Non Replicative Canine Adenovirus Type 2 유래 벡터의 생산 및 정제

요약

지난 15년 동안 개 아데노바이러스 2형(CAV2) 유래 벡터는 in vitro 및 in vivo 세포를 transduction하는 효율성이 입증되었으며 백신 접종 및 유전자 치료에 널리 사용됩니다. 여기에서는 CAV2 벡터를 생성, 생산 및 정제하여 high-titer 바이러스 현탁액을 생성하는 절차를 설명합니다.

초록

Adenovirus (Ad) 유래 벡터는 유전자 치료 및 백신 응용 분야 모두에서 단기 또는 장기 유전자 전달에 널리 사용되어 왔습니다. 전통적으로 사용되는 인간 아데노바이러스 5형에 대한 기존 면역이 빈번하기 때문에 개 아데노바이러스 2형(CAV2)이 인간 유전자 전달을 위한 대체 벡터로 제안되었습니다. CAV2의 잘 특성화된 생물학은 유전자 조작의 용이성과 함께 특히 중추신경계로의 유전자 전달 또는 체액성 면역에서 세포 면역에 이르기까지 광범위한 보호 면역 반응을 유도하는 데 큰 이점을 제공합니다. 오늘날 CAV2는 백신 벡터로 사용할 수 있는 가장 매력적인 비인간 아데노바이러스 중 하나입니다. 이 프로토콜은 재조합 CAV2 벡터를 구성, 생성 및 역정하는 간단한 방법을 설명합니다. 관심 유전자의 발현 카세트를 셔틀 플라스미드로 클로닝한 후, 재조합 게놈 플라스미드는 E. coli BJ5183 박테리아 균주에서 상동 재조합에 의해 얻어집니다. 이렇게 생성된 게놈 플라스미드는 보완적인 CAV2-E1 유전자(DK-E1)를 발현하는 개의 신장 세포에 transfection됩니다. 바이러스 증폭을 통해 큰 바이러스 스톡을 생산할 수 있으며, 이 스톡은 염화 세슘 구배를 통한 초원심분리로 정제되고 투석으로 탈염됩니다. 그 결과 생성된 바이러스 현탁액은 일상적으로 ml당^10-10개 이상의 감염 입자 역가를 가지며 생체 내에서 직접 투여할 수 있습니다.

서론

지난 수십 년 동안 아데노바이러스(Ads) 유래 벡터는 유전자 치료 및 백신 접종뿐만 아니라 종양 용해성 바이러스 요법에 대한 효능이 입증되었습니다 ¹. 광고는 포유류, 조류, 파충류, 양서류 및 어류에서 분리된 Adenoviridae 과의 비외피형 이십면체 바이러스입니다. 1953년 발견 이후, 광고는 바이러스와 세포의 상호작용을 연구하기 위한 모델로서, 그리고 최근에는 벡터 기반 유전자 전달 시스템(vector-based gene delivery system)으로 집중적으로 연구되었다 ². 실제로, 광고 기반 벡터는 광범위한 숙주 범위와 잘 특성화된 생물학과 같은 많은 이점을 제공할 뿐만 아니라 대규모 생산을 위해 유전적으로 조작하고 증폭할 수 있는 용이성을 제공합니다.

인간 Ads ³에서 파생된 벡터에 대한 인간 집단의 기존 면역과 관련된 임상적 어려움을 극복하기 위해, 우리와 다른 사람들은 비인간 Ads ⁴에서 벡터를 파생하기 시작했습니다. 또한, 비인간 아데노바이러스 벡터는 국가 규제 당국의 위험 평가 과정에서 안전 및 보안 요구 사항을 더 잘 준수해야 하기 때문에 전통적으로 사용되는 아데노바이러스 5형(Ad5)보다 수의학의 대량 백신 접종에 더 적합한 것으로 보입니다. 1990년대 후반에 우리는 Ad5 ⁵에서 파생된 벡터에 대한 비인간 대안으로 최초의 재조합 CAV2를 설명했습니다. 그 이후로 수많은 연구에서 치료 또는 항원 유전자 전달을 위한 CAV2 벡터의 잠재력이 확인되었습니다(리뷰 ^6,7). 다른 Ads와 마찬가지로 CAV2 유래 벡터는 안정적이며 높은 역가에서 생산할 수 있어 in vivo 사용이 용이합니다. 또한 통합형이 아니기 때문에 안전하지만, in vivo(>1년) 동안 오래 지속되는 transgene 발현을 허용합니다 ⁸. 놀랍게도, 그리고 human Ads serotypes보다 더 나은 CAV2 벡터는 축삭돌기에서 매우 효율적인 역행 수송과 함께 매우 신경자극적인 것으로 나타났습니다 ^9,10. 이러한 내재적 특성은 재조합 CAV2 벡터를 사용하여 렌티바이러스 벡터에 거의 접근할 수 없는 특정 뇌 영역의 뉴런을 형질전환한다는 아이디어를 가져왔는데, 이는 지금까지 중추신경계로의 유전자 전달에 일반적으로 사용되었습니다 ¹¹.

