방법 논문

FtsZ 중합 분석 실험 : 간단한 프로토콜 및 고려 사항

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DOI:

10.3791/50844

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2013년 11월 16일

 , 
1Department of Molecular Microbiology, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen

이 논문에서

요약

FtsZ의 중합은 박테리아 세포 분열에 필수적입니다. 이 보고서에서는 FtsZ 중합 활성을 모니터링하기 위한 간단한 프로토콜에 대해 자세히 설명하고 버퍼 조성의 영향에 대해 논의합니다. 이 프로토콜은 FtsZ 중합에 영향을 미치는 조절 단백질 또는 항균 약물과 FtsZ의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

세균 세포 분열 동안, 필수적인 단백질 FtsZ는 소위 Z-고리를 형성하는 셀의 중앙에 모인다. FtsZ는 체외에서 GTP의 존재에 긴 필라멘트로 중합, 중합은 여러 액세서리 단백질에 의해 조절된다. FtsZ 중합 광범위하게 빛을 산란, 침강, GTP 가수 분해 분석 및 전자 현미경 등의 기본적인 방법을 사용하여 체외에서 연구되고있다. 버퍼 조건의 영향을 모두 FtsZ의 중합 특성 및 규제 단백질과 상호 작용하는 FtsZ의 능력. 여기, 우리는 FtsZ 중합 연구를위한 프로토콜을 설명하고 모델 단백질로 대장균과 바실러스 서브 틸리 스 (Bacillus subtilis) FtsZ를 사용 조건 및 컨트롤을 확인합니다. 저속 침강 분석법 FtsZ 중합체 동고 또는 관 모양 단백질 FtsZ의 상호 작용의 연구를 허용하는 도입된다. 개선 GTPase의 분석 프로토콜 테스트에게 허용하는에게 설명인산 검출 반응에서 발색 편차 폐지 표준화 인큐베이션 시간으로 96 - 웰 플레이트 셋업에서 여러 가지 조건을 사용하여 시간이 지남에 GTP 가수 분해. 광산란 연구 및 전자 현미경을위한 시료의 준비를 설명한다. 여러 버퍼가 FtsZ 중합 연구에 적합한 버퍼 pH와 염 농도를 설정하는 데 사용됩니다. 의 KCl의 높은 농도는 실험의 대부분을위한 최고입니다. 우리의 방법은 E.에서뿐만 FtsZ의 시험 관내 특성화를위한 시작점을 제공 대장균 및 B. 서브 틸리하지만 다른 박테리아에서. 이와 같이, 방법은 규제 단백질이나 FtsZ 중합에 영향을 미칠 수있는 약물의 항균 시험 FtsZ와의 상호 작용의 연구를 위해 사용될 수있다.

서론

필수 박테리아 단백질 FtsZ는 세균 세포 분열 기계의 유용한 특성화 된 단백질이다. FtsZ는 튜 불린의 원핵 생물의 상동과 GTP 의존적으로 체외에서 중합. FtsZ 세균 1,2에 그것의 보존 특성과 고유성으로 인해 새로운 항생제에 대한 매우 매력적인 대상입니다. 세포 분열의 시작 부분에서, FtsZ 다른 세포 분열 단백질의 조립을위한 발판 역할을 midcell에서 cytokinetic 고리를 형성한다. Z-링의 형성은 분할면의 정확한 현지화에 대한 매우 중요합니다. FtsZ의 조립 역학은 이러한 밍크, SepF, 사파, UgtP, 에스라 2 (세균의 종류에 따라) 등 여러 가지 액세서리 단백질에 의해 조절된다. FtsZ 중합 집중적으로 체외 똑바로 protofilaments, 곡선 protofilaments, 필라멘트의 시트, 필라멘트의 다발과 필라멘트의 튜브 등 다양한 구조에서 공부 한 데 있었다조립 버퍼, 뉴클레오티드 및 분석 3에 포함 된 추가적인 단백질에 의존 cribed. Caulobacter의 crescentus의 전자 cryotomography 실험은 Z-링이 넓은 4 동고하지 않고 비교적 짧은, 비 연속 단일 protofilaments에서 조립하는 것이 좋습니다 있지만, 생체 내에서 FtsZ의 protofilaments의 구조는 아직 완전히 이해되지 않습니다.

체외에서 FtsZ의 중합 특성 및 규제 단백질과 FtsZ의 상호 작용에 반응 버퍼의 조성에 민감합니다. 예를 들어, 우리는 최근 FtsZ C-말단에 SepF의 상호 작용 사이트를 설명하고 FtsZ 모텔 Δ16 C-말단 잘라 내기가 더 이상 SepF 5에 바인딩 것을 보여 주었다. SepF-FtsZ 모텔의 상호 작용에 관한 이전의 연구에서 비슷한 FtsZ 모텔 Δ16는 여전히 SepF가 FtsZ에 보조 사이트에 바인딩 것을 제안 SepF와 cosedimented 절단 6. 이러한 연구의 차이는 pH가 6.5에서 cosedimentation 있었다 반면 FtsZ의 잘라 내기와 SepF의 더 cosedimentation가 없었다 반응 버퍼 - 산도 7.5의 구성이었다. Gündoğdu 등. SepF이 작동하지 않습니다와 pH를 6.5에서 관찰 cosedimentation가 FtsZ 모텔 Δ16 C-말단 잘라 내기와 SepF의 침전이 아닌 상호 작용에 의해 발생 될 가능성이 있음을 보여주는, 산도 6.5 7에 침전 지적했다. FtsZ의 중합에 pH와의 KCl 농도의 영향은 이미 검토되었다. E.의 중합체 pH가 6.5에서 대장균 FtsZ (FtsZ 값 Ec)는 더 길고 풍부한 중성 pH 8,9 형성보다 있습니다. Tadros 등. K는 + 바인딩이 FtsZ 적 능력 중합에 연결하고 FtsZ 활동 (10)에 대한 매우 중요합니다 지적 가의 양이온의 존재 FtsZ 값 Ec의 중합을 공부했습니다. pH는 더 critica입니다SepF의 앞의 예와 FtsZ 11 밍크의 억제 효과의 pH 의존성에 의해 같이 다른 단백질과 FtsZ의 상호 작용, 연구되고 난. pH와 염 농도가 모두 다른 단백질 FtsZ의 상호 작용에 영향을 미칠 수있다, 그것은 FtsZ 중합 연구를위한 적절한 조건 및 컨트롤을 선택하는 것이 중요합니다.

