여기서 물질은 고환 세균 세포의 3차원 크로마틴 구조를 보존하기 위해 개발된 방법을 설명한다. 이를 3차원(3D) 슬라이드 방법이라고 합니다. 이 방법은 비핵화 구조의 검출을 위한 감도를 향상시키고, 시상 혼성화(FISH)에서 면역형광, DNA 및 RNA 형광에 적용가능하다.
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이 논문에서
요약
초록
고환 세균 세포 분화 하는 동안, 핵 크로마틴의 구조는 동적으로 변경. 다음은 마우스에서 발견되는 고환 세균 세포의 3차원 크로마틴 배열을 보존하도록 설계된 방법을 설명합니다. 이 방법은 3차원(3D) 슬라이드 방법으로 불려졌다. 이 방법에서 고환 튜블러는 세포질 물질을 제거하는 투과화 단계로 직접 처리되고 핵 물질을 고치는 고정 단계가 뒤따릅니다. 튜블러는 그 때 해리되고, 세포 현탁액은 시토스펀이고, 세포는 슬라이드에 부착됩니다. 이 방법은 비핵화 구조의 검출에 대한 민감도를 향상시키고, 시상 혼성화(FISH)와 이러한 검출 방법의 조합에서 면역형광, DNA 및 RNA 형광에 적용가능하다. 3D 슬라이드 방법의 가능한 적용의 예로, Cot-1 RNA FISH는 초기 RNA를 검출하는 것으로 나타났다. 3D 슬라이드 방법은 고환 세균 세포 분화 중에 크로마틴 구조, DNA 및 RNA 사이의 공간 적 관계의 상세한 검사를 용이하게 할 것이다.
서론
고환에서, 생식 세포는 성숙으로 meiosis를 통해 diploid 정자고니아에서 분화, haploid 정자. 이 과정에서 세균 세포의 핵 크로마틴 구조는 지속적으로 동적으로 리모델링됩니다. 표면 확산은 일반적으로 개별 정자 생성 세포의 세포학적 검사에 사용됩니다. 표면 확산의 지배적인 방법은 개별 적인 정자 세포가 퍼지고 1을 평평하게 하는 저혈압 처리를채택합니다. 이 조건은 메이오성 염색체의 상세한 분석에 최적입니다. 시냅스 상태 및 재조합 포시와 같은 염색체 기능은 이 방법을 사용하여 쉽게 관찰된다. 그러나, 저혈압 처리는 핵 염색체 건축을 방해합니다, 따라서 이 기술은 핵의 구조분석에 적합하지 않습니다. 따라서, 향상된 방법은 고환 세균 세포의 3차원 크로마틴 구조를 보존하도록 설계되었습니다. 이 방법은 3차원(3D) 슬라이드방법(도 1)으로지칭되었다. 상기 3D 슬라이드 방법은 시상 혼성화(FISH)2,3에서RNA 형광에 의한 고환 세균 세포 분화 시 유전자 발현 및 크로마티닌 상태를 검사하도록 최적화되었기 때문에 핵에서 초기 RNA 국소화의 검출을 가능하게 하였다. 이 3D 방법은 면역 형광, DNA 및 RNA FISH의 조합에도 적용됩니다. 추가적으로, 이 방법은 포스트 메이오틱 성 크로마틴 (....
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프로토콜
1.3D 슬라이드 준비
- 다음 시약을 준비합니다.
- CSK 버퍼: 100 mM NaCl, 300 mM 자당, 10 mM 파이프, 3 mM MgCl2. pH를 1M NaOH로 6.8로 조정합니다. CSK 버퍼를 4°C에 저장합니다.
- 0.5% 트리톤 X-100을 가진 CSK 버퍼: 트리톤 X-100 ~ 40ml의 200 μl을 CSK 버퍼를 추가합니다. 트리톤 X-100이 완전히 용해될 때까지 자기 교반기로 용액을 섞습니다. CSK 버퍼를 0.5% 트리톤 X-100을 4°C에 저장합니다.
- 4% 파라포름알데히드(PFA)-PBS, pH 7.4: 약 70-80ml의 물에 PFA 4 g을 녹입니다. 용해 과정을 촉진하기 위해, 4 N NaOH의 약 20 μl을 추가하고 PFA가 완전히 용해되고 용액이 투명해질 때까지 60 °C에서 수조에 용액을 유지합니다. 이 프로세스는 약 1 시간이 걸립니다. PFA가 완전히 용해 된 후 10x PBS 10ml를 추가하십시오. 최종 부피를 물로 100ml로 조정하고 용액을 실온(25°C)으로 식힙니다. 새로 준비된 솔루션을 각 새로운 실험에 사용합니다.
