방법 논문

높은 투과 속도를 가진 염색체 외 배열을 예쁜꼬마선충 게놈에 통합하기 위한 빠른 프로토콜

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DOI:

10.3791/50773

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2013년 12월 9일

 ,  ,  , 
1Université Claude Bernard Lyon, 2Centre de Génétique et de Physiologie Moléculaires et Cellulaires, CNRS UMR 5534

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 자외선(UV) 조사를 사용하여 형질전환 염색체 외 배열을 Caenorhabditis elegans 게놈에 통합하기 위한 빠르고 낮은 재료 소모 절차를 설명합니다. 또한, 이 프로토콜은 염색체 외 어레이를 높은 비율로 전송하는 형질전환 라인에 특히 적합합니다.

초록

Caenorhabditis elegans의 세포융합 생식선의 세포질에 DNA를 미세주입하는 것은 염색체 외 배열의 부분 및 가변 투과 속도를 다음 세대로 나타내는 형질전환 계통을 설정하는 데 사용되는 주요 기술입니다. 또한, 형질전환 동물은 모자이크이며 다양한 수의 세포에서 전이유전자를 발현합니다. 염색체 외 어레이는 UV 조사를 사용하여 C. elegans 게놈에 통합되어 전이유전자의 100% 투과율을 가진 비모자이크 형질전환 균주를 확립할 수 있습니다. 그 정도까지, 자외선에 조사된 형질전환 동물의 F1 자손은 전이유전자의 이형접합적 통합을 가진 동물에 대해 스크리닝되며, 이는 F2 자손으로의 75%의 멘델식 전염률로 이어집니다. 이 방법의 과제 중 하나는 전(X% 형질전환 동물)과 통합 후(≥75% 형질전환 F2 동물) 집단 내 형질전환 유전자 전달의 비율을 구별하는 것입니다. 따라서 이 방법은 멘델 분리(Mendelian segregation)인 75%보다 현저히 낮은 형질전환 동물의 비율을 가진 통합되지 않은 형질전환 계통을 선택해야 합니다. 결과적으로, 차세대로의 염색체 외 어레이 투과율≤60%)을 가진 비통합형 형질전환 라인이 일반적으로 통합에 선호되며, 전달량이 높은 균주에서 전이유전자 통합은 어렵습니다. 여기에서 우리는 투과율이 높은 형질전환 라인(≥80%)을 사용할 때 게놈에 대한 염색체 외 배열의 통합의 효율성이 증가한다는 것을 보여줍니다. 설명된 프로토콜은 높은 염색체 외 어레이 전달률을 나타내는 형질전환 웜의 UV 조사 후 게놈에 동형접합 전이유전자가 통합된 여러 독립적인 라인을 쉽게 선택할 수 있도록 합니다. 또한 이 방법은 매우 빠르고 재료 소비가 적습니다. 특정 통합 전이유전자를 발현하는 다양한 라인을 빠르게 생성할 수 있는 가능성은 유전자 발현 패턴 및 조절, 단백질 국소화 및 과발현에 초점을 맞춘 연구뿐만 아니라 세포 내 마커의 개발에 큰 관심을 끌고 있습니다.