여기에서 우리는 빛의 산란, 전자 현미경, 침강 및 GTPase의 분석 실험에 의해 FtsZ 중합 GTPase의 활성을 연구하기 위해 프로토콜을 설명합니다. 직각 광 산란 실시간 12 FtsZ 중합을 연구하는 표준 방법입니다. 우리는 침강 및 GTPase의 분석에 몇 가지 개선 사항을 소개했다. 우리는 빛의 산란 및 전자 현미경을 위해 샘플을 준비하는 방법에 대해 자세히 제시한다. FtsZ 중합을 연구 문헌에서 사용되는 몇 가지 버퍼를 테스트하고 우리는 각 실험에 가장 적합한 조건을 설명했다. 우리는 또한 있어야한다을 제어하는​​ 표시가장 좋은 데이터를 얻기 위해 도입했다.

이러한 방법은 FtsZ 중합, 활동하고 간단한 방법과 대부분의 실험실에서 사용할 장비를 사용하는 다른 단백질과의 상호 작용의 빠른 연구를 할 수 있습니다. FtsZ 중합을 연구하는 더 정교한 방법이 존재하지만 종종 형광 라벨 8,13,14 더 전문 장비에 대한 액세스, 및 / 또는 FtsZ의 수정이 필요합니다. 이 문서에서 설명하는 간단한 방법은 B.에서 FtsZ를 사용하여 도시된다 서브 틸리와 E. 콜리, 가장 일반적인 그램 + 및 그람 모델 생물. 프로토콜은 다른 FtsZ 단백질에 적용 할 수있다. 이 소설 FtsZs, 시간에 대한 약간의 변경, 버퍼 또는 배양 온도 예비 분석을 바탕으로 최적의 결과를해야 할 수도 있습니다. 여기에 설명 된 실험은 이러한 최적의 조건을 찾는 데 도움이됩니다.

프로토콜

태그가 지정되지 않은 FtsZ 단백질을 앞서 설명한 바와 같이 정제하고,11,15에서 20 mM Tris/HCl(pH 7.9), 50 mM KCl, 1 mM EGTA, 2.5 mM MgAc 및 10% 글리세롤에 대해 투석하고 -80 °C에서 보관했습니다. 이러한 조건에서 단백질은 현저한 활성 손실 없이 2년 이상 저장될 수 있습니다. 단백질은 샘플의 해동 및 동결을 방지하기 위해 100μl 분취량에 보관해야 합니다. 해동 후 샘플은 최대 1주일 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다. FtsZ는 고농도에서 용해되며 7-10mg/ml로 보관할 수 있습니다. 이후 실험에서 저장 완충액 성분의 원치 않는 영향을 피하기 위해 단백질 농도를 높게 유지하는 것이 중요합니다. 따라서 저장 농도는 글리세롤 농도를 1% 미만으로 낮추고 반응 혼합물에서 투석 완충액의 다른 성분 농도를 최소화하기 위해 FtsZ를 최소 10배 희석할 수 있어야 합니다. FtsZ 중합은 또한 높은 나트륨9 또는 이미다졸 농도의 존재에 의해 영향을 받을 수 있으므로 이러한 성분을 중합 완충액에서 제거해야 합니다. SepF는 기재된7과 같이 정제하고 -80°C에서 용출 완충액에 보관하였다. E. coli 및 B. subtilis로부터 FtsZ를 정제하기 위한 대안적으로 발표된 절차와 상이한 소스로부터의 FtsZ를 정제하기 위한 절차에 대한 언급이 표 1에 요약되어 있다(대표적인 결과 섹션 참조).

1. 샘플 준비

  1. 중합 완충액을 준비합니다. <테이블 테두리="1"> 1 개 50 mM 헤페스/NaOH, pH 7.5 2 개 25mM 파이프/ NaOH, pH 6.8 3 50mM MES/NaOH, pH 6.5 4 개 50 mM Hepes/ NaOH, pH 7.5; 50 mM KCl 5 개 25mM 파이프/ NaOH, pH 6.8, 50mM KCl 6 50mM MES/NaOH, pH 6.5, 50mM KCl 7 50 mM Hepes/ NaOH, pH 7.5; 300 mM KCl 8 25mM 파이프/ NaOH, pH 6.8, 300mM KCl 9 개 50mM MES/NaOH, pH 6.5, 300mM KCl
  2. 필터는 22μm 멤브레인 필터를 사용하여 모든 버퍼를 멸균합니다.
  3. (1)의 각 중합 완충액에 100mM GTP, GDP 및 MgCl2 원액을 준비합니다.
  4. 모든 실험에 대해 4°C에서 20분 동안 100,000 x g로 회전하여 단백질을 미리 세척합니다.

