방법 논문

야마나카 인자의 과발현에 의해 능성에 성인 체세포 세포의 생체 내 재 프로그램

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DOI:

10.3791/50837

⸱

2013년 12월 17일

 ,  ,  , 
1Nanomedicine Lab, UCL School of Pharmacy, University College London, 2Nanomedicine Lab, Faculty of Medical & Human Sciences, University of Manchester

이 논문에서

요약

이 연구는 기형종의 생성 없이 생체 내에서 다능성을 향한 체세포의 재프로그래밍을 보여줍니다. 우리는 Yamanka 인자를 인코딩하는 플라스미드 DNA의 유체역학적 꼬리 정맥 주입을 사용하여 성체 간세포의 생체 내 재프로그래밍을 강화된 다능성의 세포로 유도했습니다.

초록

정의 요인 강제 식으로 다 능성 상태로 체세포의 재 프로그램의 결과 유도 만능 줄기 (IPS) 세포는 재생 의학을위한 새로운 기회를 제공하고 있습니다. IPS 세포의 이러한 임상 적용은 주로 기존 프로그래밍 방법론의 열악한 효율성 및 주입시 종양을 형성하기 위해 생성 된 만능 줄기 세포의 위험에, 지금까지 제한되어있다.

우리는 다 능성으로 체세포의 프로그래밍은 프로그래밍 인자의 유전자 전달에 의해 생체 내에서 달성 될 수 있다는 가설을 세웠다. 효율적으로 생체 내에서 세포를 재 프로그래밍하기 위해, 야마나카 (OKSM) 전사 인자의 높은 수준은 표적 조직에서 발현 될 필요가있다. 이것은 표적 조직에 따라 다른 바이러스 성 또는 비 바이러스 성 유전자 벡터를 이용함으로써 달성 될 수있다. 특정 연구에서, 플라스미드 DNA의 유체 역학적 꼬리 정맥 (HTV) 주사를 제공하는 데 사용되었다마우스 간세포에 OKSM 요인. 이 증거의 증거 성인의 생체 프로그래밍, 높은 효율과 빠른 반응 속도와 능성 상태를 향해 체세포를 제공했다. 한층 더 종양이나 기형 종 형성은 동일 반응계에서 관찰되지 않았다.

이는 생체 내에서 체세포를 재 프로그램하는 프로토콜을 수행하고 향후 다른 조직 유형에 적용될 수있는 시험관에 비해 효율적으로 안전하게, 빠르게 향상된 능성을 유도하는 잠재력 접근법을 제안하고, 수 있다는 결론을 내릴 수있다.

서론

배아 줄기 세포의 사용에 대한 윤리적 우려는 줄기 세포 연구 개발의 한계 중 하나였습니다. 그러나 Yamanaka와 동료들이 4가지 전사 인자(즉, Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc(OKSM))의 강제 발현이 체세포를 유도 만능 줄기세포(iPS) 세포로 체외 재프로그래밍으로 이어질 수 있다는 발견은 새로운 기회를 열었습니다. 바이러스1-5 및 비바이러스6-10 유전자 전달, 단백질 세포질 전좌11,12 및 miRNA13-16 형질주입은 오늘날 iPS 세포를 생성하는 데 사용되는 다양한 방법 중 하나입니다. 그러나 이러한 재프로그래밍 방법론은 다음과 같은 임상으로의 번역을 제한하는 다양한 문제를 가지고 있습니다: a) 세포 재프로그래밍의 효율성에 대한 심각한 제한; b) 바이러스 벡터의 우세한 사용; c) 배양 조건의 길고 다단계 프로토콜; d) 체외에서 생성된 iPS 세포17-20의 이식에 의한 종양 원성의 위험.

레트로바이러스에 의한 정의된 전사 인자3-5의 유전자 전달은 체세포를 재프로그래밍하는 데 가장 일반적으로 사용되는 방법입니다. 그러나, 이는 삽입 돌연변이 유발, 안정적인 형질도입 및 장기 원발암유전자 발현의 가능성으로 인한 위험을 내포하고 있다21,22. 리포솜 또는 전기천공법을 이용한 플라스미드 DNA6,7,23 또는 RNA10 전달과 같은 비바이러스 유전자 전달 벡터도 연구되었습니다. 바이러스에 비해 더 안전하지만, 이러한 벡터는 형질도입 및 재프로그래밍 효율이 현저히 제한되어 있습니다24,25 .