서론

전이유전자는 예쁜꼬마선충(C. elegans)에서 광범위한 응용 분야에 광범위하게 사용됩니다. 형질전환 균주는 일반적으로 세포융합 자웅동체 생식선1,2에 DNA를 주입하여 생성됩니다. 관심 전이유전자를 운반하는 DNA는 coinjection marker1,3,4를 인코딩하는 플라스미드와 함께 coinjection됩니다. Coinjection marker는 형광 단백질의 발현 또는 특정 행동 또는 형태학적 표현형으로 이어지는 확립된 전이유전자입니다. 주입된 DNA는 다중 복제 염색체외 배열을 형성하기 위해 재배열됩니다. 따라서 관심있는 transgene 및 coinjection marker는 함께 전달됩니다5,4. 형질전환 라인은 coinjection marker(형광 또는 특정 표현형)의 발현에 의해 유도된 표현형을 따라 주입된 동물의 F2 세대에서 선택됩니다1. 형질전환 라인은 염색체 외 어레이의 차세대로의 부분 및 가변 투과 속도를 나타냅니다. 균주에 따라 동물의 10-100%(100%는 드문 경우)가 염색체 외 배열을 물려받습니다. 또한, 형질전환 동물은 모자이크이며 다양한 수의 세포에서 전이유전자를 발현합니다. 이 모자이크주의는 다음 세대로의 전염 속도와 상관관계가 있을 수 있습니다. 실제로, 생식세포와 체세포(somatic cell) 모두에서 전염 속도는 세포 분열 중 염색체 외 배열(extrachromosomal arrays)의 분리에 따라 달라집니다. 이 문제를 피하는 한 가지 방법은 전이유전자를 게놈에 통합하는 것입니다. 고전적으로, 염색체에 형질전환 유전자를 통합하는 것은 염색체 외 배열을 운반하는 형질전환 벌레의 방사선 조사(자외선 또는 감마)에 의존합니다3. 간단히 말해서, 50-100 마리의 자웅동체 동물이 L4 유충 단계에서 방사선 조사됩니다. F1 세대에서는 200-800마리의 형질전환 동물을 선택하여 플레이트에 개별적으로 배양합니다. 멘델의 분리(Mendelian segregation)에 따르면, 전이유전자의 이형접합적 통합을 게놈에 운반하는 형질전환 F1 동물은 통합 배열에 대해 이형접합적(heterozygous)인 형질전환 후손의 1/2, 통합 배열에 대해 동형접합적(homozygous)인 형질전환 후손의 1/4, 배열을 통합하지 않은 자손의 1/4을 생산할 수 있습니다(그림 1). 따라서, F2 세대를 포함하는 플레이트는 coinjection 마커의 발현에 의해 관찰된 바와 같이 ≥75% 형질전환 동물에 대해 육안으로 스크리닝됩니다. 통합 후보로 선정된 F2 동물의 약 1/3은 통합 배열에 대해 동형접합적이며, 100% 동형접합적 F3 동물을 생산하는 것으로 가정됩니다. 따라서, 선택된 각 플레이트에서 3-8개의 형질전환 F2 동물을 개별적으로 배양하고 100% 형질전환 후손을 가진 플레이트를 선택합니다. 다음으로, 8마리의 F3 동물을 개별적으로 배양하여 전이유전자의 100% 유전을 확인합니다.

이 방법의 주요 단점은 다음과 같습니다.

  1. ≥75%의 형질전환 F2 자손을 위해 수백 개의 F1 플레이트의 시각적 스크리닝이 필요하며, 이는 비통합형 염색체 외 어레이의 가변적이고 예측할 수 없는 전달 비율로 인해 시간이 많이 걸립니다. 대안적으로, F1 플레이트의 스크리닝을 피하기 위해, P0 동물의 방사선 조사 후에 몇 가지 후속 기아 단계를 수행할 수 있습니다. 그 후 100마리의 형질전환 동물을 선택하고 100% 형질전환 자손을 선별합니다3.
  2. 60% 이상의 염색체 외 어레이 투과 비율을 나타내는 균주에는 적용되지 않는데, 이 비율은 이 비율을 75%와 구별하기 어렵기 때문입니다.
  3. 상대적으로 낮은 투과 속도를 가진 균주만 사용할 수 있기 때문에 많은 수의 방사선 조사된 형질전환 P0 동물과 수많은 F1 및 F2 동물의 관찰이 필요하며, 이는 시간이 많이 걸리고 상당한 수의 플레이트를 필요로 합니다.

벌레의 방사선 조사는 아마도 DNA에 이중 가닥 절단을 유도하고 DNA 복구 중에 염색체 외 배열의 염색체 내 통합이 발생합니다. 따라서, 성공적인 방사선 조사 매개 통합을 얻을 수 있는 기회는 염색체 외 배열을 운반하는 생식선 세포의 수에 정비례할 가능성이 높습니다. 투과율이 높은 균주는2에서 제안된 바와 같이 투과율이 낮은 균주보다 더 많은 형질전환 DNA 어레이를 포함할 수 있으며, 염색체 외 어레이를 운반하는 생식세포 수가 더 많습니다. 따라서, 우리는 투과율이 높은 라인에서 전이유전자가 투과 속도가 낮은 라인보다 통합이 더 쉬울 수 있다고 추론했습니다. 그러나 표준 프로토콜은 통합되지 않은 염색체 외 배열을 가진 형질전환 동물의 비율이 전이유전자의 이형접합적 유전체 통합을 가진 F1 동물의 자손의 비율과 거의 구별될 수 없기 때문에 높은 전달 빈도를 가진 전이유전자를 통합할 가능성을 배제합니다(그림 1).

