시험관 내 병원균 유도 호중구 트랜스 상피 이동을 평가하는 공동 문화 분석

점막 표면은 환경에 만연한 외부 위협에 대한 보호를 제공하는 물리적 및 면역학 장벽 역할을^{한다 1,2.} 병원성 유기체가^2를침공할 때 이러한 보호 상피 장벽이 손상될 수 있다. 세균성 병원균의 경우, 이러한 만남은 종종 선천성 면역 체계를 활성화하고 호중구로 알려진 응급 구조자 과립구의 신속한 동원을 유발하여 염증 과정을^선동2-4. 호중구 모집을 용이하게 하는 항암제는^2-4의상피성 세포를 제거하려는 점막 상피 세포에 의해 부분적으로 생성된다. 점막 상피 표면의 과도하거나 해결되지 않은 호중구 침투는 중요한 병리학을 유발할 수^{있다 1,5.} 이는 항균 호중구 무기고^5-7에의한 비특이적 조직 손상의 결과입니다. 이러한 경우에, 호중구의 세균성 통관 능력은 전염성 모욕 도중 호스트 조직의 파괴에 의해 가려져 있습니다.  보호 상피 장벽 기능의 중단은 미생물 및 / 또는 독소에 기본 조직의 향상된 노출로 이어질 수 있습니다, 질병 병리학을 더욱 악화^8,9. 이러한 결과는 폐 및 소화관을 포함한 여러 장기 시스템에서 관찰될 수 있다^1,5. 더욱이, 천식의 심한 시합, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 염증성 장질환(IBD) 등 비감염성 질환은 과도한 호중구 반응에 의한 점막 상피 장벽의 병리학적 위반에 의해 표시된다^4,5,10-12.

점막 감염 에 따른 호중구 모집의 복잡한 과정은 여러 구획 단계^1,5,13,14를포함한다. 첫째, 호중구는 내피 이동^1,13을용이하게 하는 일련의 세포 대 세포 상호 작용을 통해 순환에서 출발해야 한다. 호중구는 다음 세포 외 매트릭스를 포함하는 기존의 중간 공간을 탐색^1,14. 감염된 점막의 루멘에 도달하려면 호중구는 상피 장벽^1,4,5를가로 질러 이동해야합니다. 이 복잡한 다단계 현상은 감염^15의생체 내 동물 모형을 사용하여 집계에서 수시로 조사됩니다. 이러한 모델은 전체 공정에 참여하지만 각 뚜렷한 구획화^{단계(16)에}중요한 분자 기여도를 해결하기에는 크게 부적당한 체모키인, 접착 분자 또는 신호 경로와 같은 특정 요인의 필요성을 확립하는 데 유용하다. 호중구의 트랜스 내피, 트랜스 매트릭스 또는 트랜스 상피 이동을 모델링하는 시험관 내 시스템 내계가^{1,14,16,17에서}특히 유용하였다.

견고한 동문화 분석 시스템은 병원성 감염^18-22에대응하여 호중구 트랜스 상피 이동을 담당하는 메커니즘을 해독하기 위한 목적으로 개발되었다. 이 모형은 세균성 병원체를 가진 편광된 인간 상피 세포 층의 정압 표면을 감염시키는 것을 관련시킵니다^18-22바칼측 표면에 새로 고립된 인간 호중구의 적용에 선행된. 호중구는 상피 유래 화학 물질 제품에 대한 응답으로 상피 장벽을 가로 질러 이동^18,21-23병원성 감염 다음 분비. 본 모델 시스템은 적절한 조직 특정 세균병원균에 노출된 장 및 폐 상피 배양을 사용하여 사용되었으며 점막 감염 시 호중구 모집 과정에 중요한 새로운 분자 메커니즘을^{3,8,19,24-28로}발표했다. 이 체외 공동문화 모델의 강점은 감소주의자 접근법을 통해 조사관이 잘 통제되고, 매우 재현가능하고, 상당히 저렴한 시스템에서 병원체, 상피 장벽 및/또는 호중구를 실험적으로 조작할 수 있게 한다는 것입니다. 이러한 접근법으로부터 수집된 통찰력은 생체 내 감염 모델^22,29,30을사용하여 호중구 모집 중 구획화 된 사건의 집중분석을 수행하기 위해 효과적으로 활용할 수 있다.

이 문서에서는 병원균 유도 호중구 트랜스 상피 이동을 탐구하기 위해이 재현 가능한 모델의 성공적인 설립에 필요한 여러 단계를 보여줍니다. 병원균 슈도모나스 아에루기노사에 감염된 폐 상피 장벽은 이 논문에 등장한다. 그러나, 그밖 조직 상피및 병원체는 경미한 수정으로 대체될 수 있습니다. 겨드개한 콜라겐 코팅 투과성 트랜스웰 필터에 편광 폐 상피 세포 층의 파종 및 배양은 병원성 P. aeruginosa의 성장과 전혈에서 호중구의 격리와 마찬가지로 본원에 상세합니다. 이러한 성분들이 병원균 유발 호중구 트랜스 상피 이동을 관찰하기 위해 결합되는 방법은 재현 가능한 분석법을 확립하기 위해 적절한 양성 및 음수 제어와 함께 제시된다. 병원체 유도 호중구 트랜스 상피 이동의 다양한 측면을 검사하는이 접근 방식의 다양성은 문학에서 특정 연구에 대한 참조와 함께 논의된다.