2. FtsZ 침전 분석

  1. 고속 원심분리와 호환되는 튜브의 중합 완충액(시료 준비 포인트 1 참조) 중 하나에 MgCl2 및 FtsZ를 첨가하여 반응 혼합물을 준비합니다. 총 부피는 49μl여야 하며, 최종 부피는 50μl에서 10mM에서 MgCl2, 12μM에서 FtsZ여야 합니다.
  2. 진탕 기능이 있는 인큐베이터에 튜브를 넣고 300rpm에서 30°C에서 2분 동안 배양합니다(또는 샘플을 부드럽게 튕기고 간단히 마이크로퓨징한 다음 30°C에서 예열할 수 있음).
  3. 실험에 사용된 것과 동일한 완충액에 1μl의 GTP 또는 GDP 원액을 첨가하여 중합을 시작합니다(최종 농도 2mM). 30 °C에서 300 rpm(또는 진탕 기능이 있는 인큐베이터에서)에서 10분 또는 2분(각각 50 mM KCl 및 300 mM KCl이 있는 완충액의 경우) 동안 배양합니다.
  4. 튜브를 초원심분리기 로터로 옮기고 25°C에서 350,000 x g(TLA 120.1 로터의 경우 89,700rpm)에서 10분 동안 스핀다운합니다.
  5. 회전 후 로터에서 튜브를 조심스럽게 제거하고 즉시 상층액을 깨끗한 튜브로 옮깁니다. 20μl의 2x 샘플 버퍼에 20μl의 상층액을 추가하여 SDS-PAGE용 샘플을 준비합니다. 98 °C에서 10분간 끓입니다.
  6. FtsZ 폴리머를 함유한 펠릿 분획에 50μl의 2x 샘플 버퍼를 추가합니다. 초원심분리기 튜브를 2ml 튜브에 넣습니다. 98°C에서 10분 동안 끓여서 펠릿을 재현탁시킨 다음 50μl의 탈염 H2O를 첨가하여 시료를 상등액 시료와 동일한 2배 희석으로 만듭니다.
  7. 2 ml 튜브에 넣은 초원심분리기 튜브를 거꾸로 뒤집고 18,000 x g의 속도로 Eppendorf 원심분리기에서 5분간 회전시킵니다. 2 ml 튜브에서 초원심분리기 튜브를 분리합니다.
  8. 각 상등액과 펠릿 시료 10μl를 10% SDS-PAGE 겔에 나란히 로드합니다. 젤을 150V에서 실행합니다.
  9. Coomassie Brilliant Blue G-250으로 젤을 염색하고 정량화를 위해 보관하십시오.

3. 느린 스핀에서 FtsZ 침전 분석

  1. 2단계에서와 같이 중합 용액을 준비하고 SepF 및/또는 FtsZ(최종 농도 12μM)를 추가합니다. 이러한 실험은 TLA-55 로터와 함께 Beckman 일회용 1.5ml 튜브에서 수행할 수 있습니다.
  2. 쉐이킹 기능이 있는 인큐베이터에 튜브를 넣고 30°C에서 300rpm으로 2분 동안 배양합니다.
  3. 원액(최종 농도 2mM)에서 1μl의 GTP 또는 GDP를 첨가하여 중합을 시작하고 300rpm에서 30°C에서 20분 동안 배양합니다.
  4. 25°C에서 24,600 x g(TLA 55 로터의 경우 20,000rpm)에서 15분 동안 스핀다운합니다.
  5. 상층액을 제거하고 깨끗한 튜브로 옮기고 20μl를 취하여 2x 샘플 버퍼의 20μl로 옮깁니다. 98 °C에서 10분간 끓입니다.
  6. 폴리머를 함유한 펠렛 분획에 50μl의 2x 샘플 버퍼를 첨가하고 98°C에서 10분 동안 끓여서 재현탁하고 50μl의 탈염된 H2O를 첨가합니다.
  7. 각 상등액과 펠릿 시료 10μl를 10% SDS-PAGE 겔에 나란히 로드합니다. 젤을 150V에서 실행합니다.
  8. Coomassie Brilliant Blue G-250으로 젤을 염색하고 정량화를 위해 보관하십시오.

4. FtsZ 침전 분석의 정량화

  1. 겔 문서화 시스템(예: LAS-4000, 후지필름)을 사용하여 Coomassie 염색 겔의 사진을 찍습니다.
  2. 겔의 농도 분석에 적합한 프로그램(예: AIDA 이미지 분석기 프로그램(Raytest))에서 겔 이미지를 열고 아래 이 프로그램의 분석을 설명합니다.
  3. 도구 모음에서 "평가" 버튼을 클릭합니다.
  4. 목록에서 "2D Densitometry"를 선택하고 확인을 클릭합니다.
  5. 메인 메뉴에서 "Evaluation(평가)"을 클릭하고 "Region Determination(지역 결정)" 항목을 선택합니다.
  6. 겔에 영역을 만들려면 Region Determination 도구 상자에서 Auto-contour 도구의 기호를 클릭합니다.
  7. 겔에 있는 단백질 밴드의 왼쪽 상단 모서리를 클릭하고, 마우스 버튼을 누른 상태에서 밴드의 원하는 오른쪽 하단으로 드래그한 다음 마우스 버튼을 놓습니다.
  8. 같은 방법으로 각 FtsZ/SepF 대역을 표시합니다.
  9. 할당된 지역의 평가에 대한 모든 정보는 지역 보고서에서 찾을 수 있습니다. 지역 보고서를 얻으려면 지역 결정 도구 상자에서 "지역 보고서 표시" 버튼을 클릭합니다.
  10. 보고서를 내보내려면 주 메뉴에서 파일을 클릭하고 "2D 지역 보고서 내보내기" 항목을 선택합니다.
  11. 지역 보고서에서 생성된 모든 지역의 강도를 찾아야 합니다. 보고서의 강도 값을 사용하여 펠릿의 단백질(FtsZ, 조절 단백질)의 백분율을 계산합니다.