여기서 우리는 특정 전이유전자의 경우, 자외선(UV) 광선을 조사한 후 회복된 적분선의 수가 비적분적 어레이의 초기 투과 비율에 따라 달라진다는 것을 보여줍니다. 당사는 UV 방사선 매개 전이유전자 통합을 위한 개선된 프로토콜을 제시하며, 이는 특히 높은 전이유전자 어레이 전달률을 보이는 라인과 관련이 있습니다.

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프로토콜

1. 통합 전에 형질전환 선충 배양

형질전환 라인은1에 설명된 대로 생성될 수 있습니다. 이러한 라인은 일반적으로 형광 단백질의 발현 또는 주어진 발달 단계에서 특정 행동 또는 형태학적 표현형으로 이어지는 coinjection marker plasmid를 포함합니다1,3. 이 통합 프로토콜은 형광 또는 비형광 동시 주입 마커를 발현하는 균주에 적용할 수 있습니다. 다음 예에서는 형광 동시 주입 마커가 있는 균주가 사용되었습니다.

  1. 배양 플레이트 준비:
    1. 약 500 개의 60mm 대형 페트리 접시를 준비하고, 각각 10ml의 선충 성장 배지 (NGM) 6,7를 무균 적으로 붓는다.
    2. 표준 절차6,7에 따라 각 플레이트에 0.3ml의 포화 대장균 OP50 배양을 파종합니다.
  2. 통합할 형질전환 라인의 투과율을 평가합니다.
    1. 각 형질전환 라인에 대해7에 설명된 대로 지렁이 픽을 사용하여 형광 입체경 아래 10개의 개별 배양 플레이트에 10개의 형광 임신 성체를 선택합니다.
    2. 벌레가 번식할 수 있도록 15-25°C(유전적 배경에 따라 다름)의 벌레 인큐베이터에서 동물을 배양합니다.
    3. 매일 자손을 관찰하여 어떤 발달 단계에서 coinjection marker가 발현되고 가장 잘 관찰될 수 있는지 평가합니다. 현재 사용되는 대부분의 coinjection 마커의 발현은 L4 유충 단계 또는 성충에서 관찰됩니다.
    4. 형광 입체경으로 관찰하여 형광 자손의 비율을 결정하여 자손의 전염 속도를 평가합니다.
  3. transgene integration을 위한 transgenic line 선택:
    1. 가능한 한 가장 높은 투과율(이상적으로는 ≥80%)을 가진 형질전환 라인을 선택합니다.
  4. 통합을 위해 L4 유충 단계에서 동기화된 형질전환 동물 개체군을 얻습니다.
    1. 30마리의 형광 임신 성체를 5개의 배양 플레이트(플레이트당 6마리)에 담습니다.
    2. 벌레가 15 ° C에서 3-4 시간 동안 알을 낳도록하십시오.
    3. 접시에 최소 30개의 알이 있는지 확인한 후 접시에서 성체를 제거하십시오.
    4. 자손이 L4 유충 단계(15°C에서 96시간 또는 25°C에서 36시간)에 도달할 때까지 15-25°C의 지렁이 인큐베이터에서 동물을 배양합니다.

2. 형질전환 웜의 UV 조사 및 회수

  1. 벌레 조사:
    1. 30-100마리의 형광 형질전환 L4 동물을 별도의 배양 플레이트에 넣습니다(플레이트당 15-20
      2. 마리).
    2. 뚜껑을 제거한 상태로 플레이트를 UV 가교기에 놓습니다. 0.012 J/cm2에서 벌레를 조사합니다. 변형률은 UV에 다소 민감하며 결과는 사용된 UV 조사기에 따라 달라질 수 있습니다. 0.010-0.015 J / cm2 사이의 선량 범위를 테스트 할 수 있습니다.
  2. 방사선 조사 후 웜 복구:
    1. 방사선 조사된 벌레가 담긴 플레이트를 15°C에서 밤새 회복을 위해 놓습니다.
    2. 살아 있는 동물의 수를 확인하십시오. 우리 손에서는 약 80-90%의 생존율이 효율적인 방사선 조사에 적합합니다.
    3. 자손이 1.2단계에서 확립된 바와 같이 coinjection marker 발현을 관찰할 수 있는 발달 단계에 도달할 때까지 방사선 조사된 동물을 15-25°C에서 성장시킵니다.