단계(1-3)는 라미나르 플로우 후드 하에서 멸균 환경에서 수행해야 합니다.

1. 콜라겐 코팅 트랜스웰

1. 30 μg/ml 콜라겐 용액을 만듭니다. 0.2 μm 필터 장치를 통해 전달된 60% 에탄올에서 3 mg/ml 콜라겐 육수 1:100을 희석시합니다.
2. 소용돌이 희석 30 μg/ml 용액. 참고: 이 솔루션은 점성이 매우 있고 기포가 도입될 수 있으므로 3 mg/ml 콜라겐 스톡 솔루션을 소용돌이칠 필요가 없으며, 파이펫팅 시 정확도가 떨어질 수 있습니다.
3. 외부 포장에서 3 μm의 기공 크기로 0.33cm² 성장 영역 트랜스웰을 제거하고 후드 내부에 12 개의 트랜스웰이 들어있는 24 웰 플레이트를 거꾸로 놓습니다.
4. 바닥 접시를 들어 올리고 옆으로 놓습니다. 참고 : 트랜스 웰은 이제 24 웰 플레이트의 뚜껑 꼭대기에 거꾸로 휴식될 것입니다.
5. 번센 버너를 켭니다. 불균에 대한 화염 헤모스타트와 식힙니다.
6. 멸균 헤모스타트로 트랜스웰을 150mm x 25mm 페트리 접시로 옮기면 반전 된 위치에 보관하십시오. 참고: 상피 세포로 씨를 뿌려나면 빈 24웰 플레이트와 뚜껑이 트랜스웰을 수용하는 데 사용할 수 있도록 멸균을 유지해야 합니다.
7. 30 μg/ml 콜라겐 용액의 파이펫 70 μl은 각 반전 된 트랜스웰의 필터 멤브레인에. 참고: 아래쪽 표면에 접근할 때 필터 멤브레인 주변에 벽이 없기 때문에 표면 장력은 이 솔루션 볼륨을 제자리에 고정해야 합니다. 콜라겐 용액이 트랜스웰의 측면을 떨어 뜨리지 않고 코팅 절차 중에 트랜스웰이 움직이지 않도록주의하십시오.
8. 페트리 접시뚜껑을 최소 4시간 동안 꺼서 에탄올 용액이 증발할 수 있도록 하십시오. 이 과정에서 멸균을 유지하기 위해 후드 팬과 자외선을 유지합니다.
9. 트랜스웰이 건조된 후, 페트리 접시 덮개가 제자리에 있고 멸균이 유지되는 경우, 즉시 또는 실온에서 최대 1주일 동안 보관할 수 있다.

2. 종전 성전을 위한 상피 세포의 통로 플라스크

(이 프로토콜은 특히 트랜스웰에서 자란 상피 장벽의 생성을 위한 폐 상피 세포주 H292의 처리를 설명합니다. 다른 상피 세포주는 약간의 변형과 함께 사용할 수 있습니다.)

1. RPMI 1640에 10% 열 불활성 태아 소 혈청(HI-FBS)과 페니실린/스트렙토마이신 1배를 추가하여 배양 배지를 준비한다.
2. 따뜻한 미디어, 트립신-EDTA (T-EDTA), 및 37 ºC 수조의 D-PBS.
3. 인큐베이터에서 세포를 포함하는 T-75 플라스크를 제거하고 반전 된 현미경으로 시각적으로 합류를 평가하십시오. 참고: H292 셀을 사용하는 경우 플라스크가 가까이 있거나 완전히 혼잡해야 합니다.
4. 플라스크에서 미디어를 흡인. 캡이 느슨해진 후드의 다음 용액을 사용하여 세포가 건조한 시간을 줄입니다.
5. T-75 플라스크에 5ml D-PBS를 넣고 소용돌이세요. 거품을 만들지 마십시오. 포부로 PBS를 제거합니다.
6. T-75 플라스크에 3ml T-EDTA를 넣고 바닥을 덮습니다.
7. T-EDTA의 대부분을 제거, T-75 플라스크에 약 0.3 ml를 떠나.
8. T-EDTA의 작은 남은 부피를 세포의 표면적 위에 분배하고 표준 배양 조건(37ºC, 5%_CO2)에따라 가습된 인큐베이터에 배치한다.
9. 시간이 지나면 인큐베이터에서 플라스크를 제거하십시오. 참고: 세포는 플라스크 표면에서 옆으로 플라스크를 부드럽게 눌러 쉽게 분리해야 합니다. 세포는 현미경으로 시각화될 때 둥글게 하고 떠 있어야 합니다. H292 세포에 대 한 걸리는 평균 시간은 5-10 분.
10. T-EDTA를 중화하고 세포를 다시 중단하기 위해 플라스크에 10ml 배양 매체를 추가합니다. 세포 용액을 파이펫 팁으로 끌어내고 모든 세포를 재보페하기 위해 약 5번 세포를 포함하는 플라스크 표면으로 배출합니다.
11. 재중단된 세포를 15ml 튜브로 이송하여 트랜스웰을 파종합니다. 참고: 이러한 방식으로 제조된 재중단 H292 세포의 농도는 약 1 x 10 6-1.8 x 10⁶ 셀/ml 사이여야 합니다.