여기에서는 맨해튼 균주에서 파생된 비복제적 CAV2 벡터를 구성, 생성 및 정제하는 간단하고 고전적인 프로토콜에 대해 설명합니다. 재조합 CAV2 게놈은 유비쿼터스 발현을 제공하는 거대세포바이러스(CMV) 조기 프로모터의 다운스트림 카세트에서 원하는 관심 유전자(GOI)를 클로닝하여 구성됩니다. CAV2 벡터는 ~4.2 kbp의 클로닝 용량을 가지고 있어 큰 cDNA를 발현할 수 있습니다. 두 번째 단계에서, 이 발현 카세트는 CAV2 게놈의 E1 영역 대신 상동 재조합에 의해 삽입되어 Chartier 등에 의해 처음 설명된 바와 같이 비복제 바이러스(dlE1)를 유발합니다. ¹² 마지막으로, 게놈 플라스미드를 CAV2-E1 발현 개 신장 세포주(DK-E1)로 형질주입할 때 바이러스 입자가 생성되고 바이러스 스톡의 농축 및 정제 전에 연속적으로 증폭됩니다. 여기에 설명된 방법은 염화세슘(CsCl) 구배에서 2단계 초원심분리를 사용하며, 이를 통해 높은 최종 역가(일반적으로 ml당^10-10 감염성 입자 이상)로 감염성 입자를 농축할 수 있습니다. 그런 다음 바이러스 현탁액은 일회용 Sephadex G-25 컬럼을 통해 크로마토그래피로 탈염되어 궁극적으로 in vivo에서 직접 사용할 수 있을 만큼 충분히 순수합니다.

프로토콜

1. 비복제성 CAV2 게놈 플라스미드의 구성

참고: 이 프로토콜에 설명된 모든 플라스미드는 이전에 7 설명되었으며 요청 시 제공됩니다.

1. 적절한 제한 효소를 사용하여 GOI를 pShuttle 플라스미드에 복제하여 pShuttle-GOI를 생성합니다(그림 1A).
2. AscI/PacI에 의한 pShuttle-GOI 2 μg을 분해합니다. 분해는 플라스미드 골격(2.8kbp)에서 Shuttle-GOI 단편(~2.9kbp + GOI ORF 서열)을 방출합니다.
3. NucleoSpin Gel 및 PCR Clean-up kit를 사용하여 아가로스 겔 전기영동 후 Shuttle-GOI 단편을 정제합니다.
4. 이와 동시에 1μg의 pCAV2 게놈 플라스미드를 SwaI로 분해합니다. pCAV2 플라스미드는 E1 영역 내에 위치한 고유한 SwaI 부위를 포함하고 있습니다(그림 1B). 이 제한 효소를 65°C에서 20분 동안 가열하여 비활성화합니다.
5. 500ng의 정제된 Shuttle-GOI 단편과 100ng의 선형화된 pCAV2 플라스미드를 사용하여 적격 E. coli BJ5183 박테리아를 상동 재조합(Figure 1B)으로 형질전환시킵니다. LB-Amp 플레이트에 펴 바릅니다. 37°C에서 최소 20시간 동안 플레이트를 배양합니다.
6. 다음 사이클링 조건에서 정방향(5'-CACGAGGCCCTTTCGTCTTCAA-3') 및 역방향(5'-GCGGTAGTTTTTCACAGTTAAATTGC-3') 프라이머가 있는 EmeraldAmp 마스터 믹스를 사용하여 박테리아 콜로니에 대한 PCR 분석을 직접 수행합니다: 95°C에서 10분(1회 주기 동안), 95°C에서 1분 동안, 58°C에서 1분, 72°C에서 1분/kbp(39주기 동안), 마지막으로 72 °C에서 5 분. 1 kbp + GOI ORF 염기서열의 산물은 pCAV-GOI 양성 클론에서 증폭되는 반면, PCR 산물은 음성 클론으로 검출할 수 없습니다.
7. 쉐이커(220rpm)에서 37°C의 5ml LB-amp 매체에 각각 2개 이상의 양성 콜로니를 하룻밤 동안 접종합니다.
8. Nucleospin plasmid kit를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출합니다. 각 DNA 전처리의 분취액을 사용하여 적격 E. coli DH5α 박테리아를 변형시킵니다. LB-Amp 플레이트에 박테리아 현탁액을 펴고 37°C에서 밤새 배양합니다.
9. 셰이커(220rpm)에서 37°C의 3ml LB-amp 매체에 각 양성 클론의 두 콜로니를 밤새 접종합니다. Nucleospin plasmid kit를 사용하여 plasmid DNA를 추출합니다.
10. 생성된 DNA와 부모 pCAV2 플라스미드(대조군)를 NdeI로 분해합니다. 부모 pCAV2의 제한 패턴은 14.8kbp, 9kbp, 7.9kbp 및 1.6kbp입니다. GOI 발현 카세트는 7.9kbp 단편 내에 삽입되고, 적어도 하나의 NdeI 부위, 즉 카세트에 있는 부위와 GOI에 존재하는 잠재적 부위를 포함한다.
11. positive constructs를 선택하고 최소 2개의 독립적인 클론을 사용하여 2단계로 진행합니다.