이 새로운 분야의 중심 교리 중 하나는 iPS 세포의 생체 내 이식이 통제되지 않은 분화와 세 개의 서로 다른 배식층의 다양한 조직으로 구성된 종양 같은 덩어리(기형종)의 형성으로 이어진다는 것입니다. 그러므로, 다능성으로의 재프로그래밍(reprogramming)의 개념은 주로 1차 추출된 체세포(가장 일반적으로 섬유아세포)의 체외 조작에 초점을 맞추었습니다. 그러나, 상술한 바와 같이, 이 원리는 세포24-28의 이식 시 기형종 형성 또는 다른 형태의 종양 형성에 대한 위험을 증가시킬 수 있는 여러 차례의 치료(유전자 전달, 성장 인자, 항생제, 항산화제)를 포함하는 길고 복잡한 세포 배양 프로토콜로 인해 어려움을 겪습니다.

우리는 OKSM 전사 인자의 일시적인 과발현에 의한 생체 내 성체 체세포의 재프로그래밍이 기형종29의 후속 형성으로 이어지지 않는다고 제안합니다. 이를 달성하는 방법은 가능한 가장 안전한 방법으로 표적 조직 내에서 높은 수준의 전사 인자 발현을 달성하는 데 달려 있습니다. 이 연구에서는 세포를 in vivo에서 다능성으로 재프로그래밍하기 위해 간을 효율적으로 표적으로 하는 것으로 입증된 확립된 바이러스 없는 유전자 전달 기술을 선택했습니다. 이 기술은 플라스미드 DNA30,31의 대량, 빠른 유체역학적 꼬리 정맥(HTV) 주입을 포함합니다. 형질주입된 유전자의 높은 발현 수준은 이 비바이러스 유전자 전달 방법에 따라 성체 간세포에서 달성될 수 있습니다. 또한 이 기술은 바이러스 벡터 사용(예: 영구 게놈 삽입, 삽입 돌연변이 유발)으로 인한 잠재적 위험을 최소화합니다.

프로토콜

1. pDNA의 HTV 투여에 의한 간 조직의 생체 내 재프로그래밍(In vivo Reprogramming

)
  1. 생후 6주 된 암컷 Balb/C 마우스가 절차를 수행하기 전 일주일 동안 동물 시설에 적응
    2. 할 수 있도록 합니다.
  2. 증류수에 0.9% 식염수를 준비하고 0.22μm 마이크로 필터를 통해 여과합니다.
  3. 마우스당 1.5ml 0.9% 식염수에 75μg pCX-OKS-2A 및 75μg의 pCX-cMyc 플라스미드 DNA가 포함된 용액을 준비합니다. 메모: 총 주입량은 총 체중의 8-10% 사이여야 합니다.
    참고: 주사하기 전에 꼬리 정맥이 쉽게 시각화되고 확장되어 보일 때까지 마우스를 37°C의 가열 챔버에 보관하십시오.
  4. 이소플루란으로 마취를 유도하기 전에(가열실에서) 그리고 주사 중에(마취 마스크 사용).
  5. HTV 주사로 27G 주사기로 pDNA 용액 또는 식염수 대조군을 투여합니다. 참고: transfection이 성공하려면 총 부피가 5-7초 이내에 주입되어야 합니다.
  6. 동물이 주사에서 제대로 회복되는지 모니터링합니다.