3. 상피 세포와 종자 콜라겐 코팅 트랜스웰

1. 15ml 튜브에서 70 μl의 재일시 중단된 세포 용액을 각 반전된 콜라겐 코팅 트랜스웰에 추가합니다. 참고: 1 x 10⁶-1.8 x 10⁶ 셀/ml 사이의 농도 범위를 가진 H292 세포 용액은 약 70,000-120,000 세포/트랜스웰을 생성합니다.
2. 세포를 주기적으로 반전시켜 세포가 15ml 튜브의 바닥에 침전되는 것을 방지하여 트랜스웰을 파종합니다. 참고: 피펫 팁이 콜라겐 코팅 멤브레인 필터와 직접 접촉하지 않도록 주의하십시오.
3. 모든 반전 된 트랜스웰이 상피 세포로 시드되면 페트리 접시 커버를 교체하고 조직 배양 배양기, 가습, 37 ºC, 5 % CO_2에신중하게 배치하십시오. 콜라겐 코팅 필터 멤브레인에 첨가된 세포 현탁액을 방해하지 않도록 주의하십시오.
4. 조직 배양 인큐베이터, 가습, 37 ºC, 5% CO₂ 하룻밤 동안 반전 된 트랜스웰을 유지합니다. 참고: 세포를 포함하는 액체의 거품은 하룻밤 잠복에 걸쳐 트랜스웰의 투과성 필터 막과 연관되어 있어야합니다. 필터 멤브레인이 액체의 증발로 인해 건조해지거나 액체가 트랜스웰의 측면 아래로 떨어지기 때문에 상피 층이 제대로 자라지 않을 수 있습니다.
5. 다음 날, 원래 멸균 24 웰 플레이트에 1 ml 미디어를 추가하고 1 ml의 미디어를 포함하는 각 우물에 살균 된 hemostat을 사용하여 각 반전 트랜스웰을 뒤집습니다.
6. 각 트랜스웰의 상부 챔버에 0.2 ml 배지를 추가하고 조직 배양 인큐베이터, 가습, 37   ºC, 5 % CO_2로돌아갑니다.
7. H292 반전 트랜스웰은 시드 후 8일에서 1개월까지 사용할 수 있습니다. 참고: 상피 단층이 완전히 형성되고 기능적 장벽을 나타내도록 트랜스웰의 시드 후 최소 8일을 기다리는 것이 좋습니다. 하나는 단층이 바칼라측면(18)에 추가된 다음 단백질 말 무 과산화제(HRP)의 트랜스 상피 플럭스를 제한할 수 있는지 여부를 결정함으로써H292 상피 장벽을 시험할 수 있다.

4. 트랜스웰에 상피 층의 감염을위한 박테리아의 준비

1. 실험 하루 전에, 슈도모나스 격리 Agar 플레이트에서 P. aeruginosa PAO1의 식민지 를 추출하고 루리아 베르타니 (LB) 아가 플레이트에서 K12 E. 대장균 MC1000의 한 식민지를 추출하고 LB 국물의 3 ml를 포함하는 별도의 튜브에 배치. 주의: P. aeruginosa는 인간 병원체, 표준 BSL2 안전 대책이 유기체를 취급할 때 채택되어야 합니다.
2. 37 ºC 환경에서 225 rpm에서 하룻밤 동안 흔들어 주세요.
3. 다음 날, 조밀 한 세균 배양에서 1 ml를 제거하고 1.5 ml 에펜도르프 튜브에 배치합니다.
4. 마이크로퍼지에서 15,800 x g에서 5분 동안 회전한 다음 상복부에 제거합니다.
5. 칼슘과 마그네슘(HBSS+)으로 행크스의 균형 잡힌 소금 용액을 미리 준비하십시오. 9.5 L 증류수에 23.8g HEPES 및 97.5 g HBSS+ 분말을 넣습니다. 소량의 10M NaOH를 솔루션에 추가하고, 7.4의 안정적인 pH에 도달할 때까지 pH를 모니터링합니다. 최대 10L의 볼륨을 가져와 4ºC에 보관하십시오.
6. 각 세균성 펠릿을 1ml HBSS+로 재연합니다. 소용돌이도 세균 현탁액이 달성되는지 확인합니다.
7. 5 분 동안 15,800 x g에서 다시 회전하고 상체를 제거합니다.
8. 0.6 ml HBSS+와 0.5 ml HBSS+와 MC1000 펠릿으로 PAO1 펠릿을 다시 중단합니다. 세균 현탁액을 소용돌이.
9. 또한 HBSS +에서 PAO1 및 MC1000 재일시 중단 된 펠릿 1:100을 희석합니다. 예를 들어, 0.6 ml PAO1 재일시 중단 펠릿의 50 μl을 HBSS+에 추가합니다. 참고: 광학 밀도(OD) 측정을 사용하여 배양 밀도뿐만 아니라 표준 콜로니 성형 장치(CFU) 희석 도금 방법론, PAO1 및 MC1000 솔루션이 3 x 10⁷-6 x 10⁷ CFU/ml 사이에서 일관되게 수율을 산출합니다. 세균 배양의 밀도는 600 nm에서 배양의 OD 측정과 긍정적으로 상관관계가 있으며 이러한 상관관계는 세균세포 농도를 추정하는 데 사용될 수 있다. 세균성 세포 농도를 확인하기 위해 배양은 매우 낮은 추정 농도로 희석되고 한천 판상에서 도금되어 30-200 개의 박테리아 세포가 플레이트에 존재할 것으로 기대할 수 있습니다. 세포는 플레이트를 가로질러 퍼져 있고 37 ºC에서 하룻밤 동안 배양되어 각 세포가 눈에 띄게 충분히 큰 세포의 개별 식민지를 형성하고 식민지를 계산할 수 있습니다.