2. 재조합 CAV2 게놈 플라스미드를 DK-E1 세포로 형질주입

참고: CAV2 유래 비복제 벡터는 생물안전성 2등급(BSL-2)으로 분류되는 유전자 변형 유기체인 반면, 동물 모델에 대한 사용은 BSL-1로 분류됩니다. 개인 보호 장비를 포함한 적절한 봉쇄 및 폐기물 처리 조치를 사용하고 BSL-2 층류 후드 아래에서 작업하십시오.

1. transfection 하루 전에 DK-E1 세포를 6-well plate에 seed합니다. 7% 열 비활성화 태아 송아지 혈청(FCS), 1mM 피루브산 나트륨 및 100U/ml 페니실린/100μg/ml 스트렙토마이신을 함유한 고포도당을 함유한 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)에서 37°C 및 5% CO₂에서 세포를 성장시킵니다. transfection을 위해 세포는 70-80% 융합되어야 합니다.
2. 2 μg의 pCAV-GOI 플라스미드를 AscI로 분해하여 플라스미드의 비바이러스 염기서열을 방출합니다. 0.8% 아가로스 겔 전기영동으로 생성된 제한 패턴을 확인합니다. 분해는 재조합 게놈을 포함하는 ~31 kbp 단편과 플라스미드 골격에 해당하는 2 kbp 단편을 생성해야 합니다.
3. 분해된 DNA를 200μl의 Jet Prime Buffer와 10초 동안 와류로 혼합합니다. Jet Prime 4μl를 추가하고 10초 동안 보텍싱하여 혼합합니다. 잠시 돌려 물방울을 제거하고 실온에서 10분 동안 배양합니다.
4. transfection mix를 세포에 적가적으로 추가합니다. 플레이트를 부드럽게 흔들어 혼합물을 고르게 분배하고 37°C에서 배양합니다.