5. 90° 광 산란

  1. 형광 분광계(예: AMINCO-Bowman Series 2)를 켜고 l을 기다립니다.amp 열 변동을 피하기 위해 몇 분 동안 예열하고 순환 수조를 켜서 큐벳 챔버 온도를 30°C로 유지합니다.
  2. 분광계의 작동 매개변수를 정의합니다: 검출기 고전압 300V, 방출 및 여기 파장: 350nm, 슬릿 폭: 4nm. 많은 분광계는 실험 시작 시 신호를 최대값의 특정 비율(예: 60%)로 자동 조정합니다. 이로 인해 FtsZ를 중합하기 위해 GTP가 추가되자마자 산란 신호가 범위를 벗어납니다. 일련의 실험을 시작하기 전에 먼저 최대 중합을 위한 올바른 신호 증폭(검출기, 고전압)을 설정하는 것이 현명합니다.
  3. 데이터 수집 프로토콜을 프로그래밍합니다. 3,600초 동안 지속되는 시간 기반 수집을 선택합니다.
  4. 형광 큐벳을 물과 에탄올로 조심스럽게 세척하고 필요한 경우 실온의 수조에서 5분 동안 초음파 처리합니다. 이 프로토콜에서는 경로 길이가 1cm이고 부피가 200μl인 큐벳을 사용하여 저장 용액(0.5-1% Hellmanex)에 보관했습니다. 대안으로 일회용 UV 호환 플라스틱 큐벳(UVette, Eppendorf)을 사용할 수 있습니다.
  5. 300 μl 및 와류에 대해 계산된 최종 농도로 10 mM MgCl2 및 12 μM FtsZ와 함께 중합 완충액(샘플 준비 포인트 1 참조)의 마스터 믹스 294 μl를 준비합니다.
  6. 196 μl의 중합 완충액을 큐벳으로 옮기고 분광계에 넣습니다. 30 °C에서 2분 동안 배양합니다.
  7. 데이터 수집을 시작하고 신호가 안정적인지 확인하기 위해 90초 동안 기다립니다.
  8. 4 μl의 100 mM GTP 또는 GDP(최종 농도: 2 mM)를 추가하여 200 μl의 최종 반응 부피를 달성하고, 더 큰 부피의 피펫으로 피펫을 위아래로 넣어 혼합하고 획득을 재개합니다.

6. 투과 전자 현미경

  1. FtsZ 침강 분석과 마찬가지로 샘플을 준비합니다(재료를 절약하기 위해 부피를 10μl의 최종 부피로 줄일 수 있음).
  2. 배양 시간 후, 샘플의 2 μl를 글로우 방전 400 메쉬 탄소 코팅 구리 그리드에 적용하고 15 초 동안 배양합니다.
  3. 그리드를 여과지 조각과 평행 또는 수직으로 부드럽게 만지거나 드래그하여 그리드를 닦아냅니다.
  4. 4μl의 2% 우라닐-아세테이트 용액을 사용하여 그리드를 염색합니다. 6.3단계에 설명된 대로 그리드를 닦아내십시오.
  5. 39,200X 배율에서 120kV로 작동하는 Philips CM120 전자 현미경의 그리드를 봅니다.

7. GTP 가수분해 분석

실험의 설정은 반응을 공작석 녹색과 혼합하여 다양한 반응 시간 후에 FtsZ의 GTP 가수분해를 중지하는 방식으로 설계되었습니다. 이런 식으로 공작석 녹색의 발색 시간은 각 샘플마다 동일합니다.