3. 통합 형질전환 라인의 분리

  1. F1 동물 선택:
    1. 150-200마리의 형광 F1 동물을 별도의 배양 플레이트에 넣습니다. 고투과율 라인(≥80%)의 경우 100마리의 F1 동물로 충분합니다.
    2. 자손이 형광 F2 동물을 관찰하기에 적합한 단계에 도달할 때까지 이 F1 플레이트를 15-25°C로 유지하십시오.
    3. i) F1 동물이 불임 또는 죽었음을 나타내는 자손이 없거나, ii) F1 동물이 예상된 속도로 전이유전자를 전달하지 않았음을 나타내는 형광 F2 동물이 없거나 적음을 나타내는 모든 F1 플레이트를 폐기합니다. 이 단계는 빠르며 ≥75%의 형광 자손을 나타내는 F1 플레이트를 선택하기 위해 형광 F2 웜의 비율을 추정해야 하는 표준 프로토콜과 비교할 때 실질적인 이점을 나타냅니다(표 1).
  2. F2 동물 선택:
    1. 선택한 각 F1 플레이트에서 4개의 형광 형질전환 F2 동물을 단일화합니다. 형광 전이유전자(예: mCherry8, gfp9 또는 dsRed10)를 사용하는 경우, 이러한 동물이 통합 어레이에 대해 동형접합적임을 나타낼 수 있으므로 형광 수준이 높은 F2 웜을 선택합니다. F2 동물을 선택할 때 다음 단계에서 거짓 부정을 피하기 위해 알이나 유충을 가지고 다니지 않는 것이 중요합니다.
    2. 15-25 °C에서 F2 동물을 성장시킵니다.
  3. 통합 형질전환 균주의 분리 및 검증:
    1. F2 플레이트에서 100% 형광 형질전환 F3 웜을 스크리닝합니다. 단일 비형광 웜의 존재는 플레이트를 버려야 함을 나타내기 때문에 화면은 매우 빠릅니다. 통합 전이유전자에 대한 F2 동물 동형접합은 100% 동형접합 형광 자손을 제공합니다.
    2. 전이유전자의 100% 유전을 확인하기 위해 선택된 플레이트에서 8개의 형광 F3 동물을 선별합니다. 이론적으로 이 단계에서는 한 마리의 동물을 선택하는 것으로 충분합니다. 그러나 방사선 조사는 벌레 생리학에 중요한 유전자에 영향을 미치는 돌연변이를 무작위로 유도할 수 있으므로 수정이 불가능하거나 건강하지 않은 동물을 선택하지 않기 위해 8마리의 형광 F3 동물을 선택하는 것이 필요할 수 있습니다.
    3. 가능한 경우 여러 개의 독립적인 통합 형질전환 균주, 즉 다른 F1 동물에서 회수된 균주를 유지하십시오.

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결과

약 50-60%의 동일한 빈도로 염색체 외 어레이를 전달하는 두 가지 서로 다른 라인의 트랜스진 통합을 표준 프로토콜과 개선된 프로토콜을 사용하여 수행하였습니다(표 1). 표준 프로토콜의 경우 91마리의 형질전환 L4 동물을 UV 조사한 후 3개의 독립적인 통합 라인을 회복할 수 있었으며, 개선된 프로토콜에서는 30마리의 형질전환 L4 동물을 UV 조사한 후 1개의 통합 라인을 회복할 수 있었습니다. 이는 두 프로토콜의 통합 효율이 유사함(조사된 L4 동물 30마리당 통합 라인 1개)을 시사합니다. 그러나 동일한 트랜스진의 통합을 비교했을 때 한 프로토콜이 다른 프로토콜보다 더 효율적일 가능성을 배제할 수는 없습니다. 두 프로토콜의 주요 차이점은 개선된 방법에서는 형광 자손이 나타나는 모든 F1 플레이트를 형광 F2 동물의 비율에 관계없이 선택한 반면, 표준 방법에서는 F1 플레이트를 육안으로 스크리닝하여 형질전환 F2 자손이 ≥75%인 플레이트만 선택했다는 점입니다. 이러한 스크리닝 단계는 특히 ...