참고: 모든 동물 작업에 대한 제도적 허가를 받고 관련 동물 관리 지침을 준수합니다.
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결과
3D 슬라이드의 대표적인 결과는 도 2에표시됩니다. 본 실험에서, Cot-1 RNA FISH는 항 CBX1 및 γH2AX 항체를 사용하여 면역 염색과 함께 초기 전사를 검출하기 위해 수행되었다. RNA FISH와 면역염색을 결합하기 위하여는, 면역염색은3에서기술된 바와 같이 RNA FISH에 선행된 1차 행하되었습니다. CBX1은 XY 바디 (또는 성몸)에게 불린 메이오시스에 있는 pericentromeric 이종및 침묵하는 성 염색체에 현지화하는 이종국단백질 단백질입니다. γH2AX는 히스톤 변종 H2AX의 인포화 형이며 XY 본체에 국한된다. 이 그림에서, Cot-1 신호는 유축 영역에 축적되지만, pericentromeric 이종학 및 XY 바디에서 제외됩니다.
표면 확산 준비 중에 저혈압 용액을 가진 치료는 핵을 팽창시키고 물리적으로 비핵화 구조를 확장합니다. 메이오틱 연구를 위한 이 일반적인 방법은 단일 z-plane
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토론
3D 슬라이드 준비에서, 투과단계는 고정 단계 앞에 있다. 이러한 단계는 반열구관에서 직접 수행되어 3차원 크로마틴 구조를 보존합니다. RNA/DNA FISH에 대한 크로마틴 구조를 보존하는 대체 옵션은 투과화 단계와 고정 단계를 동시에 수행하는 것입니다. 이 대체 기술은 marsupial 세균 세포및 마우스 전 이식 배아7,8에서수행되었습니다. 그러나, 고정 단계가 투과화 단계보다 앞서는 경우, 높은 세포질 배경을 야기할 수 있다. 따라서, RNA 및 DNA FISH에 대한 슬라이드 최적화의 중요한 결정요인은 투과화 및 고정 단계의 순서에 의존한다. 투과화 단계의 지속 시간또한 슬라이드 준비의 최적화를 위한 중요한 요소입니다. 6분은 이 방법의 일반적인 조건입니다. 그러나 사용되는 재료의 변화에 따라 조정할 수 있습니다.
3차원 크로마틴 구조의 보존은 표면 확산 슬라이드와 뚜렷하게 분리되는 3D 슬라이드의 특징입니다. 이 장점은 염색체 퍼짐 준비와 크게 다릅.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
나는 리 연구소와 타일러 브루링에있을 때이 프로젝트의 감독 지니 T. 리 감사 원고를 편집. 이 작품은 Dimes 재단과 NIH 그랜트 GM098605의 3 월에서 바질 오코너 스타터 장학금 상에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 콧-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | |
| Stratagene Prime-It Fluor 형광 라벨링 키트 | Agilent | 300380 | |
| 청어 정자 DNA 용액 | Invitrogen | 15634-017 | |
| 에탄올. 200 proof (absolute) | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| Formamide deionized | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| 구연산나트륨 삼염기성 이수화물 | 시그마-알드리치 | C8532 | |
| 소 혈청 알부민 | Lifeblood Medical | 77110-100 | |
| Leuconostoc spp.의 덱스트란 황산염 나트륨 염 | 시그마-알드리치 | D6001 | |
| RPMI 1640 | 인비트로겐 | A10491-01 | |
| 수당 | 시그마-알드리치 | S0389 | |
| 파이프 | 시그마-알드리치 | P6757 | |
| 염화마그네슘 육수화물 | 시그마-알드리치 | M0250 | |
| 트리톤 X-100 | 시그마-알드리치 | T8787 | |
| 파라포름알데히드 | Sigma-Aldrich | 76240 | |
| 수산화나트륨 | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| 인산염 완충 식염수 | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| VECTASHIELD 마운팅 배지 with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S | |
| Illustra MicroSpin G-50 열: | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
| 마이크로 원심분리기 | Eppendorf | 5424 | |
| 집게 | VWR | 300-050 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브 | Bioexpress | C-3262-1 | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| Coplin Jar | Fisher | 08-815 | |
| Superfrost /Plus 현미경 슬라이드 | Fisher | 12-550-15 | |
| 4-웰 디쉬 | Fisher | 12-566-301 | |
| 커버 글라스 | Fisher | 12-544-G | |
| 공기 인큐베이터 | Revolutionary Science | RS-IF-203 |
참고문헌
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Namekawa, S. H., et al. Postmeiotic sex chromatin in the male germl....
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재인쇄 및 허가