5. 전혈에서 호중구의 격리

1. 산성 구연산 덱스트로스 용액(ACD)은 항응고제로 사용되며 구연산 6.9g, 구연산 나트륨 12.5g, 덱스트로스 10g을 증류수 500ml에 첨가하여 제조한다. 모든 부품이 용해되면 ACD 용액은 0.2 μm 필터 장치를 통과하여 멸균됩니다. 4ºC에 ACD 솔루션을 저장합니다.
2. 혈액을 그리기 전에 5ml ACD를 50ml 주사기에 넣고 21 x 3/4 G 버터플라이 바늘과 12개의 튜브를 부착합니다.
3. 지혈대를 바르고, 정맥을 알코올로 닦고, 바늘을 삽입합니다. 참고: 인간 과목과 관련된 모든 연구 프로토콜은 기관 검토 위원회의 승인을 받아야 하며 각 혈액 기증자로부터 서면 동의를 제공해야 합니다. 예를 들어, 이 프로토콜을 사용하여 수행된 실험은 매사추세츠 종합 병원 기관 검토 위원회에 의해 승인되었으며 #1999-P-007782프로토콜을 할당하였다.
4. 천천히 혈액 45ml를 그려 주사기에 한 번 ACD와 혈액이 혼합되도록합니다.
5. 45ml가 그려지면 (총 부피 50ml) 바늘을 제거하기 전에 지혈대를 풀세요. 바늘을 제거할 때 멸균 거즈로 감기 위해 즉시 압력을 가하십시오.
6. 혈액을 약 5-10 초 이상 50 ml 튜브의 측면아래로 천천히 전달합니다.
7. 원심분리기에서 1,000xg에서 회전하면 실온에서 20분 동안 브레이크가 비활성화됩니다. 참고: PBS에서 전혈의 희석을 수반하는 추가 단계- 원심분리 전에 피콜-파케에 희석된 혈액의 신중한 오버레이는 과립구로부터 버피 코트를 보다 효율적으로 분리하여 약간 더 높은 수준의 호중구 순도를 달성하기 위해 사용될 수^{있다 8.} 이 단계를 생략하는 것은 이 분석의 목적을 위해 수율이나 순도에 크게 영향을 미치지 않고 시간을 절약하는 역할을 하므로 피콜-Paque 단계에 혈액 오버레이를 포함하지 않는 것을 선호합니다.
8. 혈액이 회전하는 동안, 매우 천천히 칼슘과 마그네슘 (HBSS (-)없이 50ml 가열 행크스의 균형 소금 용액에 1 g 젤라틴을 추가하여 2 % 젤라틴 용액을 준비합니다. 37 ºC에서 솔루션을 유지합니다.
9. 시그마호테로 치료된 유리 파이펫 팁을 사용하여 혈액 50ml 튜브에서 플라즈마를 흡입하고 폐기하십시오.
10. 림프구를 포함한 백혈구가 들어있는 버피 코트를 제거하기 위해 매우 신중하게 흡입하십시오.
11. 버피 코트가 서서히 제거됨에 따라 적혈구(RBC) 층 위의 희끄무레한 노란색 흐린 물질이 사라집니다. 버피 코트가 제거되고 튜브 위에서 볼 때 RBC 레이어를 명확하게 시각화 할 수 있습니다 일단 포부를 중단합니다.
12. 주로 호중구인 과립구가 RBC 층의 표면 근처에 있지만 표시되지 않기 때문에 RBC 층을 방해하지 않도록 하십시오.
13. 15ml RBC 층의 부피에 30ml 웜 2% 젤라틴 용액(RBC 층의 2배 부피)을 추가합니다.
14. 거품의 형성을 최소화하기 위해주의, 부드럽게 혼합 튜브를 반전.
15.  25분 동안 37ºC에서 인큐베이션을 제공합니다. 참고: RbC는 집계하여 하단에 정착해야 합니다. 젤라틴에 대한 대안으로, 큰 분자량 덱스트랜스는 퇴적 RbC^8에사용될 수 있다.
16. 인큐베이션 후, 파이펫이 있는 새로운 50ml 튜브에 과립구를 함유한 상부 층 의 가벼운 적색 용액을 옮기고, 이송 중에 정착된 어두운 RBC 층을 방해하지 않도록 주의한다. 분리되면 어두운 RBC 레이어를 폐기하십시오.
17. 스핀은 과립구와 원심분리기의 일부 RBC를 포함하는 가벼운 적색 용액을 1,000 x g에서 1,000 x g로 전송하고 브레이크는 실온에서 10 분 동안 활성화되어 펠릿 셀을 제공합니다.
18. 원심분리를 형성하는 붉은 세포 펠릿이 일반적으로 느슨하기 때문에, 주체를 조심스럽게 부어 또는 흡인한다.
19. RBC 용해 버퍼를 사전에 준비하고 8.29g 염화암모늄(NH_4Cl),중탄산나트륨 1g(NaHCO_3),0.038g EDTA를 비커에 1L 증류수를 추가하여 4ºC에 보관하십시오. RBC 리시스 버퍼를 4ºC에 저장합니다.
20. 소량의 감기 RBC 용해 버퍼로 적색 세포 펠릿을 다시 중단하고 분해하십시오. 세포 펠릿이 용액이되면 RBC 용해 버퍼로 튜브를 50ml로 채웁니다. 참고: 이 시점에서 앞으로, 얼음 또는 4 ºC에 세포를 유지.
21. 원심분리기에서 300 x g에서 4ºC에서 10분 동안   스핀한 다음 슈퍼나탄을 부어 넣거나 흡인합니다. 참고: 상체는 lysed RbC를 포함하는 다소 빨간색이 될 것입니다. 펠릿은 이 시점에서 황색 흰색이어야 합니다. 적색 펠릿에 의해 표시된 바와 같이 중요한 RBC가 펠릿에 남아 있는 경우, 단계 5.20-5.21을 반복할 수 있다. 중요한 RBC는 5.20 단계에서 붉은 펠릿이 충분히 부서지지 않으면 세포 펠릿에 남아 있습니다.
22. HBSS (-)의 작은 볼륨으로 희끄무레한 펠릿을 다시 중단하고 분해한 다음 HBSS (-)로 튜브를 50ml로 채웁니다. 참고: HBSS(-) 및 HBSS+가 아닌 희끄무레한 세포 펠릿을 재중단하는 데 사용해야 합니다. HBSS (-) 칼슘과 마그네슘이 부족합니다.
23. 4 ºC에서 10 분 동안 300 x g에서 원심 분리기에서 다시   회전하십시오.
24. 상체를 붓고 펠릿을 1ml HBSS(-)의 최종 부피로 재보선다.
25. 1ml 셀 서스펜션의 5 μl을 1.5ml 에펜도르프 튜브에 250 μl HBSS(-)에 넣고 파이펫으로 부드럽게 위아래로 섞습니다.
26. 25 μl 희석 셀 현탁액을 25 μl 0.4 % Trypan Blue에 추가합니다.
27. 표준 혈류계의 각 측면에 12 μl의 혼합물을 추가합니다.
28. Trypan 청색 염료를 배제하고 혈종계의 양쪽의 중간 사각형에 존재하는 살아있는 세포의 수를 계산합니다.
29. 세포 농도를 계산하기 위해 2 제곱의 평균을 100(희석 인자)로 곱한 다음^104로 곱하여 세포/ml수를 부여합니다.
30. 최종 농도를 5 x 10⁷ 셀/ml로 조정합니다. 5 x 10⁷ 셀/ml보다 큰 경우 HBSS(-)를 추가하여 조정합니다. 적은 경우, 세포를 펠릿하고 적절한 볼륨으로 다시 중단.
31. 마이그레이션 분석이 준비될 때까지 세포를 얼음 위에 보관하십시오. 참고: 이 세포는 백혈구의 과립구 집단을 나타냅니다. 전체 인간의 혈액에서 분리 된 과립구의 대부분은 호중구입니다. 세포는 정지 상태에서 세포를 유지하기 위해 마이그레이션 분석에 추가 될 때까지 HBSS (-)에서 중단 된 얼음에 보관됩니다.