2. qRT-PCR 연구를 위한 간 관류 및 1차 간세포 분리

  1. HTV 주사 후 2일, 4일, 8일, 12일, 24일 등 다양한 시점에 이소플루란으로 심부 마취를 유도합니다.
  2. 동물의 복부에 70% 에탄올을 뿌리고 수술용 가위로 복부 정중선의 피부를 절개하고 복부 근육층을 절개하여 내장을 노출시킵니다.
  3. 횡격막을 잘라 가위로 흉강을 노출시키고 잠금 집게로 강낭 정맥을 고정합니다.
  4. 내장을 오른쪽으로 옮기고 간엽을 옮겨 하강과 문맥 모두에 쉽게 접근할 수 있도록 합니다.
  5. 22G 카테터로 하부 cava 정맥을 캐뉼레이션하고 과도한 압력을 피하기 위해 문맥을 절단합니다.
  6. 37°C로 예열된 10ml의 HBSS 완충액(Ca2+ 및 Mg2+ 무함유, 중탄산염 포함)으로 관류를 시작합니다.간이 하얗게 될 때까지(3분) 10ml 주사기로 완충액을 천천히 관류합니다.
  7. 간이 부풀어 오르고 헐거워질 때까지 37°C로 예열된 Liver Digest Medium을 0.6ml/분(15분 동안)의 유속으로 계속 관류합니다. 메모: 과도한 소화와 관류는 간세포나 재프로그래밍된 세포를 손상시킬 수 있습니다.
  8. 4°C에서 실험을 계속합니다.
  9. 팔시폼(falciform) 및 관상동맥인대(coronary ligaments)를 절단한 후 겸자로 간을 제거하고 Hepatocyte Wash Medium으로 세척한 후 100μm 세포 여과기에 통과시켜 세포 현탁액을 얻습니다.
  10. 50ml 튜브에 세포 현탁액을 모으고 Hepatocyte Wash Medium으로 부피를 15ml로 조정합니다.
  11. 세포 현탁액을 50g에서 4분 동안 원심분리하고 온도를 4°C로 유지합니다. 상층액(Kupffer 및 상피 세포 포함)을 버리고 세포 펠렛(간세포 포함)을 10ml의 Hepatocyte Wash Medium에 재현탁합니다. 메모: 세포 펠릿은 매우 조심스럽게 재현탁해야 하며, 간세포는 매우 연약한 세포입니다.
  12. 원심분리 절차를 총 3회 반복하고 최종 펠릿을 10ml의 Hepatocyte Wash Medium에 재현탁합니다.
  13. 광학 현미경과 혈구계를 사용하여 세포 수를 추정합니다.
  14. 2 x 106 세포의 분취액을 준비하고 300 x g에서 원심분리하여 모든 세포를 회수하고 상층액을 버립니다.
  15. 이 시점에서 세포 펠릿은 추가 처리까지 동결하고 -20°C에서 유지하거나 RNA 추출에 바로 사용할 수 있습니다.

3. 만능 유전자의 상향 조절을 위한 분리된 간세포의 유전자 발현 연구

  1. 공급자의 지시에 따라 스핀 컬럼 키트를 사용하여 2 x 106 세포에서 RNA를 추출합니다.
  2. 추출된 RNA 1μg을 사용하여 공급자의 지시에 따라 2단계 qRT-PCR을 수행합니다.
  3. 식염수를 주입한 동물의 간세포를 대조군으로 사용하여 재프로그래밍(reprogramming), 다능성(pluripotency) 및 간세포 마커의 상대적 유전자 발현을 교정합니다.

4. 단백질 수준에서 향상된 다능성의 유세포 분석

  1. 주사 후 1일과 4일째에 간 관류를 수행하고 위에 표시된 대로 원발성 간세포를 분리합니다.
  2. 세포 밀도를 1 x 107 cells/ml로 조정하고 100 μl 분취량을 준비합니다.
  3. BD Cytofix 고정 버퍼로 세포를 고정하고 1x BD Perm/Wash 버퍼로 투과화합니다.
  4. anti-mouse OCT4-PerCP-Cy5.5 또는 anti-mouse Nanog-PE로 세포를 30분 동안 배양합니다.
  5. negative 및 isotype 컨트롤을 포함합니다.
  6. CyAn ADP High Performance Research 유세포분석기로 염색된 세포를 분석합니다.

