 샘플과 함께 실행될 수 있습니다.
  8. 젤을 실행합니다.
    1. 상단 러닝 버퍼 챔버를 겔 장치에 추가하고 러닝 버퍼(1x TBE)로 채워 샘플이 방해받지 않도록 합니다. 버퍼 누출을 확인하십시오.
    2. 젤 리그를 전원 공급 장치에 연결하고 150-200분 동안 또는 브로모페놀 블루 염료(사용하는 경우)가 젤 아래의 약 2/3가 될 때까지 200V(정전압)에서 실행합니다(이 백분율 젤에서 약 10nt DNA 수준으로 실행됨). 분리를 왜곡하거나 방지할 수 있는 버퍼 누출을 모니터링합니다.
    3. 젤을 중지하고 작동 중인 장치에서 제거합니다.

5. 겔 분석 및 이미징

  1. 사용할 Imager의 감도를 결정합니다(예: Fuji FLA-3000 PhosphorImager/Fluorescence Imager는 F473의 가장 높은 감도 설정과 50μm의 가장 작은 픽셀 판독(해상도)을 사용하여 파란색 1000nm 레이저를 사용하여 플루오레세인의 형광을 감지할 수 있습니다.
  2. 젤을 스캔합니다.
    1. 스페이서와 젤 플레이트 1개를 조심스럽게 제거합니다. 다른 젤 플레이트에 남아 있는 젤을 철저히(그러나 조심스럽게) 헹구어 스캔을 방해할 수 있는 침전된 요소의 흔적을 제거합니다.
    2. 플레이트(젤이 부착된 상태)를 젤 홀더의 유리면에 젤 다운으로 놓고 이미저에 놓습니다. 유리에 있는 젤의 좌표를 기록하십시오(전체 표면을 채우지 않는 경우).
    3. 연결된 컴퓨터에서 해당 소프트웨어를 열고 젤이 있는 스캔 영역의 표시된 영역을 스캔합니다. 5.1단계에서와 같이 결정된 최상의 조건을 사용합니다. 결과 파일은 비교적 크지만(몇 MB) 필요한 경우 이미지를 자르고 압축할 수 있습니다.
    4. 저장한 다음 분석 소프트웨어에서 읽을 수 있는 파일로 내보냅니다(예: ImageJ를 사용하여 분석을 위해 .tiff로 내보내기).
  3. 데이터를 분석합니다.
    1. 성공적인 엑소뉴클레아제 분석은 올리고뉴클레오티드를 따라 형광단을 향해 순차적으로 기질의 분해를 일으켜 겔에 형광 DNA 단편의 특징적인 사다리 같은 패턴을 생성합니다. 겔에서 더 높은 이동성을 가진 종(더 멀리 달리는)은 분해되지 않은 시작 기질보다 작기 때문에 엑소뉴클레아제 분해의 산물을 나타냅니다.
    2. ImageJ의 'Gels' 도구를 사용하여 각 샘플에서 엑소뉴클레아제 활성에 따른 분해 수준을 결정하기 위해 이동성에 따라 각 레인에 있는 종의 상대적 강도를 정량화합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

엑소뉴클레이스(exonuclease) 활성의 in vitro 분석을 수행하려면 실제 분석 외에도 여러 가지 준비 단계가 필요합니다. 절차의 개요는 그림 1에 나와 있습니다.