3. 재조합 CAV2의 전파

1. transfection 일주일 후, 15ml 폴리프로필렌 튜브에 세포와 배양 배지를 수집합니다. 3번의 동결-해동 주기(-80 °C/37 °C)로 세포를 파괴하고 1,800 x g에서 10분 동안 원심분리하여 용해물을 제거합니다.
2. 상층액을 채취하여 후속 바이러스 전파를 위해 -20°C에서 보관하십시오.
3. 6-well plate의 한 well에서 자란 DK-E1 세포의 80-90% confluent monolayer를 0.5ml의 바이러스 함유 상등액으로 감염시킵니다. 37 ° C에서 1 시간 동안 가벼운 교반으로 배양하십시오. 접종물을 제거하고 1.5% 열 비활성화 FCS를 포함하는 완전한 DMEM 5ml로 교체합니다.
4. 37 ° C에서 3-4 일 동안 세포를 배양합니다. 세포병성 효과의 출현에 대해 매일 세포를 모니터링해야 합니다(CPE, 그림 2A-B). 명확한 CPE가 보이지 않으면 배양 4일 후 세포를 수확하고 3.1-3.4단계를 반복합니다.
5. 명확한 CPE가 대부분의 세포에 영향을 미치는 경우, 일반적으로 2-4회의 바이러스 증폭 라운드 후에 배양 배지로 세포를 수집하고 위에서 설명한 대로 3회 동결-해동합니다. 10cm 직경의 조직 배양 접시 3개에서 자란 DK-E1 세포의 80-90%를 0.5ml의 바이러스 함유 상등액을 사용하여 감염시킵니다.
6. 3-4일 후(CPE가 완료되면) 이 10cm 접시에서 세포를 수확하고, 다시 3번의 동결-해동 주기로 파괴하고, 1,800 x g에서 10분 동안 원심분리로 용해물을 세척하고, 상층액을 수집하고, 대규모 CAV2 증폭을 위해 -20°C에서 보관합니다.

4. 대규모 CAV2 정제

1. 40개의 10cm 직경의 조직 배양 접시에서 자란 DK-E1 세포의 80-90% 합류 단층을 감염시킵니다. 각 요리에 FCS가 없는 완전한 DMEM 1ml에 희석된 바이러스 함유 상등액 0.1ml를 사용합니다. 37 ° C에서 3-4 시간 동안 가벼운 교반으로 세포를 배양합니다. 5% FCS가 보충된 완전 DMEM 5ml를 추가합니다.
2. 3일 동안 배양합니다. 50ml 폴리프로필렌 튜브에 담긴 40개의 10cm 접시에서 감염된 세포를 채취합니다. 1,200 x g의 펠렛 셀을 4°C에서 10분 동안 가열하고 15ml의 DMEM 배지에 재현탁합니다.
3. 3번의 동결-해동 주기(-80 °C/37 °C)로 세포를 교란합니다. 1,800 x g에서 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거하고 바이러스 입자를 정제하기 전에 상층액을 -20°C에서 보관합니다.
4. 14ml Ultra-Clear 튜브에서 불연속 CsCl 구배를 준비합니다. 먼저 튜브 바닥에 CsCl 용액 2ml(인산염 완충 식염수 1.40g/ml)를 붓습니다. 그런 다음 첫 번째 용액 위에 CsCl 용액 2ml(인산염 완충 식염수 1.25g/ml)를 천천히 추가합니다.
5. CsCl 구배(CsCl gradient) 위에 바이러스 상층액을 조심스럽게 로드합니다. 튜브에 상단에서 최대 2-3mm까지 미네랄 오일을 채웁니다. 스윙 SW40 로터에서 130,000 x g 및 18 °C에서 1.5시간 동안 원심분리기.
6. 원심분리 후 2개의 CsCl 용액 층 사이의 계면에서 두 개의 흰색 띠가 명확하게 보입니다(그림 2C). 21G 바늘과 주사기를 사용하여 성숙한 CAV2 입자가 포함된 아래쪽 밴드를 옆으로 뚫습니다. 빈 바이러스 입자에 해당하는 상부 밴드를 모으지 않도록 가능한 한 많이 시도하십시오.
7. 수집된 바이러스 입자를 CsCl 용액(인산염 완충 식염수 1.34g/ml)과 혼합하여 14ml 투명 튜브에서 연속 CsCl 구배를 준비합니다. 튜브에 상단에서 최대 2-3mm까지 미네랄 오일을 채웁니다. 스윙 SW40 로터에서 130,000 x g 및 18°C에서 18시간 동안 원심분리기.
8. 원심분리 후 위와 같이 주사기로 나란히 구멍을 뚫어 흰색 CAV2 함유 밴드를 수집합니다. 다시 말하지만, 나머지 상위 밴드를 수집하지 마십시오. 이것은 두 밴드를 더 잘 분리하는 이 연속 그라디언트에서 더 쉬워야 합니다. 수집된 현탁액의 총 부피는 2ml를 초과해서는 안 됩니다.
9. Sephadex G-25 PD-10 컬럼을 30ml의 PBS로 평형을 이룹니다.
10. 바이러스 현탁액을 로드하고 플로우 스루를 폐기합니다.
11. 500μl의 PBS 분획으로 용리합니다. 일반적으로 탈염된 CAV2 입자를 포함하는 분획 5-7을 수집합니다. 바이러스를 함유한 분획은 유백색이기 때문에 쉽게 식별할 수 있습니다. CAV2 현탁액 1.5ml에 글리세롤 150μl를 첨가하고 -80°C의 부분 표본에 보관합니다.