5. 다능성 마커에 대한 간 절편의 면역 염색

  1. 주사 후 4일 후, 위에 표시된 대로 간을 관류하되 간 조직에서 혈액을 제거하기 위해 HBSS 완충액으로만 관류합니다.
  2. 간 조직 조각을 잘라 2-메틸부탄(액체 질소로 미리 냉각)에 담그면 냉동 절편을 계속할 수 있습니다.
  3. 냉동 조직은 -80°C에서 유지하거나 저온 유지 장치를 사용하여 14μm 두께의 절편을 직접 절단할 수 있습니다.
  4. 조직 절편을 실온에서 1시간 동안 자연 건조하고 메탄올로 수정 후 -20°C에서 10분 동안 사전 냉각하고 15분 동안 자연 건조시킨 다음 PBS로 절편을 두 번(각 5분) 세척합니다.
  5. 실온에서 블로킹 버퍼(PBS pH 7.3의 5% 염소 혈청-0.1% 트리톤)에 절편을 1시간 동안 배양한 다음 세척 버퍼(PBS의 1% BSA-0.1% 트리톤, pH 7.3)로 두 번의 세척 단계를 거칩니다.
  6. 조직 절편을 4°C에서 항-OCT4, 항-SOX2 및 항-나노그 1차 항체로 밤새 배양합니다.
  7. 다음 날, 세척 버퍼로 절편을 3x(각 5분) 세척하고 2차 항체와 함께 실온에서 1.5시간 동안 배양합니다.
  8. PBS(3x, 각 5분)로 간 절편을 세척하고 DAPI와 퇴색 방지 배지에 장착합니다.
  9. epifluorescence microscope로 슬라이드를 시각화합니다.

6. 간 조직 절편의 알칼리성 인산가수분해효소(ALP) 염색

  1. 앞에서 설명한 대로 간 조직 절편을 확보합니다.
  2. 염색을 수행하기 전에 조직 절편을 실온에서 15분 동안 따뜻하게 합니다.
  3. 4% 파라포름알데히드로 2분 동안 고정합니다. 참고: 고정 시간이 너무 길면 ALP 활성이 감소할 수 있습니다.
  4. 섹션을 30분 동안 자연 건조한 다음 37°C에서 30분 동안 BCIP/NBT 액체 기판으로 배양합니다.
  5. 증류수로 슬라이드를 세척하고 수성 장착 매체로 장착합니다.
  6. 광학 현미경으로 임의의 이미지를 캡처합니다.

7. 간 독성을 평가하기 위한 혈청 내 알부민 및 간 효소 수치의 정량화

  1. 형질주입 후 4일, 8일, 12일, 120일째에 심실에서 직접 300μl의 혈액을 채취합니다.
  2. 혈액 응고를 방지하기 위해 다른 샘플을 수집하는 동안 혈액을 얼음 위에 보관하십시오.
  3. 모든 샘플이 준비되면 혈전이 생길 때까지 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
  4. 2,000 x g에서 5분 동안 샘플을 원심분리합니다.
  5. (상층액 내의) 혈청을 새 Eppendorf tube에 조심스럽게 피펫팅하고 시료를 처리할 때까지 -80 °C에서 동결합니다.
  6. 알부민, ALT, AST, ALP 및 GLDH에 대한 혈청 수치를 분석합니다.

8. 간 독성을 평가하기 위한 간 절편의 Hematoxylin 및 Eosin(H&E) 및 PAS(Periodic Acid-Schiff) 염색

  1. HTV 주입 후 2, 4, 8, 12, 24, 50, 120일을 포함한 다른 시점에서; 앞서 설명한 대로만 HBSS 완충액으로 간 관류를 수행한다.
  2. 간 조직 조각을 잘라 파라포름알데히드 4%로 고정합니다.
  3. 파라핀 블록에 간 조직을 삽입하고 H&E 또는 PAS 염색으로 염색합니다.
  4. 광학 현미경으로 임의의 이미지를 캡처합니다.

