Burkholderia의 속의 구성원은 임상 중요성 병원균이다. 우리는 기계적 중단하고 후속 단백질체 분석에 2-D 겔 전기 영동을 사용하여, 전체 박테리아 단백질을 추출하는 방법을 설명한다.
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이 논문에서
요약
초록
세균 종의 세포 내 단백질 수준의 조사가 이들 유기체에 기인 한 질병의 발병 기전을 이해하는 데 중요하다. 여기에서 우리는 인산염 완충 생리 식염수에 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 및 페닐 메틸 불소의 존재에 유리 구슬을 사용하여 기계적인 용해에 따라 부르크 홀데 리아 종에서 단백질을 추출하는 절차를 설명합니다. 이 방법은 다른 성장 조건을 위해, 다른 부르크 홀데 종에 사용될 수 있고, 다른 균의 프로테오믹스 연구에 사용하기위한 것으로 적당하다. 단백질 추출 후, 이차원 (2-D) 겔 전기 단백체 기술은 이러한 유기체의 프로테옴에서 해외 변화를 연구하는 기술된다. 이 방법은 분자량에 기초하여 분액하여 제 차원에서 등전위 포커싱에 의해 그들의 등전점에 따라 단백질의 분리, 이루어져두 번째 차원에서 아크릴 아마이드 겔 전기 영동에 의해. 분리 된 단백질의 시각화를 실버 염색으로 수행된다.
서론
속 부르크 홀데 이상의 62 종, 틈새의 넓은 범위로부터 분리 그람 음성균를 포함하고, 그것은 두 가지 주요 클러스터 1,2에서 분할된다. 첫번째 클러스터는 인간, 동물 및 phytotrophic 유기체를 포함하고, 대부분의 연구는 그들의 임상 적 중요성이 그룹의 병원성 종에 초점을 맞추고있다. 대부분의 병원성 회원 B.합니다 의 pseudomallei와 B. (각각 melioidosis 및 저병의 원인이됩니다) mallei 3,4 및 낭포 성 섬유증 (CF) 및 만성 육아 종성 질환 (CGD)에 질병을 일으키는 원인이 기회 병원균 5 (Burkholderia의의 세파 시아 단지, BCC의 정의 17 종), 1. 이상의 30 비병원성 종 번째 클러스터는, 식물 또는 환경과 연관된 박테리아를 포함하고, 호스트 (2)에 대한 잠재적으로 유리한 것으로 간주된다.
많은 합병증은 FR 등장이러한 이유로 인해 경우 6-9 대부분의 근절하기 위해 열심히하는 항생제에 내장 함수 나 인수 저항의 환자, 질병의 확산 및 치료 실패의 병원체의 전송로 Bur....
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프로토콜
1. 문화의 성장 (일 1 +2)
- 밤새 37 ° C의 회전에 스냅 상위 15 ML 튜브에 루리아 베르 타니 (LB) 국물 3 ㎖ : 스타터 문화를 성장. OD 0.6의 600 하룻밤 성장을 희석. 250 ㎖의 삼각 플라스크에 LB 액체 배지 100 ㎖에이 희석 1 ML을 추가합니다. 더 나은 약을, 고정상 (SP)에 16 시간 동안 250 rpm으로 진탕 37 ° C에서 알을 품다 배치 문화, 감염 조건과 같은 업무를 간소화하고 쿼럼 정지상 신호 요인의 통제하에 그 박테리아 독성 요인을 보장하기 위해 감지, 표현된다. 대안 적으로, 초기 SP 또는 중간 또는 늦게 대수 성장 단계에서 박테리아 박테리아 적응 위상에 대한 정보를 얻기 위해 사용될 수있다.
- 16 시간이 OD 600을 측정하고 확인 후 문화는 동일한 조건에서 이전에 생성 된 성장 곡선과 비교하여 SP에 도달하였습니다.
2. 단백질 추출 (3 일)
- 하룻밤 냉장고에 미리 모든 미디어 및 솔루션을 풀어. 모든 단계는 얼음 양동이에 튜브와 함께 수행되어야한다. 마이크로 원심과 베크만 쿨터 고성능 원심 분리기 (또는 이에 상응하는 금액) 4 ° C에 내부 로터 (회 전자 = JA-2....
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결과
두 개의 서로 다른 경우에 동일한 균 배양에서 추출 된 단백질 프로파일의 비교 분석은 성공적인 단백질 추출을 나타내는 유사한 패턴 밴딩을 보여 주었다. 추출 된 분자량 단백질은 10-150 kDa의에서였다. Burkholderia의의 multivorans에서 전체 세포 단백질 추출의 1은 대표 쿠마시 블루 염색 젤 (BCC의 구성원)도 LB 또는 효모 / Manitol (YEM) 국물과 성장 임상 분리 정지 단계에서 수확.