5. 종말점 희석에 의한 CAV2 적정

1. 정제된 바이러스의 분취액을 얼음에서 해동하고 무혈청 DMEM에서 10배 연속 희석(10-2-10-12 범위)을 수행합니다.
2. 각 바이러스 희석액 50μl를 96웰 플레이트의 5웰에 추가합니다. 각 웰에 1.5 x 10⁴ DK-E1 셀을 추가합니다. 플레이트를 37 ° C 및 5 % CO₂에서 5 일 동안 배양합니다.
3. 감염 후 5일째에 현미경 관찰을 통해 CPE 외관을 모니터링합니다(그림 2A-B). 감염성 역가는 Reed and Muench 통계적 방법¹³을 사용하여 중간 조직 배양 감염 선량(TCID₅₀)으로 측정됩니다.

결과

재조합 CAV2 벡터의 제작은 기초적이면서도 중요한 분자생물학적 기법에 의존합니다. 바이러스 벡터를 제작하기 전에는 외래 유전자를 위한 발현 카세트를 포함하는 재조합 CAV2 게놈을 먼저 구축해야 합니다. 이러한 구축 과정은 두 단계로 이루어집니다. 첫째, 목적 유전자(GOI)를 발현 카세트 형태로 셔틀 플라스미드에 클로닝합니다(즉 프로모터와 폴리아데닐화 신호 포함). 이 기능적 요소의 양옆에는 두 개의 CAV2 유래 게놈 서열이 배치되어 있으며, 이는 각각 상위 및 하위 재조합 영역을 나타낸다(그림 1A). 두 번째 단계에서는 상동 재조합을 이용하여 셔틀 플라스미드로부터 발현 카세트를 CAV2 게놈으로 삽입합니다.그림 1B). 두 DNA 성분을 선형화하면 이 단계의 성공률을 높일 수 있습니다(다음 사이트를 참조하십시오. AscI 및 PacI pShuttle의 소화 및 SwaI pCAV2 내의

토론

잘 문서화된 Ad5 기술로부터 채택된 본원에 기술된 간단한 방법은 ~4.2 kbp의 전형적인 클로닝 용량을 갖는 비복제 CAV2 벡터의 효율적인 생산을 허용한다. 시간 고려 사항과 관련하여 재조합 CAV2 게놈은 일반적으로 2주 안에 생성되는 반면, 바이러스 현탁액을 증폭, 정제 및 역가는 데 추가로 5주가 걸립니다.

CAV2 유래 벡터의 첫 번째 배치를 생산하는 데 시간이 많이 걸리는 것처럼 보일 수 있지만, CAV2 생산에는 6웰 플레이트의 한 웰을 처음 형질감염하기만 하면 되므로 플라스미드 생산, 형질감염 시약 등의 비용이 최소화된다는 점을 상기해야 합니다. 또한, 바이러스 입자의 첫 번째 배치가 얻어지면 DK-E1 보완 세포주의 단순 감염에 의해 증폭될 수 있습니다. 여기에서 우리는 많은 실험실에서 일반적으로 사용할 수 있는 기술인 초원심분리를 기반으로 CAV2 입자를 정제하는 방법을 제안했습니다. 그러나 크로마토그래피를 이용한 CAV2 비리온의 정제도 기...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
제한 효소	New England Biolabs	다양한
Jet Prime 형질 주입 키트	Polyplus	114-01
DMEM	Gibco (Life Technologies)	10567014
E. coli BJ5183 박테리아	Agilent	200154
PD-10 탈염 컬럼	GE Healthcare	17-0851-01
EmeraldAmp 중합효소	Takara	RR320A
뉴클레오스핀 플라스미드 키트	Macherey-Nagel	740558.250
NucleoSpin 젤 및 PCR 클린	Macherey-Nagel	740609.50
14ml 튜브, 울트라 클리어	Beckman	344060