6. 마이그레이션 분석용 상피 세포 층 준비

(이단계는 멸균 후드 내에서 수행 할 필요가 없습니다.)

1. 적어도 8 일 동안 트랜스 웰 필터 멤브레인의 밑면에 배양 된 상피 층을 지원하는 인큐베이터 24 웰 플레이트에서 제거하십시오.
2. 각 트랜스웰의 가장자리를 헤스테트로 잡고, 24웰 플레이트에서 들어 올리고, 폐양동이 를 통해 트랜스웰을 뒤집어 트랜스웰의 내부 챔버에서 배양 매체를 폐기한다. HBSS +를 포함하는 세척 비커에 각 트랜스웰을 찍어 HBSS +로 트랜스웰의 내부 챔버를 채웁니다. 내부 챔버에서 액체를 폐양동이로 버리십시오.
3. HBSS+에서 두 번째 세척을 위해 6.2 단계를 반복하십시오. 두 번의 세차 후, 각 웰에 1 ml HBSS +를 포함하는 새로운 24 웰 플레이트에 트랜스웰을 놓습니다. 참고: 모든 세서는 37ºC로 따뜻하게 되는 HBSS+로 수행해야 합니다.
4. 상피 세포 층 무결성을 평가하기 위해 각 트랜스웰의 상단 챔버를 관찰한다. 참고 : HBSS +는 HBSS +의 1 ml를 포함하는 24 웰 플레이트의 우물에 배치 할 때 트랜스 웰의 상단 챔버에 누출및 채우지 않아야합니다.
5. 각 트랜스웰을 주의 깊게 관찰한 후 0.2 ml의 HBSS+를 최고 챔버에 넣습니다.
6. 37   ºC, 5% CO_2의 인큐베이터에 30-60분 동안 가습챔버에 배치하여 상피 세포 층을 평형화한다.