  1. 중합 완충액 중 하나에서 1.5ml 2mM GTP를 준비합니다(샘플 준비, 포인트 1 참조).
    중합 완충액에서 0-40μM 인산염 표준 희석액을 준비하고 POMG-25H(Bio assays) 키트에 설명된 대로 말라카이트 녹색 작업 시약을 준비합니다. 또는 작업 시약은 Lanzetta et al.에 설명된 프로토콜에 따라 사내에서 준비할 수 있습니다.16
    2. 세
  2. 총 부피 360 μl의 마스터 믹스를 준비합니다. <테이블 테두리="1"> 나는 24 μM FtsZBs, 20 mM MgCl2, 중합 완충액 제2장 12μM FtsZEc, 20mM MgCl2, 중합 완충액 III(컨트롤 1) 24μM FtsZBs, 2mM EDTA, 중합 완충액 IV (대조군 2) 12μM FtsZEc, 2mM EDTA, 중합 완충액
  3. qPCR 96-well 플레이트에서 마스터 믹스 20μl, 인산염 표준물질 100μl 및 2mM GTP 180μl를 다음 순서로 피펫팅합니다. <테이블 테두리="1"> ᅡ 비 씨 디 E 에프 지 H 1 개 제3장 제3장 나는 나는 제4장 제4장 제2장 제2장 2 개 제3장 제3장 나는 나는 제4장 제4장 제2장 제2장 3 제3장 제3장 나는 나는 제4장 제4장 제2장 제2장 4 개 제3장 제3장 나는 나는 제4장 제4장 제2장 제2장 5 개 제3장 제3장 나는 나는 제4장 제4장 제2장 제2장 6 제3장 제3장 나는 나는 제4장 제4장 제2장 제2장 7 제3장 제3장 나는 나는 제4장 제4장 제2장 제2장 8 제3장 제3장 나는 나는 제4장 제4장 제2장 제2장 9 개 추신 추신 추신 추신 추신 추신 추신 추신 10분 추신 추신 추신 추신 추신 추신 추신 추신 11세 12세 지티피(GTP) 지티피(GTP) 지티피(GTP) 지티피(GTP) 지티피(GTP) 지티피(GTP) 지티피(GTP) 지티피(GTP)
    PS - 인산염 표준
  4. 프로그램이 30°C에서 40분 주기로 설정된 PCR 기계에 qPCR 플레이트를 놓습니다.
  5. 96-well plate에 20 μl의 말라카이트 녹색 작업 시약 분취액을 준비합니다. 실험에서 얻은 중합 완충액 60μl를 1'-8' 레인에 추가합니다. 샘플은 인산염 표준물질에 비해 4배 희석될 예정이므로 최종 계산 시 이 사실을 고려하십시오. <테이블 테두리="1" cellpadding ="0" cellspacing="0"> ᅡ 비 씨 디 E 에프 지 H 1' 제3장 제3장 나는 나는 제4장 제4장 제2장 제2장 2' 제3장 제3장 나는 나는 제4장 제4장 제2장 제2장 3' 제3장 제3장 나는 나는 제4장 제4장 제2장 제2장 4' 제3장 제3장 나는 나는 제4장 제4장 제2장 제2장 5' 제3장 제3장 나는 나는 제4장 제4장 제2장 제2장 6' 제3장 제3장 나는 나는 제4장 제4장 제2장 제2장 7' 제3장 제3장 나는 나는 제4장 제4장 제2장 제2장 8' 제3장 제3장 나는 나는 제4장 제4장 제2장 제2장 9' 추신 추신 추신 추신 추신 추신 추신 추신 10' 추신 추신 추신 추신 추신 추신 추신 추신
  6. 20 μl의 GTP를 레인 1에 추가하고, 피펫을 위아래로 넣어 혼합하고, 타이머를 시작합니다(30분 반응의 시작 시점입니다).
  7. 10분 30초 후 GTP를 레인 2에 추가하고 피펫을 위아래로 넣어 혼합합니다(20분 반응).
  8. 16분 후 GTP를 3레인에 첨가하고 피펫을 위아래로 넣어 혼합합니다(15분 반응).
  9. 21분 30초 후 GTP를 4레인에 추가하고 피펫을 위아래로 넣어 혼합합니다(10분 반응).
  10. 25분 후 GTP를 5레인에 첨가하고 피펫을 위아래로 넣어 혼합합니다(7분 반응).
  11. 27분 30초 후 GTP를 6레인에 추가하고 피펫을 위아래로 혼합합니다(5분 반응).
  12. 29분 후에 GTP를 7레인에 추가하고, 피펫을 위아래로 넣어 혼합합니다 (4분 반응)..
  13. 30분 후 1레인에서 1레인으로 20μl를 옮기고 피펫을 위아래로 넣어 혼합합니다(30분 반응에 대한 공작석 녹색 발화 시작점).
  14. 30분 후 30초 동안 20μl를 레인 2에서 2'로 옮기고 피펫을 위아래로 옮겨 혼합합니다(20분 반응에 대한 공작석 녹색 발화 시작점).
  15. 30초마다 3-7번 레인에 대해 단계를 반복합니다.
  16. 33분 후 30초 후 20μl의 GTP를 8레인에 추가하고, 위아래로 피펫을 추가하여 20μl를 혼합하고 20μl를 8레인'으로 옮기고, 피펫을 위아래로 혼합하여 혼합합니다(0분 반응 및 반응에 대한 공작석 녹색 발현을 위한 시작 시점).
  17. 34분 후 레인 9에서 9'까지 80μl를 넣고 피펫을 위아래로 넣어 혼합합니다(인산염 표준물질 1에 대한 공작석 녹색 발현의 시작 시점).
  18. 34분 30초 후 10번 레인에서 10'으로 80μl를 피펫으로 위아래로 옮겨 혼합합니다(인산염 표준물질 2에 대한 공작석 녹색 발화 시작 시점).
  19. 샘플에서 모든 기포를 제거하고 플레이트를 실온에서 25분 30초 동안 더 배양합니다.
  20. 플레이트를 96웰 플레이트 리더에 놓습니다.
  21. 60분 후 630nm 파장에서 30초마다 플레이트를 10회 측정합니다(첫 번째 반응은 이제 공작석 녹색 발색이 30분임). 모든 측정은 7.6-7.12 및 7.16 단계의 모든 시점에 해당하며 데이터 분석 중에 별도로 계산해야 합니다.
  22. 인산염 표준물질 검량선을 사용하여 모든 샘플의 유리 인산염을 계산합니다.
  23. 시간 경과에 따른 인산염 방출로 데이터를 플로팅하고 곡선의 선형 범위에서 FtsZ GTP 가수분해 활성을 계산합니다.

결과

다양한 박테리아 유래 FtsZ의 정제 방법이 문헌에 기술되어 있으며, 그 내용은 표 1에 요약되어 있습니다.

제공된 소스 텍스트가 없습니다. 번역할 텍스트를 입력해 주세요.방법수정획득 수율 [배양액 L당 mg]>참고 문헌
B. subtilis1) 황산암모늄 침전/이온 교환 크로마토그래피아니요40본 연구, 11,15
2) 친화성 크로마토그래피His-태그검출되지 않음17
E. coli1) 황산암모늄 침전/이온 교환 크로마토그래피아니요35본 연구, 11,15
2) 칼슘 침전, 이온 교환 크로마토그래피아니요4018
Methanococcus jannaschii1) 변성 조건하의 친화성 크로마토그래피/재폴딩/황산암모늄 침전/겔 여과His-태그1.319
2) 친화성 크로마토그래피/ 겔 여과법His-태그검출되지 않음20
Thermotoga maritima이온 교환 크로마토그래피/젤 여과법아니요6.719
Pseudomonas aeruginosa친화성 크로마토그래피/겔 여과법Strep-tag, His-tag검출되지 않음21
결핵균(Mycobacterium tuberculosis)1) 친화성/이온 교환 크로마토그래피아니요검출되지 않음22
2) 친화성 크로마토그래피/겔 여과법아니요3023
Aquifex aeolicus친화성 크로마토그래피/겔 여과법His-tag, C-말단 절단 (331-367)검출되지 않음24
Caulobacter crescentus이온 교환 크로마토그래피/황산암모늄 침전/겔 여과아니요ND25

표 1. 설명된 FtsZ 정제 프로토콜. ND: 결정되지 않음.

