사용 예쁜 꼬마 선충 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

요약

단백질 항상성, 스트레스 및 노화 사이의 관계를 연구하기 위해 유전적으로 다루기 쉬운 후생동물인 Caenorhabditis elegans를 모델 시스템으로 사용하여 단백질 기능 장애, 세포 내 단백질 국소화 및 유기체, 세포 및 단백질 수준에서의 단백질 안정성을 추적하여 단백질 접힘의 변화를 모니터링했습니다.

초록

단백질의 접힘과 조립은 단백질 기능, 세포의 장기적인 건강 및 유기체의 수명에 필수적입니다. 역사적으로 단백질 접힘의 기능과 조절은 시험관 내, 분리된 조직 배양 세포 및 단세포 유기체에서 연구되었습니다. 최근 연구에서는 단백질 항상성(단백질분해), 신진대사, 발달, 노화 및 온도 감지 사이의 연관성을 밝혀냈습니다. 이러한 발견은 모델 메타 동물 유기체 Caenorhabditis elegans에서 단백질 접힘을 모니터링하기위한 새로운 도구의 개발로 이어졌습니다. 저희 실험실에서는 단백질의 잘못 접힘을 모니터링하기 위해 온도에 민감하거나 자연적으로 발생하는 준안정 단백질을 접힘 환경의 센서로 사용하여 행동 분석, 이미징 및 생화학적 접근 방식을 결합합니다. 특정 단백질의 잘못된 접힘과 관련된 행동 분석은 단백질 접힘에 대한 간단하고 강력한 판독값을 제공하여 접힘을 조절하는 유전자 및 조건을 빠르게 스크리닝할 수 있습니다. 마찬가지로, 이러한 잘못된 접힘은 세포의 단백질 오국소화와 관련될 수 있습니다. 따라서 단백질 국소화를 모니터링하면 다양한 발달 단계와 변화하는 조건에 직면하여 서로 다른 조직에서 발생하는 세포 접힘 용량의 변화를 강조할 수 있습니다. 마지막으로, 생화학적 도구를 ex vivo 사용하여 단백질의 안정성과 형태를 직접 모니터링할 수 있습니다. 따라서 행동 분석, 이미징 및 생화학 기술을 결합함으로써 각각 유기체, 세포 및 단백질의 해상도에서 단백질 잘못 접히는 것을 모니터링할 수 있습니다.

서론

단백질 접힘, 전좌 및 조립/분해뿐만 아니라 mRNA 전사, 처리 및 번역과 같은 단백질 생합성의 다양한 단계의 상호 작용은 기능을 위해 세포 단백질 품질 관리 기계에 의존하는 준안정 단백질의 부하를 결정합니다¹. 따라서 단백질 품질 관리 기계의 부재 또는 오작동은 다양한 유형의 세포 기계의 기능 저하와 단백질 잘못 접힘 질환의 발병을 초래할 수 있습니다^2-7. 단백질 접힘 및 제거 기계의 용량이 준안정 단백질의 부하와 균형을 이룰 때 단백질 항상성(proteostasis)이 달성되며, 이는 궁극적으로 잘못 접힌 단백질의 축적과 세포 내 응집을 방지하는 상태⁶입니다. 잘못 접힌 단백질의 축적은 열 충격 인자(HSF-1)와 같은 스트레스 유도 전사 인자를 활성화하고 세포 보호 스트레스 반응을 활성화하는 신호로 생각됩니다^6,8.

후생동물에서 단백질분해 네트워크의 기능에 대한 우리의 이해는 대부분 체외 재구성 연구와 조직 배양 세포 및 단세포 유기체에 대한 관찰에서 파생되었습니다⁹. 예를 들어, 단백질 손상을 예방하고 해결하는 분자 샤페론에 대한 연구는 샤페론 매개 단백질 접힘, 분해 및 전좌 메커니즘에 대한 생화학적 및 세포 생물학적....

