이 방법은 리프트 밸리 열병 바이러스 (RVFV) 변형 MP-12와 감염 후 숙주 세포의 전사의 변화를 측정하는 클릭 화학의 사용을 설명합니다. 결과는 형광 현미경을 통해 질적 시각 또는 유동 세포 계측법을 통해 정량적으로 얻을 수 있습니다. 이 방법은 다른 바이러스와 함께 사용하기위한 적응이다.
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이 논문에서
요약
초록
많은 RNA 바이러스는 세포의 방어를 회피하는 수단으로 숙주 세포의 전사를 억제하는 능력을 진화했다. 이러한 바이러스의 연구에 감염된 세포에서 전사 활성을 측정하는 신속하고 신뢰할 수있는 방법을 가지고하는 것이 중요합니다. 전통적으로, 전사는 H-딘 같은 면역 염색을 통해 감지 한 다음 5 bromouridine (BRU) 등 할로겐 딘 유사체의 autoradiography를 또는 섬광 계수 또는 법인을 통해 탐지 다음과 같은 3 등 방사성 클레오의 내장으로도 측정되었습니다. BRU의 검출이 번거로울 수 있습니다 낮은 감도에서 고통 수도 있지만 방사성 동위 원소의 사용은, 그러나, 특수 장비가 필요하며 실험실 설정의 숫자에 적합하지 않습니다.
아 지드와 알킨에서 구리 촉매 트리아 졸의 형성을 포함 최근에 개발 클릭 화학은 이제 신속하고 highl를 제공합니다이 두 가지 방법에 대한 예 민감 대안입니다. 클릭 화학은 초기 RNA가 먼저 형광 지드와 라벨의 검출에 이어 딘 아날로그 5 ethynyluridine (EU)의 결합에 의해 표시되는 두 단계 프로세스입니다. 이러한 지드 시각화 옵션의 넓은 범위를 허용, 여러 가지 형광체로 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 긴장 MP-12 클릭 화학을 사용하여 리프트 밸리 열병 바이러스 (RVFV)에 감염된 세포에서 전사 억제를 측정하는 방법을 설명합니다. 동시에,이 세포에 바이러스 성 단백질의 발현은 고전적인 세포 면역 염색에 의해 결정됩니다. 8 세부 유동 세포 계측법을 통해 전사 억제를 정량화하는 방법을 5 단계 동안, 4 세부 형광 현미경을 통해 전사 억제를 시각화하는 방법을 통해 1 단계를 반복합니다. 이 프로토콜은 다른 바이러스와 함께 사용하기 위해 쉽게 적응할 수있다.
서론
전통적으로 전사 활동은 방사성 (3 H-딘 1) 하나의 법인을 통해 측정 또는 초기 RNA로 (BRU) 2 클레오 할로겐되었습니다. 이 딘 유사체는 세포에 의해 촬영 클레오 회수 경로를 통해 딘 - 삼인산 (UTP)로 변환하고, 이후 새로 합성 된 RNA로 통합. 3 H-딘은 많은 시간이 소요될 수 있습니다 기록법, 또는 섬광에 의해 감지 될 수있다 전문 장비를 필요로하는 계산. 또한, 방사성 동위 원소의 사용은 높은 억제 생물 안전성 연구소 등의 실험실 설정의 숫자에 실용적이지 않을 수 있습니다. BRU는 RNA 이차 구조는 항체 바인딩에 대한 입체적 방해가 될 수도로 핵 또는 RNA의 부분적인 변성에 항체의 접근을 보장하기 위해 거친 permeabilization이 필요할 수 있습니다 안티 - BRU 항체로 면역 염색을 통해 감지 할 수 있습니다.
_content "> 여기에서 설명하는 프로토콜은 최근 RVFV 변형 MP-12에 감염된 세포에서 전사 활성을 측정하는 화학 3을 누릅니다 개발했다. 클릭 화학은 매우 선택적이 고 효율적인 구리 (I) 촉매 알킨 사이 사이클로 반응에 의존 활용 4,5 지드 부분은.이 프로토콜에 감염된 세포의 초기 RNA가 먼....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
형광 현미경에 의한 전사 분석
1. MP-12와 EU 레이블을 초기 RNA와 세포를 감염
- 12 잘 조직 배양 플레이트에 장소는 12 mm 둥근 coverslips를 잘 당 하나의 coverslip을.
참고 : 세포가 우물에 배치하기 전에 문제의 coverslips을 준수, 폴리-L-라이신 (MW ≥ 70,000)와 코트가있는 경우. 이 목표로, 5 분 폴리-L-라이신의 H 2 O의 멸균 0.1 밀리그램 / ML 솔루션 잠수함의 coverslips. 최소한 2 시간 동안 멸균 H 2 O와 공기 건조에 coverslips를 씻어 내시오.
- coverslips는 위에 씨앗 293 세포에 잘 당 1 ML 성장 매체 (DMEM이 10 % 태아 소 혈청, 100 U / ML 페니실린 및 100 밀리그램 / ML 스트렙토 마이신을 포함)에 5 × 10 4 세포를 추가합니다. 37 가습 배양기에서 품어 ° C와 5 % CO 2 O / N.