FtsZ 폴리머의 침전

처음에는 FtsZ 폴리머를 침전시키기 위해 두 가지 서로 다른 원심분리 속도를 사용하였습니다. 우리는 350,000 x g의 속도에서만 FtsZEc의 단일 폴리머가 침전되는 것을 확인한 반면(Figure 1), 190,000 x g에서는 FtsZBs의 번들만이 펠렛 분획에 존재함을 확인하였습니다(데이터 미제시). 따라서 이후 실험에서는 350,000 x g를 사용하였습니다. 광산란 실험에서는 FtsZBs의 산란 신호가 훨씬 높게 나타났음에도 불구하고, 50 mM KCl에서 중합된 FtsZEc와 FtsZBs의 비율은 비슷했습니다. 이는 FtsZBs에 의해 형성된 번들이 FtsZEc의 단일 폴리머보다 더 많은 빛을 산란시키기 때문입니다. 300 mM KCl을 사용한 실험에서는 FtsZEc와 FtsZBs 모두 펠렛 분획에서 다량의 FtsZ 폴리머를 얻는 것이 불가능했습니다(Figure 1). 우리는 이를 FtsZ 구조의 빠른 해체와 필라멘트 번들 형성의 감소가 결합되어 나타난 결과로 보고 있습니다.

FtsZ-SepF 튜불의 침전

FtsZ와 특정 활성제 간의 상호작용을 분석하기 위해 낮은 원심분리 속도에서 침전 분석을 수행할 수 있습니다. 이 속도에서는 SepF 링과 FtsZBs 필라멘트에 의해 형성된 거대 튜불 예: 또는 FtsZ와 ZapA에 의해 형성된 번들과 같이 FtsZ의 거대 구조물만 펠릿화될 수 있습니다5. 우리는 FtsZ와 SepF에 의해 형성된 튜불에 대해 이 접근 방식의 타당성을 입증하기 위해 더 낮은 원심분리(24,600 x g)를 사용하였습니다. SepF와 GTP가 모두 샘플에 존재할 때만 FtsZ가 배경 수준 이상으로 펠릿에서 회수되었으며(그림 2), SepF의 존재는 FtsZ GTPase 활성에 영향을 미치지 않아7 SepF 존재 하에서 FtsZ가 완전히 활성화되어 있음을 보여주었습니다. SepF와 FtsZ의 특이적 침전량은 (GDP를 첨가했을 때 침전되는 물질과 비교하여) 전체 SepF의 약 45% 및 전체 FtsZ의 15%입니다. 이는 SepF-FtsZ 튜불에 FtsZ보다 SepF가 더 많이 포함되어 있음을 나타냅니다. 이는 많은 SepF 링이 FtsZ-SepF 튜불을 조직하기 때문일 수 있습니다5,7. 이러한 튜불 내 SepF-FtsZ의 정확한 화학 양론은 알려져 있지 않으나, 본 결과는 FtsZ보다 SepF가 더 많이 존재함을 시사합니다.

FtsZEc 및 FtsZBs의 중합 및 번들링 특성

FtsZ의 중합 효율을 특성화하기 위해Bs 및 FtsZEc 서로 다른 완충액에서 두 단백질 모두를 다음의 방법으로 분석하였습니다. 90° 각도 광산란. 50 mM KCl 조건에서, FtsZBs FtsZ보다 20~40배 더 높은 광산란 신호를 나타냅니다.Ec 완충액 pH에 따라 (그림 3A 및 B) Buske의 결과 확인 외 등.26 완충액 내 KCl 농도를 높여도 FtsZ의 광산란 신호에는 유의미한 영향을 미치지 않았습니다.Ec (그림 3D) 하지만 FtsZ의 신호는Bs 300 mM KCl 조건에서 pH 7.5일 때 약 80배, pH 6.8일 때 약 30배, pH 6.5일 때 약 45배 감소하였다 (그림 3C) 50 mM KCl가 포함된 완충액과 비교했을 때 (그림 3A). 두 단백질 모두 KCl 농도가 높을수록 FtsZ 중합체의 분해 속도가 더 빠릅니다 (그림 3C 그리고 D). Pacheco-Gómez의 연구들 외 등~임을 보여주십시오 대장균(E. coli) FtsZ의 중합 및 다발 형성은 pH에 의존적입니다. 연구자들은 50mM KCl이 포함된 완충액에서 pH 6.0일 때가 pH 7.0일 때보다 FtsZ 중합의 광산란 신호가 더 높았으며, FtsZ의 해체에 더 오랜 시간이 걸린다는 것을 발견했습니다. 8이러한 결과는 FtsZ 중합에 관한 당사의 데이터와 일치하지 않습니다.Ec 50 mM KCl에서 (그림 3B), 하지만 Pacheco-Gómez 등이 사용한 것과 달리 본 연구에서는 세 가지 서로 다른 완충액(HEPES, MES, PIPES)을 사용했다는 점에 유의해야 합니다. 외 등. MES만 사용하였습니다. 따라서 50mM KCl 조건에서는 pH뿐만 아니라 완충액 조성(이온 강도) 또한 FtsZ 중합체의 역학에 영향을 미칩니다. 그러나 300mM KCl 조건에서는 완충액 조성과 pH 모두 FtsZ에 영향을 주지 않았습니다.Ec 검출 가능한 방식으로 조립.

KCl가 없는 완충액에서는 단백질 침전이 발생하여 FtsZBs의 광산란 실험이 불가능했습니다. FtsZBs의 농도를 3 µM로 낮추었을 때는 침전이 일어나지 않았습니다. 하지만 3 µM은 세포 내 FtsZ의 생리적 농도가 아닙니다. 플라스틱 큐벳의 경우, pH 7.5에서 12 µM의 FtsZBs는 침전되지 않았으나, KCl이 없는 상태의 pH 6.8 및 6.5에서는 FtsZ가 여전히 침전되었습니다.