결과

그림 1은 OKSM 인코딩 플라스미드의 생쥐 간으로의 유전자 전달과 in vivo 세포 리프로그래밍을 관찰하기 위해 수행된 다양한 기술의 절차 개요를 보여줍니다. 플라스미드를 HTV로 주입한 후, 주입 2일 차에 형질전환된 리프로그래밍 인자(Oct3/4, Sox2, Klf4 및 cMyc)의 mRNA 수준에서 유전자 발현이 유의하게 증가하는 것이 관찰되었습니다. 그림 2a에 나타난 바와 같이, 이러한 인자들의 발현은 주입 후 시간이 지남에 따라 감소합니다. 내인성 다능성 마커(Nanog, Ecat1 및 Rex1)의 발현과 관련하여, 주입 후 2일 및 4일 차에 생리식염수를 주입한 동물의 간세포와 비교하여 수준이 유의하게 상향 조절되었으며, 8일 차부터는 기저 수준으로 돌아왔습니다 (그림 2b). 동시에, 간세포 특이적 유전자(Alb, Aat 및 Trf)의 하향 조절을 통해 간세포 집단의 역분화가 확인되었으며, 이는 4일 차에 통계적으로 유의미했으며 8일 차부터 기저 수준에 도달했습니다 (그림 2d).

단백질 수준에서의 Oct3/4 및 Nanog 발현은 유세포 분석법으로 조사되었습니다. 다음에서 보여주는 바와 같이 그림 2cHTV 주입 후 1일차에는 Oct3/4만 발현된 반면, 내인성 다능성 마커인 Nanog의 발현을 위해서는 4일차까지 기다려야 했습니다.

in vivo 세포 리프로그래밍의 발생은 anti-OCT4, anti-SOX2 및 anti-Nanog 항체를 이용한 간 조직의 면역조직화학 분석과 ALP 활성 특이 염색을 통해 추가로 확인되었습니다. 모든 마커와 효소 활성에 대해 양성인 세포들이 OKSM을 주입한 동물의 간 조직에서 재현성 있게 발견되었으나, 식염수를 주입한 대조군에서는 발견되지 않았습니다 (그림 3).

pDNA의 HTV 주입을 통한 in vivo 세포 리프로그래밍으로 인한 잠재적인 독성 부작용 및 테라토마 형성 여부를 120일 동안 혈청 내 간 효소 수치 정량 분석과 간 조직 절편의 H&E 및 PAS 염색을 통해 조사하였다. 2일까지는 일시적이고 심각하지 않은 조직 손상 징후가 관찰되었으나, 그 이후로는 나타나지 않았다. 연구 기간 동안 테라토마 형성이나 이형성증 또는 형태학적 변화의 징후는 관찰되지 않았다(그림 4). 알부민 및 간 효소 수치와 조직 절편의 글리코겐 염색으로 확인한 결과, 모든 동물에서 연구 과정 전반에 걸쳐 간의 구조적 또는 기능적 이상이 없었다(그림 4b 및 c).

생체 내 리프로그래밍 인자 주입, 마우스 도식, 플라스미드, 조직 분석, PCR, 세포 분석.
그림 1. in vivo 리프로그래밍 절차 및 분석의 개략도. 본 프로토콜은 두 가지 주요 단계로 구성됩니다: (i) 리프로그래밍 인자의 in vivo 투여 및 (ii) 조직 적출 및 시료 분석. 여기를 클릭하여 더 큰 그림 보기.

유전자 발현 분석; 일수별 상대적 발현 데이터가 표시된 막대 그래프; 그림 a-d; 과학적 결과.
그림 2. 성체 마우스 간에서의 Yamanaka 전사 인자 in vivo 과발현. Balb/C 마우스에 0.9% 식염수만 주입하거나, 0.9% 식염수에 75 μg의 pCX-OKS-2A와 75 μg의 pCX-cMyc를 혼합하여 HTV 주입하였으며, 2, 4, 8, 12, 24일에 간세포의 RT-qPCR 분석을 수행하여 다음의 상대적 유전자 발현을 측정하였다: (a) 형질전환된 전사 인자 (OKSM) 및 (b) 내인성 다능성 마커; (c) OCT3/4 양성 및 Nanog 양성 세포의 유세포 분석; (d)RT-qPCR로 측정한 간세포 마커의 상대적 유전자 발현. 모든 유전자 발현 수준은 식염수 HTV 주입군을 기준으로 표준화되었다. (* p<0.05는 분산 분석 및 Tukey의 사후 검정을 통해 식염수 HTV 주입군과 비교하여 통계적으로 유의미한 차이가 있음을 나타냄). Yilmazer et al.29로부터 그림 인용. 여기를 클릭하여 더 큰 그림 보기.

