전자관 X-선 마이크로 분석에 의한 뉴런의 총 칼슘의 측정

요약

이 논문은 생리 학적으로 정의 된 생물 표본의 세포 이하의 해상도에서 총 칼슘 함량과 분포의 정량적 측정에 cryoanalytical 전자 현미경의 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

초록

이 문서에서는 전자 프로브 미량 분석 (EPMA)로 알려진 기술을 사용하여 도구, 기술 및 세포 내 원소 함량의 정량적 측정을위한 적절한 도구가 설명되어 있습니다. Intramitochondrial 칼슘 때문에 미토콘드리아 칼슘 과부하가 신경 퇴행성 질환에서 활약하는 중요한 역할의 특정 초점이다. 방법은 X-선 분석 시료와 전자빔의 상호 작용에 의해 전자 현미경 (EM)에서 생성에 기초한다. 전자 현미경 표본의 확산 요소의 기본 분포를 유지하기 위해서, EPMA는 극박 저온부의 제조이어서 조직 "c​​ryofixation"를 필요로한다. 배양 된 세포 또는 Organotypic 슬라이스 문화의 급속 냉동은 각각 차가운 금속 블록에 액체 에탄 또는 슬램 냉동 동결 급락에 의해 수행된다. 저온부는 공칭 두께의 80 나노는 캘리포니아에서 다이아몬드 나이프로 건조 절단됩니다. -16076, C는 탄소 / pioloform 코팅 된 구리 그리드 상에 장착하고, 전문 cryospecimen 홀더를 사용하여 극저온-EM에 cryotransferred. C 낮은 전자 선량 ° ≤ -160에서 시각적 조사 및 위치 매핑 한 후, 냉동 수화 저온부는 동결 건조 ~ 30 분 -100 ° C에있다. 건조 저온부의 세포 기관 수준의 이미지는 느린 스캔 CCD 카메라와 분석을 위해 선택한 그 세포 내 영역에 의해, 또한 낮은 복용량에 기록됩니다. 문구, 집중, 고강도 전자 프로브의 ROI에서 출사 X-선은 에너지 분산 X-선 (EDX)에 연결된 전자 장치에 의해 처리 분광계, 및 X-선 스펙트럼으로 제시에 의해 수집되는, 즉, 에너지 대 X-선 강도의 줄거리. 추가 소프트웨어를 용이하게 : 자신의 "특징"피크 에너지와 지문에 의한 원소 성분의 1) 식별하고, 피크 면적 / 배경의 추출 2) 정량 분석​​. 이 논문은 일반적인 설명 두 가지 예와 결론미토콘드리아 칼슘 분석 허혈 저항의 근거를 제시 흥분 독성 손상 및 다른 메커니즘에 중요한 통찰력을 제공하는 하나의 EPMA 응용 프로그램.

서론

칼슘 이온은 시냅스 전달 및 유전자 발현 등 다양한 통상의 공정에서 필수적인 역할을 논증 생물학에서 가장 중요하고 다양한 세포 신호 전달 실체이다. 한편, 칼슘은 세포 죽음에서 동등하게 중요하다. 특히, 칼슘 규제 완화 뇌졸중의 신경 세포의 손상에 중요한 요소이다, 파킨슨 병, 알츠하이머 병 등 신경 퇴행성 질환 ^3,5. 따라서, 칼슘이 세포 내에서 어떻게 분포되는지를 정량적으로 이해하는 것이 매우 중요하고, 어떻게 이런 일이 생리적 또는 병태 생리 학적 자극을 다음과 같이 변경합니다. 용액에 무료 또는 기판에 결합 - - 셀룰러 칼슘 농도는 자극의 결과로서 수십배 이상 변경이 그 목표는 칼슘 동적 개의 물리적 상태 사이에서 분포되어 있다는 사실에 의해 복잡하게된다.

FR의 분석에 사용할 수있는 여러 가지 고급 방법론이 있지만세포 내 칼슘을 전자, 정의 세포 내 구획에서 총 칼슘 농도의 결정은 현실적으로 한 가지 방법, 즉, 전자 탐침 미세 분석 (EPMA)로 제한됩니다. EPMA 그 커플 투과형 전자 현미경 (TEM)에 대한 X-선 분광계 기술이다. TEM 전자총 관심 및 전자 충격의 결과로서 발광 소자 고유의 X-레이의 세포 내 영역에 고정, 서브 마이크론 전자 탐침을 포커스는 (상세한 기술 리뷰를 참고 ^<....

프로토콜

여기에 설명 된 접근 방식은 특정 악기, 도구 및 소프트웨어를 사용하여 개발되었다. 실험실이 같은 실험 장치를 사용하지 않기 때문에 접근이 가능한 일반화되어있다.

1. 급속 냉동

그들이 동결 순간 생균에 있었던 것에 정량적 확산 조직 성분 및 화학 원소의 분포를 유지하는 방식으로 세포 또는 조직의 하나) "cryofixation"설명하는 분석 방법에 대한 극저온 접근법에 절대적으로 의존 그리고 2) 극박의 제조는 TEM 이미징 및 분석에 적절한 저온부. 이러한 기술은 간략히 설명하지만, 다른 실험실에서이 절차를 재현하는 데 필요한 세부 사항은이 기사의 범위를 벗어난다됩니다. 관심있는 독자는 우수한 최근 기사 ^{8:9,14라고합니다.}

주의 :이 섹션에서는 액체 비누의 사용을 설명합니다가연성 및 폭발 위험이 있습니다 efied 에탄,, 적절한 예방 조치가 취해 져야한다. 연산자는 액체 질소에 대해 잘 알고 있어야합니다 (LN ₂₎ 보호 실험실 코트, 안경 및 장갑을 포함 cryoresistant 안전주의 사항. 참고 : 다음과 전반에 걸쳐, 모든 도구 (집게 등) 냉동 표본 실수로 해동을 피....