7. 호중구 트랜스 상피 이주 분석

1. HBSS+에서 평형화되는 세척된 트랜스웰의 인큐베이터 24웰 플레이트에서 제거하십시오.
2. 각 트랜스웰을 헤스테트로 잡고 상단에 있는 액체를 폐기물 양동이에 잘 넣습니다.
3. 각 트랜스웰을 150mm x 25mm 페트리 접시에 거꾸로 놓습니다.
4. 거꾸로 된 트랜스웰 6개에 HBSS+의 25 μl을 추가합니다. 반전된 트랜스웰 의 3개에, HBSS+에서 희석된 25μl P. aeruginosa(PAO1)를 4단계에서 설명한 대로 제조하였다. 마지막 3개의 반전된 트랜스웰까지, 4단계에서 설명된 바와 같이 HBSS+에서 희석된 25 μl E. coli K12(MC1000)를 감염시보세요. 이는 4단계에서 제조된 세균용 용액의 농도가 약 3 x 10^7-6x 10⁷ CFU/ml이기 때문에 각 세균종에 대해 약 0.8 x 10 6 -1.5 x 10⁶ CFU/상피층이다.
5.  37 ºC에서 인큐베이션, 60 분 동안 가습 챔버에서 5 % CO_2.
6. 10mm fMLP 스톡의 5μl을 HBSS+에 5ml를 추가하여 호중구 이주를 위한 긍정적인 컨트롤로 fMLP를 준비하여 10μM 용액을 제공합니다.
7. 헤스트를 잡고 바닥 챔버에 1 ml HBSS +가 들어있는 24 웰 워시 플레이트로 뒤집어 트랜스웰을 씻으십시오. 상단 챔버에 HBSS +의 0.2 ml를 추가합니다.
8. 헤스트로 트랜스웰을 잡고 첫 번째 세척 플레이트에서 제거하십시오. 1 ml HBSS +를 포함하는 두 번째 24 웰 워시 플레이트에 트랜스웰을 배치하기 전에, 폐기물 양동이에 상단 챔버에서 액체를 폐기. 상단 챔버에 HBSS + 0.2 ml를 추가합니다.
9. 총 3개의 세시에 대해 7.8단계를 한 번 더 반복합니다. 참고: 모든 트랜스웰은 박테리아에 감염되었는지 여부에 관계없이 동일한 취급 및 세척 식이요법을 받아야 하며, 분석중인 모든 트랜스웰이 동일한 방식으로 조작되었는지 확인해야 합니다. PAO1 또는 MC1000을 가진 60분 감염은 젖산 탈수소효소 기반 독성학 분석및 HRP 플럭스 분석에 의해 평가된 바와 같이 H292 단층의 생존가능성을 감소시키거나 C292 단층의 장벽 특성을 각각^18,22로변경하지 않는다.
10. 24웰 플레이트의 12개의 웰에 1ml HBSS+를 추가하여 24웰 이동 플레이트를 준비합니다. 참고 :이 접시는 사전에 준비 할 수 있습니다.
11. 세 번째 세척 후, 상부 챔버에서 유동을 휴스테를 사용하여 폐양동이로 버리고 감염되지 않은 트랜스웰 3개에 1ml HBSS+를 포함하는 24웰 이주 플레이트의 3개의 우물에 배치하여 음의 대조군을 나타낸다.
12. 1ml HBSS+(100nM)를 포함하는 24웰 이주 판의 3개의 우물에 fMLP의 10 μM 용액의 파이펫 10 μl.
13. 100 nM fMLP를 포함하는 24웰 마이그레이션 플레이트의 3개의 우물에 감염되지 않은 트랜스웰 의 3개를 배치하여, 이는 분리된 호중구가 마이그레이션하는 능력에 대한 긍정적인 제어를 나타낸다.
14. PAO1에 감염된 3개의 트랜스웰과 MC1000에 감염된 3개의 트랜스웰을 각각 1ml HBSS+를 포함하는 24웰 이주 플레이트의 3개의 우물에 놓습니다. 모든 트랜스웰의 상단 챔버에 HBSS + 0.1 ml를 추가합니다.
15. 각 트랜스웰에서 0.1 ml HBSS+의 위에, 조심스럽게 5 단계에서 설명된 대로 준비된 호중구 서스펜션(5 x 10⁷ 세포/ml)의 20 μl을 추가하십시오. 참고: 이것은 대략 1 x 10⁶ 호중구/트랜스웰을 나타냅니다.