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토론

여기에 설명된 프로토콜은 염색체외 형질전환 어레이를 C. elegans 의 게놈에 통합하는 효율적인 방법을 제공합니다. 동일한 이식유전자 Pdyc-1::d yc-1::gfp (pKG45)를 서로 다른 속도(10-15%, 50-60% 및 >80%)로 전달한 서로 다른 비통합계통을 사용하여 UV 조사 후 회수된 통합 균주의 수가 비통합계통의 초기 전송 수준에 의존한다는 것을 보여주었습니다(표 2). 따라서 이식유전자는 높은 전염률을 나타내는 계통에 통합하기가 더 쉽습니다.

통합 이식유전자는 유전자 조절 및 유전자 발현 패턴과 관련된 연구를 포함하여 광범위한 목적에 관심이 있습니다. 통합 이식유전자는 형광 세포 내 마커를 설정하는 데 유용한 도구이기도 합니다. 이식유전자를 통합할 때 여러 개의 독립적인 계통을 분리하는 것이 중요할 수 있습니다. 여러 연구에서는 다양한 유전적 배경에서 이식유전자를 도입해야 합니다. 그러나 이...

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공개 사항

저자는 경쟁적인 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 통합되지 않은 Pdyc-1::d yc-1::gfp를 생성한 Claire Lecroisey와 Laurent Ségalat에게 감사를 표합니다. Pmyo-2::d sRed 및 Pmyo-3::gfp 형질전환 균주. Pmyo-2::d sRed 플라스미드를 선물해 주신 Andy Fire님과 Pmyo-3::gfp 플라스미드를 선물해 주신 Pamela Hoppe님께 감사드립니다. 이 연구는 프랑스 국립 과학 연구 센터 (CNRS)와 리옹의 클로드 버나드 대학 (Claude Bernard University of Lyon)에 의해 설립되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
NGM(선충 성장 배지) 준비용AgarProlabo20768.292
NGM 준비용NaCl Chimie-Plus40045
NGM 준비용Bacto-peptoneBD211820
KH2PO4Roth3904-1NGM 준비용
K2HPO용4Prolabo26930.293NGM 준비용
MgSO4sub>RothNGM 준비용P027.2
CaCl2Prolabo22317.297NGM
준비용콜레스테롤렉타푸르
LB-brothSigmaL3022OP50 배양 박테리아
장비
U.V. cross-linkerFischer Scientific파장 254nm
현미경 SteREO Discovery V8Carl Zeiss, Inc.
페트리 접시, 60mmCMLBPS55E6
플라티늄 와이어 0.25mmAlfa Aesar7440-06-4벌레를 고르기 위해 (7)
(6,7), , ,

참고문헌

  1. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833(2008).
  2. Mello, C., Kramer, J. M., Stinchlomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
  3. Transformation and microinjection. WormBook. Evans, T. C. , The C. elegans Research Community, WormBook. (2006).
  4. Hobert, O. PCR Fusion-Based Approach to Create Reporter Gene Constructs for Expression Analysis in Transgenic C. elegans. BioTechniques. 32, 728-730 (2002).
  5. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  7. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293(2011).
  8. Merritt, C., Rasoloson, D., Gallo, C., Voronina, E., Ko, D., Seydoux, G. A modular vector kit for transgenesis in C. elegans. International Worm Meeting. , (2007).
  9. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Green Prasher, D. Fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, 802-805 (1994).
  10. Fleenor, J., Fire, A. Discosoma sp. Red Fluorescent Protein (dsRED) as a reporter in C. elegans. Worm Breeder's Gazette. 16 (3), 16(2000).
  11. Lecroisey, C., et al. ZYX-1, the unique zyxin protein of Caenorhabditis elegans, is involved in dystrophin-dependent muscle degeneration. Mol. Biol. Cell. , (2013).
  12. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157 (3), 1217-1226 (2001).
  13. Frøkjaer-Jensen, C., et al. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat. Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
  14. Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).

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