E. coli 및 B. subtilis 유래 FtsZ 구조의 형태학

FtsZ에 의해 형성된 구조를 TEM으로 관찰하였다. 저염 상태의 모든 버퍼에서 FtsZBs는 그리드 전체를 덮는 밀집된 중합체를 형성하였다(그림 4A-C). 저염 상태의 모든 버퍼에서 FtsZEc는 긴 필라멘트, 케이블 및 번들을 형성하였다(그림 4D-F). 그러나 FtsZEc에 의해 형성된 관찰 가능한 중합체의 양은 FtsZBs에 의해 형성된 양보다 적었다. 고염 버퍼에서 FtsZBs는 번들로 결합되지 않는 더 긴 단일 가닥의 원섬유(protofilaments)를 형성하였다(그림 4G-I). FtsZBs 원섬유는 염 농도가 높아짐에 따라 구조가 변한 반면, FtsZEc는 저염 버퍼의 구조와 구별되지 않는 구조를 형성하였다(그림 4J-L). FtsZEc의 중합에는 관찰 가능한 pH 영향이 없었으나, FtsZBs는 pH 6.5에서 더 많은 번들을 형성하며 이는 밀집된 중합체 및 시트 형태로 관찰되었다(그림 4B). 이러한 결과는 본 연구의 광산란 실험 및 이전에 발표된 TEM 연구 결과8,11,26와 일치한다.

고농도 및 저농도 KCl 조건에서 FtsZ의 GTPase 활성

FtsZ의 GTP 가수분해 활성을 유리 인산에 대한比色법(colorimetric assay)을 사용하여 서로 다른 조건에서 측정하였습니다. 이전에 보고된 바와 같이15 FtsZ의 GTPase 활성은 KCl 농도가 증가함에 따라 증가하였습니다. 사용된 완충액에 따라 300 mM KCl에서 FtsZBs는 50 mM KCl 대비 3-7배, FtsZEc는 1.5-2.5배의 GTPase 활성 증가를 보였습니다. 50 mM KCl에서 GTPase 활성이 감소한 것은 FtsZBs 필라멘트의 번들링(bundling) 때문입니다. 50 mM KCl에서 FtsZEc는 FtsZEc 폴리머의 더 빠른 해체 덕분에 FtsZBs보다 3-6배 높은 GTPase 활성을 나타냈습니다. FtsZBs와 FtsZEc 사이의 GTP 가수분해 활성 차이는 300 mM KCl에서 감소하였으며, 이는 아마도 FtsZBs 필라멘트의 번들링이 감소했기 때문일 것입니다(그림 5).

FtsZ 중합, % 펠렛 분석, 막대 그래프, 젤 전기영동, GTP/GDP 효과 비교.
그림 1. 침전법을 통한 FtsZ 중합의 정량 분석.(A) 12 µM FtsZ를 2 mM GTP 또는 GDP 존재 하에 pH 7.5(검은색 막대), 6.8(회색 막대) 또는 6.5(흰색 막대)에서 중합시켰다. 침전된 단백질의 양은 Coomassie 염색 젤의 밀도 분석으로 결정하였다. GDP는 특이적 침전에 대한 대조군으로 사용되었으며, GTP와 함께 침전된 FtsZ의 백분율에서 GDP와 함께 침전된 FtsZ의 백분율을 빼서 그래프에 표시된 값을 얻었다. 왼쪽: 50 mM KCl에서 침전된 FtsZ, 오른쪽: 300 mM KCl에서 침전된 FtsZ. (B) Coomassie 염색 젤의 대표적인 결과. 50 mM KCl에서 FtsZBs (위쪽 젤) 및 FtsZEc (아래쪽 젤)의 중합. (S) 상층액, (P) 실험의 펠렛 분획. 여기를 클릭하여 더 큰 이미지 보기.

FtsZ와 SepF 상호작용 그래프 및 GTP/GDP가 단백질 펠렛 비율에 미치는 영향을 보여주는 겔.
그림 2. 저속에서의 SepF/FtsZ 튜블의 침전. (A) 12 µM FtsZBs를 2 mM GDP (흰색 막대) 또는 GTP (검은색 막대)와 함께 중합시켰다. 펠렛으로 침전된 단백질의 양은 Coomassie 염색 겔의 농도 분석(densitometric analysis)을 통해 결정하였다. x축 아래의 + 및 - 기호는 반응액 내 FtsZ와 SepF의 존재 또는 부재를 나타낸다. (B) Coomassie 염색 겔의 대표 결과. SepF 존재 및 부재 하에서의 FtsZBs 중합. 대조군으로 FtsZ가 없는 SepF를 사용하였다. 중합은 GTP 및 GDP를 사용하여 수행되었다. (S)는 상층액, (P)는 실험의 펠렛 분획을 나타낸다. 크게 보려면 여기를 클릭하십시오.

KCl 농도에 따른 FtsZ의 광산란 그래프; pH 6.5, 6.8, 7.5의 영향 제시
그림 3. 12 μM FtsZEc 및 12 μM FtsZBs의 광산란. FtsZ들은 2 mM GTP 존재 하에 조립되었으며, 중합 과정은 90° 각도 광산란으로 모니터링되었다. pH 7.5, pH 6.8, pH 6.5의 50 mM KCl 조건에서 FtsZBs (A)와 FtsZEc (B)의 중합. pH 7.5, pH 6.8 및 pH 6.5의 300 mM KCl 조건에서 FtsZBs (C)와 FtsZEc (D)의 중합. 더 큰 이미지 보려면 여기를 클릭하세요.

다양한 pH 및 KCl 농도에서의 FtsZ 중합체 전자 현미경 사진; 구조 분석.
그림 4. 전자 현미경으로 시각화한 FtsZBs 및 FtsZEc 중합체의 구조. (A-L) 2 mM GTP로 중합된 12 µM FtsZBs (A-C 및 G-I) 및 FtsZEc (D-F) 및 (J-L)의 이미지. (A-C) 각각 50 mM KCl 및 pH 7.5, 6.8, 6.5인 완충액 내의 FtsZBs. (D-F) 각각 50 mM KCl 및 pH 7.5, 6.8, 6.5인 완충액 내의 FtsZEc. (G-I) 각각 300 mM KCl 및 pH 7.5, 6.8, 6.5인 완충액 내의 FtsZBs. (J-L) 각각 300 mM KCl 및 pH 7.5, 6.8, 6.5인 완충액 내의 FtsZEc. 스케일 바: 100 nm. 더 큰 이미지로 보려면 여기를 클릭하십시오.