16. 37 ºC에서 배양, 호중구의 트랜스 상피 이동을 허용하기 위해 2 시간 동안 가습 챔버에서 5 % CO_2.
17. 2시간 후에 마이그레이션한 호중구 수를 결정하기 위한 표준 곡선을 준비합니다. 호중구 서스펜션(5 x 10⁷ 셀/ml)의 40 μl을 HBSS(+) 2ml에 넣고 1ml HBSS(+)로 1ml를 옮기고 약 2,000셀/ml에서 1x 10 6세포/ml에 이르는 총 10가지 표준에 대해 8회 추가로 2배 희석을 수행합니다. 블랭크용 HBSS(+) 1ml를 포함합니다.
18. 2시간 이동 후, 유면한 몸을 잡고 24웰 이주 판의 내부 벽을 부드럽게 탭하여 트랜스웰을 들어올립니다. 트랜스웰을 폐기합니다.
19. 10X 목표를 사용하여 반전된 현미경으로 24웰 이주 플레이트의 우물을 보면서 우물에서 중성구의 이동을 심하게 평가합니다(각 조건에서 이동된 호중구의 이미지에 대한 그림 1 참조).
20. 24웰 마이그레이션 플레이트, 각 표준 및 빈에 사용되는 각 웰에 10% 트리톤 X-100의 50 μl을 추가합니다.
21. 24웰 의 마이그레이션 플레이트, 표준 및 공백을 4 ºC에서 20분 동안 저속으로   회전합니다.
22. 1M 점막 버퍼를 미리 준비합니다. 구연산 52.5g과 구연산 73.5g을 400ml의 증류수를 비커에 넣습니다. pH를 4.2로 가져옵니다. 증류수를 추가하여 500ml의 최종 용액을 제공합니다. 4ºC에 솔루션을 저장합니다.
23. 그날 신선한 ABTS 기판 솔루션을 준비하십시오. ABTS 정제 3개(각 10mg)와 1M 구연산 버퍼 5ml를 증류수 45ml에 추가합니다. 정제가 용액에서 완전히 용해되도록 합니다. ABTS 기판 용액이 필요할 때까지 과산화수소 30%의 50 μl 추가보류(단계 7.27 참조).
24. 24웰 마이그레이션 플레이트, 각 표준 및 빈에 잘 사용되는 각 구연산 버퍼에 50 μl을 추가합니다.
25. 각 샘플의 100 μl을 복제하여 96웰 플레이트로 옮기습니다. 참고: 96웰 플레이트로 이동하기 전에 각 샘플의 내용을 잘 혼합하는 것이 매우 중요합니다. 피펫은 전송하기 전에 적어도 5번 이상 용액을 위아래로 피펫합니다.
26. 혼합 후 각 표준의 100 μl과 블랭크를 96웰 플레이트로 옮기(복제된 블랭크).
27. ABTS 용액과 소용돌이에 과산화수소 30%의 50 μl을 추가합니다.
28. 96웰 플레이트의 각 샘플에 ABTS 기판 용액 100 μl을 추가합니다.
29. 어둠 속에서 5-10 분 동안 플레이트가 개발되도록 허용하십시오. 참고: 녹색은 특정 우물에서 개발되어야하며 각 우물에 존재하는 호중구의 수와 상관 관계가 있습니다.
30. 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 405 nm의 파장에서 읽으십시오.
31. 405nm에서 광학 밀도로 측정된 과록시다제 활성의 표준과 양으로 준비된 호중구의 공지된 수 와 계열 활성 사이에 선형 양성 상관관계가 존재하는 표준을 사용하여 상피층을 통해 마이그레이션된 호중구의 수를 계산합니다(대표 데이터의 경우 그림 2 및 3 참조). 참고: 이러한 호중구 정량화 방법은 myeloperoxidase 발현으로 인해 호중구에 의해 전시되는 다량의 과산화구 활성을 활용합니다. 호중구를 정량화하는 대체 접근법은 방사능 또는 형광 화합물을 사용하여 호중구를 미리 라벨링하는 방법과 같이 고려될 수 있습니다.

