점막 세균 감염에 응하여 호중구 트랜스 상피 이동은 상피 손상 및 임상 질병에 기여합니다. 시험관 내 모델은 병원체, 인간 호중구 및 트랜스웰 필터에서 자란 편광 된 인간 상피 세포 층을 결합하여이 현상을 조율하는 분자 메커니즘을 해명하는 쪽으로 조사를 용이하게하는 것으로 개발되었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
점막 표면은 병원성 유기체에 대한 보호 장벽 역할을합니다. 선천성 면역 반응은 주로 호중구를 마이그레이션하는 염증 세포와 조직의 침투로 이어지는 병원균을 감지할 때 활성화됩니다. 이 과정은 과도하거나 해결되지 않은 상태로 유지되는 경우 조직에 파괴적 일 가능성이 있습니다. 체외 모델의 공동 배양은 병원체 유도 호중구 트랜스 상피 이동에 관여하는 독특한 분자 메커니즘을 연구하기 위해 활용될 수 있다. 이 유형의 모델은 병원체, 상피 장벽 또는 호중구의 제어 조작기회를 통해 실험 설계의 다기능성을 제공합니다. 투과성 트랜스웰 필터에서 자란 편극상 단층의 정량적 표면의 병원성 감염은 생리학적으로 관련된 바소포탈을 유혈성 호중구 표면에 적용한다. 본 명세서에서 기술된 시험관 내 모델은 병원성 P. aeruginosa (PAO1)에 감염된 편광폐 상피 단층을 통해 호중구 이주를 입증하는 데 필요한 다중 단계를 보여줍니다. 인간 유래 폐 상피 세포와 투과성 트랜스웰의 파종 및 배양은 전체 인간의 혈액으로부터 호중구의 격리와 함께 PAO1 및 비병원성 K12 E. 대장균(MC1000)의 배양과 함께 설명된다. 병원성 감염에 대응하여 동원된 성공적으로 이주한 호중구의 이민 과정 및 정량적 분석은 양성 및 음의 대조군을 포함한 대표적인 데이터로 나타난다. 이 시험관 내 모델 시스템은 조작하여 다른 점막 표면에 적용할 수 있습니다. 과도 한 호중구 침투를 포함 하는 염증 성 응답 호스트 조직에 파괴 될 수 있으며 병원 성 감염의 부재에서 발생할 수 있습니다. 본 명세서에 기재된 체외 공동학 분석 시스템의 실험적 조작을 통해 호중구 트랜스 상피 이동을 촉진하는 분자 메커니즘에 대한 더 나은 이해는 염증성 질환뿐만 아니라 다양한 점막 전염에 대한 새로운 치료 목표를 식별할 수 있는 중요한 잠재력을 가지고 있다.
서론
점막 표면은 환경에 만연한 외부 위협에 대한 보호를 제공하는 물리적 및 면역학 장벽 역할을한다 1,2. 병원성 유기체가2를침공할 때 이러한 보호 상피 장벽이 손상될 수 있다. 세균성 병원균의 경우, 이러한 만남은 종종 선천성 면역 체계를 활성화하고 호중구로 알려진 응급 구조자 과립구의 신속한 동원을 유발하여 염증 과정을선동2-4. 호중구 모집을 용이하게 하는 항암제는2-4의상피성 세포를 제거하려는 점막 상피 세포에 의해 부분적으로 생성된다. 점막 상피 표면의 과도하거나 해결되지 않은 호중구 침투는 중요한 병리학을 유발할 수있다 1,5. 이는 항균 호중구 무기고5-7에의한 비특이적 조직 손상의 결과입니다. 이러한 경우에, 호중구의 세균성 통관 능력은 전염성 모욕 도중 호스트 조직의 파괴에 의해 가려져 있습니다. 보호 상피 장벽 기능의 중단은 미생물 및 / 또는 독소에 기본 조직의 향상된 노출로 이어질 수 있습니다, 질병 병리학을 더욱 악화8,9. 이러한 결과는 폐 및 소화관을 포함한 여러 장기 시스템에서 관찰될 수 있다1,5. 더욱이, 천식의 심한 시합, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 염증성 장질환(I....
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프로토콜
단계(1-3)는 라미나르 플로우 후드 하에서 멸균 환경에서 수행해야 합니다.
