실험자가 면역 뇌척수염 성인 마우스에 유리 척수 Windows를 이식

Keith K. Fenrich; Pascal Weber; Genevieve Rougon; Franck Debarbieux

doi:10.3791/50826

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방법 논문

실험자가 면역 뇌척수염 성인 마우스에 유리 척수 Windows를 이식

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DOI:

10.3791/50826

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2013년 12월 21일

Keith K. Fenrich¹ , Pascal Weber¹ , Genevieve Rougon¹^,² , Franck Debarbieux¹^,²

¹Developmental Biology Institute of Marseille-Luminy (IBDML), Aix Marseille University, ²Campus de la Timone, European Research Center for Medical Imaging (CERIMED)

이 논문에서

요약

우리는 실험적인 자가면역 뇌척수염을 연구하기 위해 성체 쥐의 노출된 척수에 유리창을 이식하고 유지하는 방법을 설명합니다. 이 창은 이광자 현미경을 사용하여 살아있는 동물의 세포 내 수준에서 세포 역학을 모니터링하기 위해 척수에 대한 만성 광학 접근을 제공합니다.

초록

성체 설치류의 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)은 다발성 경화증과 같은 자율신경 탈수초성 질환을 연구하기 위한 표준 실험 모델입니다. 여기에서는 생체 내 현미경 검사에 적합하고 EAE를 가진 살아있는 성인 마우스에서 세포 내 해상도를 가진 척수 세포 구조의 역학을 연구하는 데 적합한 저렴하고 재현 가능한 유리창 이식 프로토콜을 제시합니다. 간단히 말해서, 우리는 수술을 통해 척추 T12-L2를 노출시키고 시아노아크릴레이트와 치과용 시멘트의 조합을 사용하여 노출된 척추 주위에 챔버를 구성합니다. T13에서 L1까지 후판 절제술을 시행하고, 노출된 척수의 등쪽 표면에 투명한 실리콘 엘라스토머의 얇은 층을 적용합니다. 변형된 유리 커버 슬립은 유리가 척수에 직접 닿지 않도록 주의하면서 노출된 척수 위에 이식됩니다. 창과 척수 사이의 염증 세포의 침투를 줄이기 위해 이식 후 첫 10일 동안 2일마다(윤리위원회의 권고에 따라) 항염증 치료를 시행합니다. EAE는 항염증 치료 중단 후 2-3주 후에 유발됩니다.

이 접근법을 사용하여 창문을 이식한 동물의 87%에서 EAE를 성공적으로 유도했으며, Thy1-CFP-23 마우스(등쪽 척수의 파란색 축삭돌기)를 사용하여 EAE 진행 전반에 걸쳐 축삭 손실을 정량화했습니다. 종합하면, 이 프로토콜은 다양한 세포 집단의 동원과 상호 작용 역학, 세포 내 해상도 및 장시간 동안 연구를 수행하는 데 유용할 수 있습니다. 이 생체 내 이미징 방식은 EAE와 같은 자가면역 탈수초성 질환을 치료하기 위한 치료 전략을 개발하기 위한 유용한 도구입니다.

서론

다발성 경화증은 진행성 수초와 축삭 손상을 일으키는 중추신경계의 자가 면역 질환입니다. CNS 자가면역 탈수초성 질환에 대한 표준 연구 모델은 성체 설치류의 EAE입니다. 그러나 EAE 진행의 기저에 있는 동적 세포 이벤트는 대부분 탐구되지 않은 상태로 남아 있습니다. 한 가지 접근법은 생체 내 이광자 현미경 검사를 사용하여 EAE가 있는 성인 마우스의 척수에서 장기간 동안 형광 마커로 세포 집단을 시각화하는 것입니다.

생체 내 이광자 현미경 검사는 세포 내 해상도¹로 살아있는 동물에서 세포 생리학, 세포 상호 작용 및 질병의 동적 진행을 연구하는 강력한 방법입니다. 그러나 이 접근 방식의 주요 장애물은 관심 영역에 대한 광학 액세스가 필요하다는 것입니다. 예를 들어, 두개골 유리창은 몇 주에 걸쳐 뇌의 동일한 미세 구조를 반복적으로 이미징하는 잘 정립된 방법론입니다^2,3. 그러나 이 방법론을 척수 영상에 적용하는 것은 간단하지 않으며 관절이 있는 척추 내에서 등쪽 척추 조직을 고정하기 위해 몇 가지 기술적 수정이 필요합니다.

이전에는 척수에 대한 광학적 접근을 위해 각 영상 세션이 시작될 때 척수를 외과적으로 다시 노출시키고 각 세션이 끝날 때 피부를 ....