형광 기반 엑소뉴클레아제 분석을 수행하기 전에, 적절한 형광 이미지 시스템을 사용하여 urea-acrylamide 젤에서 분리된 형광 표지 올리고뉴클레오타이드 기질의 검출을 최적화하는 것이 매우 중요합니다. 필터 선택은 전체 분석의 민감도에 상당한 영향을 미칠 수 있으므로 매우 중요합니다. 본 연구의 올리고뉴클레오타이드 기질은 fluorescein으로 표지되었으므로 470 nm에서 흥분하고 520 nm에서 방출되는 필터가 필요합니다. 이 필터를 사용하여 이미지 장치의 민감도와 해상도를 모두 조정함으로써 저농도의 기질(또는 생성물)에 대한 검출 능력을 높일 수 있습니다(그림 2A 및 2B). 필터 대역폭에...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

정제된 단백질의 엑소뉴클레아제 활성을 측정하려면 DNA 절단 산물의 분석이 필요합니다. 엑소뉴클레아제에 의한 DNA의 순차적 절단은 아크릴아미드 겔에서 표지된 절단 산물을 분리하여 시각화할 수 있습니다. 역사적으로 이것은 방사성 표지(예: 32P 또는 35S)로 DNA 기질의 말단 표지를 포함했지만 방사성 표지 사용에 내재된 단점(비용, 안전 문제 및 시간 경과에 따른 불안정성)이 있었습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 우리는 형광 표지된 DNA 기질을 사용하는 엑소뉴클레아제 분석을 개발했으며, 초파리 멜라노가스터, DmWRNexo10의 WRN 엑소뉴클레아제 정통로그의 뉴클레아제 활성을 결정하는 데 있어 분석 시스템의 유용성을 보여줍니다. 우리 분석의 주요 이점은 형광 표지된 기질이 시간이 지남에 따라 안정적이므로 예를 들어 정제된 재조합 엑소뉴클레아제의 서로 다른 배치를 비교할 때 더 큰 재현성과 표준화를 제공한다는 것...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작업에 자금을 지원해 준 협의회 간 New Dynamics of Ageing Programme[ES/G037086/1]과 Fuji FLA-3000에 접근한 Dave Sherratt 교수(옥스퍼드 대학교 생화학과)에게 감사드립니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Reagent/Material
Custom oligonucleotidesEurogentecPAGE 정제를 통해 고순도 e.e.로 얻을 필요가 있습니다.
5'FLOfluoresescein-5' GAACTATGGCTCTC
GAGTGCTAGGACATGTCTGA
CTACGTACACAAGTCACC - 3'bubble
5'- GGTGACTTGTACGT
AGTCAGACATGTCCTAGCAC
TCGAGAGCCATAGTTC-3'40
% 19:1 아크릴아미드 용액Severn Biotech20-2400-05주의: 강력한 신경독이므로 항상
장갑을 착용해야 합니다.His-Trap 컬럼 (1 ml)GE Healthcare17-5247-01
기타 모든 시약평판이 좋은 공급 업체분자 생물학 등급이 필요합니다 (DNase-free); 마이크로 fuge 튜브는 마찬가지로 DNase 및 RNase-free
Equipment< / strong>
Hoefer SE400 겔 장치HoeferSE400-15-1.5
FLA-3000 (형광체 및 형광 이미저)Fuji
Image Reader V2.02FujiFilm
이미지 게이지 V3.3FujiFilm
은 이어야합니다