1. 콜라겐 코팅 트랜스웰
- 30 μg/ml 콜라겐 용액을 만듭니다. 0.2 μm 필터 장치를 통해 전달된 60% 에탄올에서 3 mg/ml 콜라겐 육수 1:100을 희석시합니다.
- 소용돌이 희석 30 μg/ml 용액. 참고: 이 솔루션은 점성이 매우 있고 기포가 도입될 수 있으므로 3 mg/ml 콜라겐 스톡 솔루션을 소용돌이칠 필요가 없으며, 파이펫팅 시 정확도가 떨어질 수 있습니다.
- 외부 포장에서 3 μm의 기공 크기로 0.33cm2 성장 영역 트랜스웰을 제거하고 후드 내부에 12 개의 트랜스웰이 들어있는 24 웰 플레이트를 거꾸로 놓습니다.
- 바닥 접시를 들어 올리고 옆으로 놓습니다. 참고 : 트랜스 웰은 이제 24 웰 플레이트의 뚜껑 꼭대기에 거꾸로 휴식될 것입니다.
- 번센 버너를 켭니다. 불균에 대한 화염 헤모스타트와 식힙니다.
- 멸균 헤모스타트로 트랜스웰을 150mm x 25mm 페트리 접시로 옮기면 반전 된 위치에 보관하십시오. 참고: 상피 세포로 씨를 뿌려나면 빈 24웰 플레이트와 뚜껑이 트랜스웰을 수용하는 데 사용할 수....
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결과
몇몇 연구 결과는 병원체 감염한 상피 층이 호중구 환피상피이동3,8,19,24-28,31,32를용이하게 한다는 것을 보여주었습니다. 이는 상피 세포 유래 호중구 화학작용체 그라데이션3,23의병원체 특이적 유도를 통해 발생한다. 예를 들어, 병원성 P. 아에루기노사가 폐 상피 세포의 정표면과 상호 작용하여 상피층18,22,25,26,33,34를통해 이동하는 호중구의 상당수를 일으킨다. 이 임상적으로 관련된 분석 시스템은 적절한 제어와 결합 할 때 주요 병원균 및 호스트 분자 기여자를 공개하는 여러 가지 방법으로 조작 될 수있다.
미리 감염되지 않은 편광 상피 세포 층에 추가된 호중구는 상당한 숫자로 마이그레이션하지 못합니다. 그러나, 감염되지 않은 상피 층을 통해 화학 요법 그라데이션의 응용 프로그램은 전역 호중구의 상당수를 구동합니다. 병원체 감염 상피 층을 통해 호중구 이주를 조사할 때 각 분석결과 내에.......
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토론
점막 상피 표면을 가로지르는 호중구 이동은 세균병원균3을가진 감염 다음 질병 병리학에서 일반적인 특징이다. 본 명세서에 기재된 방법론은 세균 감염에 의해 유발되는 염증 과정의 특징을 모델하는 체외 공동문화 분석 시스템에서 유래된 인간 세포를 사용하여 이 개별 이벤트를 실험적으로 격리하는 신속하고 간단한 접근법을 제공한다. 본 시스템은 원래 살모넬라 티피무륨, 시겔라 플렉스네리,및 다양한 병원성 대장균8,19,24,27,28을포함한 장내 병원균에 감염된 편광장 상피세포를 사용하여 개발되었다. 이러한 병원성 유기체의 각각은 거꾸로 된 콜라겐 코팅 투과성 트랜스웰 필터에서 자란 편광 장 상피 단층에서 호중구를 구동 할 수 있습니다. 이 실험 시스템은 폐 상피 장벽과 병원체 유도 호중구 트랜스 상피 이동18,26을탐구하는 수정으로 적응되었다. H292를 제외한 여러 기도 상피 세포주는 일반적으로 인용된 A549, .......