식염수 처리군과 OKSM 처리 세포의 OCT4, SOX2, NANOG 면역형광 현미경 비교.
그림 3. 면역조직화학법을 이용한 성체 생쥐 간 조직의 in vivo 세포 리프로그래밍. 0.9% 식염수만 투여하거나, 0.9% 식염수에 75 μg의 pCX-OKS-2A와 75 μg의 pCX-cMyc를 혼합하여 HTV로 투여한 Balb/C 생쥐. 4일 차에 간을 수집하고, 동결 조직 절편을 anti-OCT4, anti-SOX2 또는 anti-Nanog 항체로 염색하여 면역 반응성을 평가하거나, BCIP/NBT를 사용하여 조직 내 ALP 활성을 측정함(40X). 스케일 바는 100 μm를 나타냄. Yilmazer et al29의 그림을 수정하여 인용함. 여기를 클릭하여 확대된 그림 보기.

생리식염수 대 OKSM 처리에 따른 간 조직학, 효소 수치 및 알부민, 실험 결과.
그림 4. in vivo 세포 리프로그래밍이 간 기능 및 조직병리학에 미치는 영향. 0.9% 생리식염수에 희석된 pCX-OKS-2A 75 μg 및 pCX-cMyc 75 μg 또는 0.9% 생리식염수만을 HTV로 주입한 Balb/C 마우스. 2, 4, 8, 12, 50, 120일째에 간 조직과 혈청을 분리하여 다음 항목을 처리함: (a) H&E 염색; (b) 간 효소 수치; (c) 알부민 수치; (d) PAS 염색. 대표 이미지는 광학 현미경(10X)으로 촬영함. 스케일 바는 100 μm를 나타냄. Yilmazer et al.29의 그림을 수정하여 사용함 여기에서 더 큰 그림 보기.

토론

이 연구는 OKSM 인자를 성체 마우스 간으로 효율적으로 전달하고 과발현한 후 다능성을 향한 생체 내 세포 재프로그래밍에 대한 원리 증명 증거를 제공합니다. qRT-PCR, 유세포 분석, IHC 또는 혈청 분석과 같은 다양한 기술의 도움으로 표적 조직을 조사하여 생체 내 세포 재프로그래밍을 관찰했습니다. 조직에서 OKSM 인자 과발현의 유도로부터 매우 빠르게 다능성 마커가 mRNA 및 단백질 수준(48시간 이내)에서 상향 조절되었습니다. 이러한 실험 전반에 걸쳐 조직에서 추출된 세포의 5-15%가 Nanog 및 Oct3/4 양성인 것으로 나타났습니다. 또한, 120일 동안 간에서 구조적 또는 기능적 이상은 관찰되지 않았습니다. 간 이외의 조직(폐, 비장, 신장 및 심장)에서 플라스미드 DNA의 HTV 주입에 의한 이식유전자의 발현은 이전에 보고되었지만 유전자 발현 수준은 간세포보다 최소 3배 낮았습니다30. 이 연구의 데이터는 체세포를 생체 내에서 만능 상태로 재프로그래밍하는 것이 안전하고 빠르며 효율적임을 나타냅니다. 일반적으로 1% 미만의 효율로 3주 이내에 만능(iPS) 세포 생성을 달성하는 기존의 시험관 내 세포 재프로그래밍 방법론의 대부분을 고려할 때32, 다능성으로의 생체 내 재프로그래밍은 매우 흥미로운 대안을 제공할 수 있습니다. 우리는 다능성에 대한 생체 내 재프로그래밍의 개념이 고효율(사용된 벡터에 따라 다름)으로 다양한 유형의 체세포에 적용될 수 있지만 생 체 내 재프로그래밍된 세포에서 달성된 기능적 다능성 수준을 결정해야 한다는 가설을 세웁니다. 또한, 개선된 프로토콜과 기술의 개발로 생 체 내 재프로그래밍된 세포를 잠재적으로 추출하여 재생 의학 목적으로 활용할 수 있습니다.