참고문헌

  1. Mason, P. A., Cox, L. S. The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing. Age (Dordr. 34, 1317-1340 (2012).
  2. Payne, M., Hickson, I. D. Genomic instability and cancer: lessons from analysis of Bloom's syndrome). Biochem. Soc. Trans. 37, 553-559 (2009).
  3. Yu, C. E., Oshima, J., Fu, Y. H., Wijsman, E. M., Hisama, F., Alisch, R., Matthews, S., Nakura, J., Miki, T., Ouais, S., et al. Positional cloning of the Werner's syndrome gene. Science. 272, 258-262 (1996).
  4. Huang, S., Li, B., Gray, M. D., Oshima, J., Mian, I. S., Campisi, J. The premature ageing syndrome protein, WRN, is a 3'-->5' exonuclease. Nat. Genet. 20, 114-116 (1998).
  5. Goto, M. Syndrome-causing mutations in Werner syndrome. Biosci. Trends. 2, 147-150 (2008).
  6. Perry, J. J., Yannone, S. M., Holden, L. G., Hitomi, C., Asaithamby, A., Han, S., Cooper, P. K., Chen, D. J., Tainer, J. A. WRN exonuclease structure and molecular mechanism imply an editing role in DNA end processing. Nat. Struct. Mol. Biol. 13, 414-422 (2006).
  7. Opresko, P. L., Laine, J. P., Brosh, R. M., Seidman, M. M., Bohr, V. A. Coordinate action of the helicase and 3' to 5' exonuclease of Werner syndrome protein. J. Biol. Chem. 276, 44677-44687 (2001).
  8. Plchova, H., Hartung, F., Puchta, H. Biochemical characterization of an exonuclease from Arabidopsis thaliana reveals similarities to the DNA exonuclease of the human Werner syndrome protein. J. Biol. Chem. 278, 44128-44138 (2003).
  9. Hartung, F., Plchova, H., Puchta, H. Molecular characterisation of RecQ homologues in Arabidopsis thaliana. Nucleic Acids Res. 28, 4275-4282 (2000).
  10. Saunders, R. D., Boubriak, I., Clancy, D. J., Cox, L. S. Identification and characterization of a Drosophila ortholog of WRN exonuclease that is required to maintain genome integrity. Aging Cell. 7, 418-425 (2008).
  11. Cox, L. S., Boubriak, I. DNA Instability in Premature Aging, in DNA Damage Repair, Repair Mechanisms and Aging. Thomas, A.E., Eds. Nova Science Publishers. , 1-34 (2010).
  12. Cox, L. S., Clancy, D. J., Boubriak, I., Saunders, R. D. Modeling Werner Syndrome in Drosophila melanogaster: hyper-recombination in flies lacking WRN-like exonuclease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1119, 274-288 (2007).
  13. Boubriak, I., Mason, P. A., Clancy, D. J., Dockray, J., Saunders, R. D., Cox, L. S. DmWRNexo is a 3'-5' exonuclease: phenotypic and biochemical characterization of mutants of the Drosophila orthologue of human WRN exonuclease. Biogerontology. 10, 267-277 (2009).
  14. Mason, P. A., Boubriak, I., Robbins, T., Lasala, R., Saunders, R., Cox, L. S. The Drosophila orthologue of progeroid human WRN exonuclease, DmWRNexo, cleaves replication substrates but is inhibited by uracil or abasic sites : Analysis of DmWRNexo activity in vitro. Age (Dordr). , (2012).
  15. Machwe, A., Xiao, L., Orren, D. K. Length-dependent degradation of single-stranded 3' ends by the Werner syndrome protein (WRN): implications for spatial orientation and coordinated 3' to 5' movement of its ATPase/helicase and exonuclease domains. BMC Mol. Biol. 7, 6 (2006).
  16. Mangerich, A., Veith, S., Popp, O., Fahrer, J., Martello, R., Bohr, V. A., Burkle, A. Quantitative analysis of WRN exonuclease activity by isotope dilution mass spectrometry. Mech. Ageing Dev. 133, 575-579 (2012).
  17. Xue, Y., Ratcliff, G. C., Wang, H., Davis-Searles, P. R., Gray, M. D., Erie, D. A., Redinbo, M. R. A minimal exonuclease domain of WRN forms a hexamer on DNA and possesses both 3'- 5' exonuclease and 5'-protruding strand endonuclease activities. Biochemistry. 41, 2901-2912 (2002).
  18. Machwe, A., Ganunis, R., Bohr, V. A., Orren, D. K. Selective blockage of the 3'-->5' exonuclease activity of WRN protein by certain oxidative modifications and bulky lesions in DNA. Nucleic Acids Res. 28, 2762-2770 (2000).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

DmWRNexoWRNDNA
DmWRNexo를 특성화하기 위한 형광 기반 엑소뉴클레아제 분석, human progeroid WRN 엑소뉴클레아제의 orthologue 및 다른 뉴클레아제에 대한 응용
문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.