프로토콜

살아있는 유기체의 단백질 접힘을 모니터링하기 위한 행동 분석 사용

1. 행동 분석을 위한 동물 동기화

1. 예쁜꼬마선충³⁶의 유지를 위한 배지 및 플레이트 준비, 음식 준비 및 동물 성장 조건을 포함한 표준 방법을 따르십시오. 온도(15-25 °C), 개체군 크기 및 식량 가용성을 포함한 재배 조건을 신중하게 제어하십시오. 박테리아 또는 곰팡이 오염이 보이는 접시는 버리십시오.
2. 15-30개의 배아를 선택하여 새 플레이트로 옮기고 실험 기간 동안 원하는 온도(15-25°C)에서 성장합니다. 또는 접시에 10-20마리의 육식 성체를 놓고 30-60분 동안 알을 낳게 한 다음 접시에서 꺼냅니다. 배아를 직접 채취하는 것과 임신 성체를 설정하는 것 모두 연령(±6시간)에 약간의 변동성을 줄 것입니다. 이러한 변동성을 줄이려면 특정 단계(예: 쉼표 단계)에서 배아를 선택하거나 이제 막 알을 낳기 시작한 성인 10-20명(성인기 2일차)을 설정합니다. 이 치료법은 스트레스가 많고 단백질화에 영향을 줄 수 있으므로 가능하면 표백을 통한 동기화를 피하십시오.
3. 동기화된 동물을 선택하고 채점을 위해 분석 플레이트로 옮긴 다음 폐기합니다.

결과

손상된 접힘 환경은 단백질의 미스폴딩(misfolding) 및 응집을 유발할 수 있습니다. 단백질 미스폴딩은 구조적 변화와 관련이 있으며 단백질 기능의 상실을 초래합니다. 본 연구에서는 온전한 동물, 특정 세포 및 단백질 추출물 내에서 단백질 접힘과 기능을 모니터링하기 위해 상호 보완적인 접근 방식을 사용합니다. 알려진 불안정화 돌연변이와 관련된 강력한 행동 및 세포 표현형에 근거하여 접힘 센서를 지능적으로 선택하면, 이를 통해 단백질 접힘 환경의 변화를 모니터링할 수 있습니다. 내인성 온도 민감성 돌연변이 단백질의 예로는 굵은 근육 필라멘트 단백질인 파라미오신(C. elegans UNC-15)의 L799F 돌연변이가 있습니다³⁷. 이 미스센스 돌연변이는 코일드-코일(coiled-coil) 상호작용에 영향을 주어, 제한 온도에서 파라미오신(ts)이 미스폴딩되고 근육 근절 대신 파라결정성 조립체(paracrystalline assemblies)로 잘못 국소화되게 합니다. 이러한 국소화 오류는 굵.......

토론

세포 단백질 정체 용량의 프로브는 접힘 환경의 변화에 매우 민감해야 하며 단백질 접힘 품질 관리 기능을 실시간으로 평가할 수 있도록 쉽게 모니터링할 수 있어야 합니다. 준안정 단백질을 단백질 정체 능력의 프로브로 사용하여 표현형, 세포내 단백질 국소화 및 단백질 형태의 변화를 모니터링했습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 운동성, 근육 필라멘트 조직 및 미오신 안정성을 포함한 근육 단백질 관련 표현형에 중점을 둡니다. 그러나 이러한 프로토콜은 다른 접이식 센서를 모니터링하기 위해 수정할 수 있습니다. 행동 표현형의 경우 유기체 수준에서 단백질 기능을 결정하기 위한 간단하고 강력한 분석을 설계하는 것이 중요합니다. 예를 들어, dyn-1 의 ts 돌연변이는 제한 조건에서 엔도사이토시스 및 시냅스 소포 재활용의 급속한 손실로 이어집니다. 결과적으로, 체강액으로 분비된 GFP의 흡수 또는 GFP(SNB-1::GFP)로 태그된 시냅스 단백질인 시냅스토브레빈-1의 국소화에 의해 각각 모니터링될 수 있습니다²⁸

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
항체 staning 및 fiaxtion	파라포름알데히드	Merc	8187151000
Tween-20	Bio-Rad	1706531
콜라겐 분해 효소	시그마	C5138-100MG
DABCO	Merc	8034560100
Triton X-100	Alfa Aesar	A16046
β -ME	Sigma	8057400250
BSA	Di Cam	000-40-100
부분 다이제스트	Chymotrypsin	Sigma	C4129-250MG
내열성	SYTOX 오렌지	Invitrogen	S11368
콜레스테롤	Amaresco	0433-250G
장비
M165 FC 형광 입체경	Leica		TXR 필터
EXi 블루 형광 현미경 카메라	QImaging	EXI-BLU-R-F-M-14-C
ConfoCor 3/510 META 컨포칼 현미경	Zeiss
펠릿 유봉	Sigma	Z359947-100EA
펠릿 유봉 무선 모터	Kontes	K749540-0000
MicroCL 17 마이크로 원심분리기 시리즈	열	75002455	냉장, , 230 V 50/60 Hz, ClickSeal 생물 봉쇄 뚜껑이 있는 24x 1.5/2.0 ml 로터 포함