결과

뇌 세포는 일반적으로 허혈성 조건에서 발생 병리 신경 전달 물질 방출의 결과로서 흥분 독성 손상 서스테인. EPMA 칼슘 막대한 양의를 격리 할 수​​있는 신경 세포의 미토콘드리아의 기능이 손상의 메커니즘을 이루는 방법을 발견에 매우 중요했다. 그림 3의 전자 현미경 사진은 빠르게 흥분 독성 자극 (100 μM NMDA)에 30 분 노출 후 냉동 배양 해마 신경 세포의 동결 건조 저온부에있는 미토콘드리아의 모양을 보여줍니다. 그들은 매우 부어 작은, 어두운 흠 (빨간색 화살표)를 포함 대부분의 미토콘드리아는 구조적 손상을 한 것으로 나타났습니다. 미토콘드리아이 포함됩니다 (그림 3, 빨간색과 파란색 스펙트럼, 각각) 범위 내에서 ( "매트릭스")의 독점적 인 원소 분석을 수행하기에 충분한 해상도를 가지고 EPMA는 흠이 주로 칼슘과 인으로 구성되는 것으로 나타났다. 매우 높은 칼슘 콘이러한 흠 십t - ~ 1,300 밀리몰 / kg 건조 중량, 반면 <1 밀리몰.......

토론

전자 현미경 기반의 분석 방법 여기에 제시된는 탐지, 식별, 그리고 나, K, P, 특히 칼슘 등의 생물학적 그 몇 가지 요소, 정량 할 수 있습니다. 이러한 분석은, 세포 내에서 수행 될 수있다, 즉, 인트라 소기관, 급속 냉동 검체로부터 제조 저온부의 고품질 이미지에 대한 관심의 구조를 찾아 식별하는 능력 때문에 해상도. 전혀 오염이 조직 요소의 위치를​​ 정량적으로 보존 상태에서도, 종래 고정, 플라스틱 내장 준비 구조적 품질 비교 전자 이미지를 기록하는 데 필요하지 않습니다.

구조 조사 이미지가 낮은 응용 전자 복용량에 기록되어 있지만, 더 높은 복용량은 좋은 통계를 얻기에 충분한 수의 비율로 X-선 방출을 유도해야합니다. 따라서, EMPA 유용 현미경은 높은 전류 집중 프로브를 형성 할 수 있어야한다; nA의 2-525 ~ 50 나노 미터로, ER의 cisternae 또는 시냅스 소포와 같은 세포 기관을 포괄하기에 적합한이 허용됩니다. 이 법은 고휘도.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
REAGENTS/MATERIALS
Thermanox 플라스틱 커버슬립	Thermo Fischer Scientific	72280
배양 인서트	BD Falcon	353090	6웰 플레이트용
Cryopins	Leica Microsystems	16701952	Grooved
Wood 애플리케이터	EM Sciences	72300
접는 EM 그리드	Ted Pella	4GC100/100	100 메쉬
인듐 호일	Alfa Aesar	13982	0.25 mm 두께
EQUIPMENT
플런지 동결 장치	Leica Microsystems	KF-80
슬램 동결 장치	LifeCell	CF-100
초박 절개	Leica Microsystems	UC6
마이크로톰용 크라이오어태치먼트	Leica Microsystems	FC6
다이아몬드 크라이오트리밍 도구	Diatome	Cryotrim 45
다이아몬드 크라	Diatome	Cryo 35
정전기 방지 장치	Diatome	Hauf Static Line
Cryo 전자 현미경	Carl Zeiss 현미경	EM912 Omega
EM 극저온 검체 홀더	Gatan	CT3500
슬로우 스캔 CCD 카메라, 2k x 2k	Troendle (TRS)	Sharpeye
이미지 수집 소프트웨어	Olympus SIS	iTEM 제품군
ED X선 검출기	Oxford Instruments	Linksystem Pentafet
펄스 프로세서	Oxford Instruments	XP-3
PCI 백플레인 카드	4pi 시스템	스펙트럼 엔진 II
데스크탑 컴퓨터	Apple	Any OS9 호환 모델
X선 분석 소프트웨어	NIST	DTSA, DTSA II
스프레드시트 소프트웨어	Microsoft	Excel
CF100은 더 이상 상업적으로 판매되지 않지만 많은 학술 시설에서 기계를 사용할 수 있습니다. 전체 기계 또는 부품은 온라인에서 찾을 수 있습니다. CT3500 극저온 이송 홀더에 대한 비디오 자습서는 http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4. SEII는 더 이상 사용되지 않습니다. Universal Spectral Engine은 비슷한 기능을 가진 최신 PC 호환 제품입니다. 4PI는 제조 및 판매를 중단했지만 여전히 기술 고객 지원을 제공합니다. 중고 시스템은 온라인에서 찾을 수 있는 경우가 많습니다. 원래 DTSA는 이제 더 이상 사용되지 않습니다. NIST는 공개 도메인에서 업데이트된 후속 제품인 DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)

이오나이프