2-D 겔 전기 영동 분석을 위해, 부르크 홀데의 pseudomallei에서 총 단백질 200 μg을 (도 2)를 사용 하였다. 이 병원체는 질병 통제 및 예방 (25)에 대한 미국 센터에 의해 B 형 생물 전쟁 에이전트로 인식되어 있기 때문에, 단백질의 준비 절차는 생물 안전 수준 3 봉쇄 실험실에서 수행하고 그에.......
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토론
단백질의 제조 방법은 재현성 좋게 부르크 홀데 단백질의 대부분을 추출 할 수있는 것을 설명 하였다. 이는 그림 1과 같이 LB 또는 YEM 배양액에서 성장 같은 세균 배양을 사용하여 다른 일을 수행 두 개의 독립적 인 준비에서 같은 단백질 프로파일을 획득하여 보여줍니다. 그러나 우리가 접시에 성장 세균이 방법을 시험하지 않았다; 추출 액체 배지에서 자란 박테리아 효율적이었다. 이 방법은 프로 테오 믹 도구를 사용하여 더 단백질 특성 분석에 사용 된, 우리의 그룹은 성공적으로 (iTRAQ) 프로테오믹스 기술 15,23,24 상대 및 절대 정량을위한 2-D 겔 전기 영동 및 동위 원소의 태그를 사용하여 프로테옴의 변화를 연구했다. 후자의 경우, 단백질 iTRAQ 실험 15 PMSF와의 간섭을 피하기 위해 PBS에 0.5 M EDTA를 함유하는 완충액으로 추출 하였다.
그것은 REM하는 것이 중요.......
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 (BV에) 브리티시 컬럼비아 대학에서 재학하고 (DPS에) 건강 연구의 낭포 성 섬유증 캐나다와 캐나다 연구소에서 교부금에 의해 지원되었다. 우리는 프로토콜의 초기 준비를 위해 재클린 정 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 | |||
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | 독성, 부식성 |
| 아세톤 | Fisher | A18-1 | 가연성 |
| PBS 버퍼 | Bioscience | R028 | |
| 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) | Fisher | BP118-500 | 독성 |
| 유리 구슬(0.1 mm) | BioSpec 제품 | 11079101 | |
| Nalgene Oak Ridge 원심분리기 튜브, 폴리카보네이트(50 ml) | VWR | 21009-342 | |
| MicroBCA 단백질 추출 키트 | Pierce | 23235 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브 2.0 ml 원뿔형 스크류 캡 튜브 캡 및 캡 및 O-링 포함 | Fisher | 02-681-375 | |
| 2-D Clean-Up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
| Urea | Invitrogen | 15505-050 | 자극성 |
| CHAPS | Amersham Biosciences | 17-1314-01 | |
| Dithiothreitol (DTT) | MPBiomedical, LCC | 856126 | 자극성 |
| Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm | Amersham Biosciences | 176002-46 | |
| Duracryl | Proteomic Solutions | 80-0148 | 매우 독성이 강한 발암 물질 |
| 과황산 암모늄 | Fisher | BP179-100 | 가연성, 독성, 부식성 |
| N, N, N', N'-테트라 메틸 에틸렌 디아민 (TEMED) | Invitrogen | 15524-010 | 가연성 |
| 도데 실황산 나트륨 (SDS) | Fisher | BP166-500 | 급성 독성, 가연성 |
| 아가로 스 | 인vitrogen | 15510-027 | |
| 에탄올 | Fisher | HC1100-1GL | 가연성, 독성 |
| 아세트산 | Fisher | A491-212 | 가연성, 부식성 |
| 글루타르알데히드 | Fisher | G151-1 | 매우 독성, 부식성, 환경에 위험 |
| 테트라티오네이트 칼륨 | Sigma | P2926 | 자극성 |
| 아세트산나트륨 | EM Science | 7510 | |
| 질산은 | 시그마 | 209139 | 부식성, 환경에 위험 |
| 포름알데히드 | 시그마 | 252549 | 독성 |
| 티오황산나트륨 | 시그마 | S7026 | |
| 트리스 베이스 | EMD | 9230 | |
| 글리신 | MPBiomedical, LCC | 808831 | |
| 글리세롤 | MPBiomedical, LCC | 800688 | |
| 메탄올 | Fisher | A412-4 | 가연성, 독성, 건강 위험 |
| 탄산나트륨 무수 | EMD | SX0400-3 | 독성 |
| 미네랄 오일 | ACROS | 415080010 | |
| Equipment | |||
| JA-20 ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 334831 | |
| Mini Beadbeater | Biospec Products | 3110BX | |
| Ettan IPGphor II 등전 포커싱 시스템 및 액세서리 | GE Healthcare | 80-6505-03 | www.amershambiosciences.com |
| Ettan DALT 대형 수직 전기영동 시스템 | GE Healthcare | 80-6485-27 | www.amershambiosciences.com |
참고문헌
- Drevinek, P., Mahenthiralingam, E. Burkholderia cenocepacia in cystic fibrosis: epidemiology and molecular mechanisms of virulence. Clin. Microbiol. Infect. 16, 821-830 (2010).
- Suarez-Moreno, Z. R., et al. Commo....
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재인쇄 및 허가