생체 내에서 성체 체세포를 고효율로 재프로그래밍하기 위해 따라야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 표적 조직에서 높은 수준의 유전자 발현을 달성하는 것이 전제 조건입니다. 이 연구에서 이것은 HTV 주사를 사용하여 플라스미드 DNA를 간세포로 효율적으로 전달하고 발현하는 것을 활용하여 설명되었습니다. HTV 주사의 가장 중요한 요소는 동물 전체 체중의 8-10% 사이여야 하는 부피와 5-7초 이내에 수행되어야 하는 주사 속도입니다. HTV 주사는 간에 더 많은 조직 손상을 일으켜 세포 재프로그래밍의 효율성에 영향을 미칠 수 있으므로 생후 6주 미만의 마우스를 사용해서는 안 됩니다. 동물의 유전적 배경은 이전에 Balb/C 및 TNG-A 마우스 모두에서 유사한 수준의 재프로그래밍을 보고한 적이 있기 때문에 생체 내 재프로그래밍의 효율성을 결정하는 데 영향을 미치지 않았으며, 후자는 Nanog 유전자좌에 삽입된 eGFP 리포터를 운반하고 Sv129 배경29에서 사육되는 형질전환 균주입니다.

우리는 OKSM 인자가 표적 세포에 효율적으로 전달되어 높은 수준의 유전자 발현을 허용한다면 만능 상태로의 생 체 내 세포 재프로그래밍(결정이 필요함)이 다른 조직 유형에 적용될 수 있다고 추측합니다. 다양한 비바이러스 및 바이러스 유전자 전달 벡터가 다양한 세포 및 조직 유형을 표적으로 하기 위해 전임상 및 임상 시험에서 연구되었습니다33. 예를 들어, 신경 또는 안구 조직의 경우, 아데노 관련 바이러스는 효율적인 생체 내 유전자 전달을 위한 바람직한 벡터 선택이었으며(34-37), 반면, 근육 조직에서는 네이키드 플라스미드 DNA 주입이 상대적으로 높은 수준의 유전자 발현을 초래하는 것으로 나타났다(38,39). 따라서 유전자 전달 벡터의 방법은 만능 상태를 향한 효율적이고 신속한 생체 내 세포 재프로그래밍을 달성하기 위해 조직 유형에 따라 신중하게 선택되어야 합니다.