몇몇 연구 결과는 병원체 감염한 상피 층이 호중구 환피상피이동3,8,19,24-28,31,32를용이하게 한다는 것을 보여주었습니다. 이는 상피 세포 유래 호중구 화학작용체 그라데이션3,23의병원체 특이적 유도를 통해 발생한다. 예를 들어, 병원성 P. 아에루기노사가 폐 상피 세포의 정표면과 상호 작용하여 상피층18,22,25,26,33,34를통해 이동하는 호중구의 상당수를 일으킨다. 이 임상적으로 관련된 분석 시스템은 적절한 제어와 결합 할 때 주요 병원균 및 호스트 분자 기여자를 공개하는 여러 가지 방법으로 조작 될 수있다.

미리 감염되지 않은 편광 상피 세포 층에 추가된 호중구는 상당한 숫자로 마이그레이션하지 못합니다. 그러나, 감염되지 않은 상피 층을 통해 화학 요법 그라데이션의 응용 프로그램은 전역 호중구의 상당수를 구동합니다. 병원체 감염 상피 층을 통해 호중구 이주를 조사할 때 각 분석결과 내에서 각각 이러한 음수 및 양성 대조군을 모두 포함하는 것이 중요합니다. 네거티브 컨트롤은 신호가 없는 경우 상피 층을 가로지르는 호중구의 배경 수를 설정합니다. 배양 된 상피 세포가 기능장벽을 확립했을 때이 숫자는 매우 낮아야합니다. 높은 배경 이동은 병원체 감염 상피로 달성 된 결과의 해석을 복잡하게. 양성 대조군은 상피층을 가로질러 fMLP와 같은 호중구 화학 요법의 그라데이션을 적용하고 고립된 호중구가 기능적임을 확인하는 역할을 한다. 또한, 상피층이 특정 시약으로 전처리되어 병원체 유도된 상피 이동에 미치는 영향을 평가하는 경우, fMLP 그라데이션은 시약이 병원체 매개 효과에 관계없이 상피층을 탐색하는 호중구의 능력에 미칠 수 있는 모든 효과를 제어하는 역할을 한다. 이 분석 시스템 내에서 수시로 채택된 추가 통제는 병원체와 병행에 있는 비 병원성 박테리아를 가진 상피 층의 감염을 관련시킵니다. 이 대조는 박테리아와의 상호 작용 다음 관련 상피 응답을 구별뿐만 아니라 호중구 트랜스 상피 이동을 자극하는 데 필요한 병원성 요인의 식별을 지원하기 위해 악용 될 수있다.

호중구 트랜스 상피 이동은 질적으로 그리고 정량적으로 둘 다 평가될 수 있습니다. 바소포탈 표면에 호중구를 첨가한 후 2시간 인큐베이션이 완료되면, 상피층을 가로질러 완전히 이동한 호중구를 제거하여 24웰 이동판의 하단 우물에서 볼 수 있다. 각 조건의 대표적인 이미지가 도 1에표시되고, 반전된 광 현미경을 사용하여 시각화된다. 거의 호중구는 부과된 화학역학 그라데이션(HBSS+) 없이 감염되지 않은 상피층을 가로질러 이동하고분석(도 1A)에서배경 수준을 나타내는 것으로 관찰되었다. 대조적으로, fMLP 그라데이션이 제공될 때 많은 전환된 호중구가 명백하였다(도1B). 비병원성 대장균 MC1000을 가진 상피의 감염은 몇몇 가시적인 전각 호중구귀 귀착되는 반면, 많은 환원호성 층이 폐 병원성 P. aeruginosa (PAO1) (그림 1C 및 1D)에감염되었을 때 관찰할 수 있었습니다.

실험에서 마이그레이션된 호중구는 밀로페로시다제 활성을 측정하여 정량화됩니다. 표준 곡선은 마이그레이션된 호중구 수를 추정하는 데 사용됩니다. 호중구의 수는 호중구의 용해에 따라 측정된 과산화구활성의 양과 긍정적으로 상관관계가 있으며, 표준 곡선(2 x 103-1x 106 세포/ml)에 대해 선택된 호중구 수치의 범위에서 선형 관계를 나타내는 값과(도2). 상당수의 호중구는 제공된 fMLP 그라데이션에 응하거나 PAO1(도3)에감염된 상피 층에 반응하여 상피 층을 통해 마이그레이션한다. 자극(HBSS+)의 부재 또는 비병원성 대장균 MC1000을 가진 정맥 상피 감염 에 따른 후유성 전형체의 수는분석(도 3)에대한 검출 한계 이하이다. 그림 3에 제시된 데이터는 세 개의 독립적인 우물/조건의 표준 편차를 나타내는 오류 막대를 가진 마이그레이션된 호중구의 평균 수를 나타냅니다. 도 3에 묘사된 정량적 데이터는 도 1에표시되는 대표적인 웰 이미지와 일치한다.

그림 1. 트랜스 상피 이동 다음 호중구의 이미지. 이미지는 호중구를 가진 2시간 인큐베이션 기간에 이어 24웰 의 이동판의 하부 우물(apical chamber)의 10배율(apical chamber)의 반전된 광 현미경으로 볼 수 있었다(basolateral chamber). (A)네거티브 컨트롤 HBSS+. (B)양성 제어는 fMLP 화학 그라데이션을 부과하였다. (C)비병원성 대장균 K12(MC1000)에 감염된 상피 세포 층. (D)병원성 P. 아에루기노사(PAO1)에 감염된 상피 세포 층. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. 1 x 106의 시작 농도에서 호중구는 9개의 2배 희석을 받았다. 용해에 이어, 과산화제 활성의 양이 결정되었고, 호중구의 수는 y축에서 과록시다제 활성을 가진 x축상에 그래프로 그래프화되었다. 묘사된 방정식은 각 우물에서 측정된 과산화제 활동의 양에 따라 환전 후 각 우물에 존재하는 호중구의 수를 결정하는 데 사용될 수 있다. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3. 전환된 호중구의 정량화. 전환된 호중구의 수는 호중구의 알려진 수의 선형 표준 곡선에 상대 myeloperoxidase 활동에 의해 정량화된다. 상당수의 전환호중구가 병원성 P. aeruginosa(PAO1)를 가진 상피 세포 감염 또는 호중구 화학모 유치fMLP의 바칼랄 그라데이션에 대한 압정의 확립에 따라 관찰되었다. 비병원성 대장균 K12(MC1000) 처리 또는 음성 제어 버퍼(HBSS+)를 가진 상피 세포 감염 에 따라 관찰된 이동된 호중구의 검출할 수 없는 숫자가 관찰되었다. 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.