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공개 사항
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
감사의 글
이 작품은 NIH (1 R01 AI095338-01A1)에 의해 재정적으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| NCl-H292 세포 | ATCC | CRL-1848 | |
| RPMI-1640, 매체 | ATCC | 30-2001 | |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | ATCC | #47085 | |
| Escherichia coli MC1000 | ATCC# | 39531 | |
| D-PBS(1x) 액체 | Invitrogen | 14190-144 | |
| 열 비활성화 소 태아 혈청 | Invitrogen | 10082-147 | 10% 배양 배지에 |
| 추가 페니실린-스트렙토마이신 | Invitrogen | 15140-122 | 100x: 페니실린 10,000 단위 및 10,000 &마이크로; ml당 스트렙토마이신의 g. |
| 트립신-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300-062 | 50ml 분취액은 -20°C에서 냉동 보관됩니다. 사용 중인 부분 표본은 4 º에서 저장할 수 있습니다. C 단기. |
| Hank's Balanced Salt Solution - HBSS(-) | Invitrogen | 14175-079 | 멸균, 칼슘 및 마그네슘 미함유 |
| Trypan Blue Solution | Invitrogen | 15250-061. | 주식 = 0.4% |
| 콜라겐, 쥐 꼬리 | Invitrogen | A10483-01 | 표준 프로토콜을 사용하여 실험실에서 쥐의 꼬리에서 직접 분리 할 수도 있습니다 |
| 연산 | Sigma-Aldrich | C1909-500G | 1 M 구연산 완충액 및 산 구연산 포도당 (ACD) 용액의 구성 요소 |
| 구연산 나트륨 | Sigma-Aldrich | S4641-500G | 1 M 구연산 완충액 |
| 성분 포도당 무수 | 시그마-알드리치 | D8066-250G | 산성 시트레이트 포도당(ACD) 용액의 구성 요소 |
| 암모늄 | 시그마-알드리치 | 213330-500G | 적혈구(RBC) 용해 완충액의 구성 요소 |
| 탄산나트륨 | 시그마-알드리치 | S6014-500G | 적혈구(RBC) 용해 완충액 EDTA |
| 시그마-알드리치 | ED-100G | 적혈구(RBC) 용해 완충액의 구성 요소 | |
| HBSS(+) 분말 | 시그마-알드리치 | H1387-10L | HBSS+HEPES의 주요 구성 요소 |
| 시그마-알드리치 | H3375-500G | HBSS+ | |
| 시그마코트 | 요소 시그마-알드리치 | SL2-25ML | 공급업체 지침에 따라 유리 피펫 팁을 코팅하십시오 |
| 트리톤 X-100 | 시그마-알드리치 | T-9284 | |
| 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산) 디아모늄 염 (ABTS) | Sigma-Aldrich | A9941-50TAB | ABTS 기질 용액의 주요 구성 요소 |
| 30 % 과산화수소 용액 | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | ABTS 기질 용액 |
| N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP 또는 fMLF) | 의 구성 요소Sigma-Aldrich | F-3506 | DMSO에서 10 mM의 원액을 준비하고 분취액을 -20 °C에서 보관해야합니다. |
| 젤라틴 타입 B | 피셔 사이언티픽 | M-12026 | |
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| Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-749 | 선택 사항, 호중구 순도를 향상시킬 수 있습니다 |
| 24-웰 마이그레이션 플레이트 | Corning Incorporated | #3524 | |
| 24-웰 워시 플레이트 | Falcon | 35-1147 | 70% 에탄올에 담그고 재사용 전에 철저히 세척하면 재사용 가능 |
| 96-웰 플레이트 | Fisher Scientific | #12565501 | |
| Transwell Permeable Supports | Corning Incorporated | #3415 | 폴리카보네이트; 직경 : 6.5 mm; 성장 면적 : 0.33 cm2< / sup>; 접시 스타일: 24웰 플레이트; 기공 크기: 3.0 &마이크로; m |
| 페트리 디쉬 | Falcon | 35-1013 | 각 페트리 디쉬는 24개의 반전된 0.33 cm를 담을 수 있습니다2 Transwells. |
| 500 ml 0.2 & m 필터 / 플라스크 | Fisher Scientific | 09-740-25A | 산 시트레이트 덱스트로오스(ACD) 용액 |
| 5-3/4를 | Fisher Scientific | 13-678-20A | 사용 전 Sigmacote로 팁 코팅 |
| Fisher Scientific | 13-812-14 | 곡선, 톱니 모양의 | |
| 인버토스코프 도립 현미경 | Zeiss | #342222 | |
| Versa-Max 마이크로플레이트 리더 | 분자 장치 | #432789 |
참고문헌
- Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung. Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).
- Hurley, B. P., McCormick, B. A. Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threat....
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재인쇄 및 허가