공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 Engineering and Physical Sciences Research Council(EPSRC, Swindon, United Kingdom)과 European Commission FP-7 Programs NANONEUROHOP(PIEF-GA-2010-276051) 및 ANTICARB(HEALTH-2008-20157)의 일부 지원을 받았습니다. AY는 터키 교육부(Ministry of Education)의 전임 박사 학위 장학금(PhD Scholarship of Education)의 지원을 받았으며 IL은 영국 문화원(British Council)과 CAIXA 재단(스페인)의 부분적인 지원을 인정합니다. 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
pCX-OKS-2A pDNAAddgene19771세균 찌르기, 플라스미드 생산 수행된 플라스미드 공장(독일)
pCX-cMycAddgene19772Addgene에서 박테리아 찌르기로 획득, 플라스미드 생산은 Plasmid 공장(독일)에서 수행됨
0.22 μ m 필터MillioporeSLGP033RS
IsofluraneAbbottB505
HBSS 버퍼Sigma-AldrichH6648Ca2+ and Mg2+ free, with bicarbonate
Liver Digest MediumGibco17703-034
Hepatocyte Wash MediumGibco17704-024
100 & 뮤; m 세포 여과기BD Biosciences352360
Nucleospin RNA II 키트Macherey-Nagel740955.25세포 및 조직에서 RNA 분리용 키트
iScript cDNA 합성 키트Bio-Rad170-8890
iO SYBR Green SupermixBio-Rad170-8880
Oct3/4 forward primerSigmasequence in commentsTGAGAACCTTCAGGAGATATGCAA
Oct3/4 리버스 프라이머시그마시퀀스 코멘트에 주어진CTCAATGCTAGTTCGCTTTCTCTTC
Sox2 포워드 프라이머시그마시퀀스 코멘트에 주어진GGTTACCTCTTCCTCCCACTCCAG
Sox2 리버스 프라이머시그마시퀀스 코멘트에 주어진TCACATGTGCGACAGGGGCAG
C-myc 포워드 프라이머시그마시퀀스 코멘트에 주어진 시그마 시퀀스CAGAGGAGGAACGAGCTGAAGCGC
C-myc 리버스 프라이머시그마시퀀스 주석에 주어진TTATGCACCAGAGTTTCGAAGCTGTTCG
나노 포워드 프라이머시그마시퀀스 주석에 주어진CAGAAAAACCAGTGGTTGAAGACTAG
나노 리버스 프라이머시그마시퀀스 주석에 주어진GCAATGGATGCTGGGATACTC
Ecat1 순방향 프라이머시그마시퀀스 주석에 주어진TGTGGGGCCCTGAAAGGCGAGCTGAGAT
Ecat1 리버스 프라이머시그마시퀀스 코멘트에 주어진ATGGGCCGCCATACGACGACGCTCAACT
Rex1 포워드 프라이머시그마시퀀스 코멘트에 주어진ACGAGTGGCAGTTTCTTCTTGGGA
Rex1 리버스 프라이머시그마시퀀스 코멘트에 주어진TATGACTCACTTCCAGGGGGCACT
알브 포워드 프라이머시그마주석에 주어진 순서GTTCGCTACACCCAGAAAGC
Alb 역방향 프라이머시그마순서 주석에 주어진CCACACACAAGGCAGTCTCTGA
Aat 포워드 프라이머시그마시퀀스 주석에 주어진CAGAGGAGGCCAAGAAAGTG
Aat 리버스 프라이머시그마시퀀스 주석에 주어진ATGGACAGTCTGGGGAAGTG
Trf 포워드 프라이머시그마주석에 주어진 서열ACCATGTTGTGGTCTCACGA
Trf 리버스 프라이머시그마서열 주석에 주어진ACAGAAGGTCCTTGGTGGTG
B 액틴 포워드 프라이머시그마서열 주석에 주어진GACCTCTATGCCAACACAGT
B 액틴 리버스 프라이머시그마서열 주석에 주어진AGTACTTGCGCTCAGGAGGA
BD Cytofix 고정 버퍼BD Biosciences
1x BD Perm / Wash 버퍼BD Biosciences560585
안티 마우스 OCT4-PerCP-Cy5.5BD Biosciences560585
안티 마우스 Nanog-PEBD Biosciences560585
2- 메틸 부탄시그마 - AldrichM32631
X100- 트리톤- AldrichX100-500ML
염소 세럼Sigma-AldrichG9023
BSASigmaA2153
rabbit pAb anti-OCT4Abcamab198573 &mu의 농도에서 사용; g/ml
토끼 pAb anti-SOX2Abcamab979591 &mu의 농도에서 사용; g/ml
토끼 pAb anti-NanogAbcamab808921 &mu의 농도에서 사용; g/ml
마우스 mAb anti-SSEA1Abcamab1628520 &mu의 농도에서 사용; g/ml
염소 pAb 안티 토끼 IgG, Cy3Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.로111-165-003-JIRCy3
Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.염소 pAb 항마우스 IgG115-165-003-JIRDAPI
Vector LaboratoriesH-1200
BCIP/NBT 액체 기판 시스템SigmaB1911
수성 장착 매체Sigma
16% 파라포름알데히드FisherAA433689M원액은 16%이며 4%
Hematoxylin 및 eosinSigmaGH53/HT110216
PAS 염색Sigma395B
560585 표지로 표지된 1/250 농도에서 사용

참고문헌

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