- 3의 감염의 다중성 (모이)에서 MP-12와 세포를 감염. 포함 적어도 두<....
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결과
RVFV의 NSS 단백질 (가족 Bunyaviridae, 속 Phlebovirus)는 11 두 가지 메커니즘을 통해 숙주 세포의 일반적인 전사를 억제 (I) 봉쇄에 의한 P62의 프로 테오 분해를 촉진하여 기저 전사 인자 TFIIH 11 (II)의 P44 소단위 TFIIH 6 소단위. MP-12 균주는 바이오 안전성 수준이 실험실에서 처리 될 수 있으며에 다른 야생 적용되는 미국의 선택 에이전트 규칙에서 제외되기 때문에 RVFV MP-12 백신 균주 13이 프로토콜에 설명 된 실험에 사용 된 RVFV 균주를 입력합니다. MP-12 균주의 NSS 단백질은 완전한 기능 및 호스트 전사 6를 억제 할 수있는 능력을 유지합니다. NSS 유전자 14의 69 %를 포괄 삭제를 운반하는 바이러스 rMP12 - C13type는, 숙주 세포의 전사를 억제하는 기능을 포함하여 모든 NSS 기능을 .......
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토론
제공되는 프로토콜은 초기 RNA에 딘 아날로그 EU의 결합을 통해 숙주 세포의 전사에 바이러스 감염의 효과를 측정하는 방법을 설명합니다. 그것은 빠르고, 민감하고, 방사성 동위 원소의 사용에 의존하지 않는이 방법은 이전 방법에 비해 여러 가지 장점이 있습니다. 또한,이 방법은 형광 현미경이나 본질적으로 같은 시약을 사용하여 유동 세포 계측법을 통해 정량적 데이터를 질적 데이터를 산출하기 위해 적용 할 수 있습니다. 바이러스 성 항원에 대한 면역 형광 염색과 결합 될 때,이 방법은 연구자가 감염되지 않은 세포에서 감염 차별화 할 수 있습니다.
그것은 호스트 성적 증명서, 3 H-딘 또는 부순 법인에 의존하는 다른 방법으로 공유되는 단점을 레이블로이 방법은 또한 동일한 속도로 새롭게 합성 된 바이러스의 RNA 레이블을주의하는 것이 중요합니다. RVFV MP-12 감염의 경우 적어도 그러나, 우리는 발견 한 AMO지금까지 호스트 성적 UNT는 바이러스 사본의 양.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 마우스 클론 항 RVFV 항혈청 및 유동 세포 계측법에 대한 도움말 UTMB 유동 세포 계측법 핵심 시설의 M. 그리핀을 제공하는 RB Tesh 감사합니다. 이 작품은 UTMB.OL에서 제임스 W. McLaughlin이 원정대 기금 지원에 의해 지원되었다 UTMB.BK에서 백신 개발을위한 실리 센터에서 서부 지역 우수 센터, NIH 보조금 R01 AI08764301 및 자금 5 ~ U54 AI057156에 의해 지원되었다 모리스 R. Hilleman 초기 경력 조사자 포상 있습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 5-에티닐-우리딘 | 베리 어소시에이츠 | PY 7563 | 100 mM 스톡용 DMSO에 용해 |
| 12mm 원형 커버슬립 | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| 5 ml 폴리스티렌 튜브 | BD Biosciences | 352058 | |
| Actinomycin D (ActD) | Sigma | 9415 | 10 mM 스톡용 DMSO에 용해 |
| Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스 IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | Santa Cruz | sc-2323 | |
| CuSO4 | Sigma | C-8027 | 100 mM 주식 용 H2O에 용해 |
| DAPI | Sigma | D-9542 | FBS에 H2O에 용해 |
| Invitrogen | 16000044 | ||
| 형광 아지드(Alexa Fluor 594-coupled) | Invitrogen | A10270 | |
| 형광 아지드(Alexa Fluor 657-coupled) | Invitrogen | A10277 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-아스코르브산 | Sigma | A-5960 | 500mM 동안 H2O에 용해 |
| 종이 필터 | VWRbrand | 28333-087 | |
| 파라포름알데히드 | 시그마 | 158127 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 인비트로겐 | 15140122 | |
| 폴리-L-라이신 (MW ≥ 70000) | 시그마 | P1274 | |
| 트리톤 X-100 | 시그마 | T-8787 | |
| 트리즈마 베이스 | 시그마 | T-1503 | 1.5 M 스톡의 경우 H2O에 용해, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| Fluorescence Microscope | e.e. Olympus IX71 | ||
| 유세포 분석기 | e.e. BD Biosciences LSRII Fortessa |
참고문헌
- Fakan, S. Structural support for RNA synthesis in the cell nucleus. Methods Achiev. Exp. Pathol. 12, 105-140 (1986).
- Jensen, P. O., Larsen, J., Christiansen, J., Larsen, J. K. Flow cytometric measurement of RNA synthesis using bromouridine lab....
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재인쇄 및 허가