GTPase 활성 그래프; pH 7.5, 6.8, 6.5 변동에 따른 50mM 대 300mM KCl에서의 FtsZ 막대 그래프.
그림 5. 6가지 서로 다른 버퍼에서의 FtsZ 중합 중 GTP 가수분해. 모든 실험에 2 mM GTP가 사용되었습니다. MgCl2가 없는 샘플을 대조군으로 사용하였습니다. MgCl2가 없는 FtsZ의 활성을 MgCl2 존재 하에서의 FtsZ 활성에서 차감하였습니다. 왼쪽: 50 mM KCl에서의 FtsZ GTPase 활성, 오른쪽: 300 mM KCl에서의 FtsZ GTPase 활성. 여기에서 더 큰 이미지 보기.

토론

우리는 FtsZ 활성과 다른 단백질과의 상호 작용을 빠르게 분석할 수 있는 일련의 방법을 설명합니다. 광산란, 침강 및 GTPase 분석과 전자 현미경은 FtsZ 중합을 연구하는 데 널리 사용되었습니다. 우리는 기존 프로토콜을 일부 개선했으며 FtsZ 조립에 대한 다양한 조건의 영향을 보여주었으며 FtsZ 연구에 포함되어야 하는 컨트롤을 제안합니다.

FtsZ와 FtsZ 중합체와 상호 작용하는 단백질 사이의 결합에 의해 형성된 큰 구조를 구별하기 위해 저속 원심분리를 도입합니다. 이 방법은 표준 침전 분석에 비해 두 가지 장점을 보여줍니다. 첫째, 펠릿 분획의 FtsZ 폴리머는 24,600 x g에서 회전되지 않기 때문에 배경이 형성되지 않습니다. 둘째, 상호 작용하는 단백질로 형성된 구조에 존재하는 FtsZ의 양은 겔로부터 계산될 수 있습니다. 이 방법의 두 가지 중요한 단계는 배양 시간과 GTP 농도입니다. 큰 단백질 구조가 완성되면 원심분리하는 것이 중요하지만 모든 GTP가 가수분해될 때 분해되기 전입니다. 이 연구를 위한 최선의 대조군은 FtsZ와 GDP의 중합입니다. 분석에는 한 가지 잠재적인 한계가 있습니다. FtsZ는 24,600 x g에서 쉽게 회전할 수 있는 SepF와 안정적인 복합체를 형성합니다. 다른 활성제 또는 FtsZ 중합체를 묶는 약물로 침전이 수행되는 경우 분석을 조정해야 할 수도 있습니다. 배양 시간을 변경하거나 원심분리 속도를 높여 수행할 수 있습니다.

시료의 적절한 준비는 광산란 실험에서 가장 중요합니다. 단백질은 방사에 의해 사전 제거되어야 하며 모든 완충액은 사용하기 전에 여과되어야 합니다. 샘플에 응집체가 존재하면 FtsZ 폴리머에서 얻은 안정적인 신호를 방해합니다. 전자 현미경으로 FtsZ 구조를 분석하려면 그리드 준비가 주요 단계입니다. 그리드에서 샘플을 배양하는 시간은 다소 압축된 폴리머를 생성하는 효과가 있습니다. FtsZB 묶음의 경우, 배양 시간은 높은 KCl 농도에서 FtsZEc 및 FtsZBs 보다 짧아야 합니다. 결과를 비교할 수 있도록 모든 샘플에 12μM의 농도를 사용했습니다. 그러나 50mM KCl의 FtsZBs 의 경우 12μM으로 인해 그리드가 완전히 포화되므로 더 낮은 FtsZ 농도를 사용해야 합니다. 이로 인해 폴리머가 매우 압축되어 감지하기 어렵습니다. 덜 압축된 폴리머는 EM에서 감지하는 것이 좋습니다.

GTPase 분석은 FtsZ의 구조가 아닌 활성을 연구하는 데 사용되는 유일한 실험입니다. Mg2+는 FtsZ 폴리머의 GTP 회전율에 필요합니다. 따라서 Mg2+가 없으면 FtsZ는 GTP를 가수분해하지 않습니다. 따라서 Mg2+가 없는 샘플이 이 분석에서 올바른 대조군이지만 Mg의 양이온은 FtsZ 저장 완충액에 존재합니다. 대조군 샘플에 1mM EDTA를 첨가하여 제거할 수 있습니다. 이 분석의 중요한 단계는 배양 시간입니다. 주어진 시간이 지나면 FtsZ 활동을 중지하는 것이 중요합니다. 이것은 FtsZ 샘플을 96웰 플레이트의 공작석 녹색 용액으로 옮겨 달성됩니다. 그러나 공작석 녹색의 개발은 지속적인 과정입니다. 따라서 모든 샘플에 대해 동시에 측정해야 합니다. 설정된 순서로 30초마다 측정하는 잘 계획된 GTP 추가 프로토콜을 사용하면 모든 시점에 대해 동일한 배양 및 샘플 처리 시간을 얻을 수 있습니다. 또 다른 중요한 단계는 실험을 위한 단백질의 농도를 선택하는 것입니다. 실험에서 우리는 FtsZEc와 FtsZ Bs에 대해 두 가지 다른 농도를 사용했습니다. GTP 가수분해는 FtsZBs에 비해 FtsZEc의 경우 훨씬 빠릅니다. 선택된 조건 및 12μM에서 FtsZEc의 GTPase 활성은 최대 5분 동안만 선형이며 그 이후에는 가수분해 속도가 정체됩니다. 따라서 이러한 조건에서 수행될 때 실험 데이터를 해석하기가 어렵습니다. 이 경우 두 단백질의 활성을 비교할 수 있도록 FtsZEc를 FtsZBs보다 낮은 농도로 사용해야 합니다. 다양한 출처의 FtsZ의 GTPase 활성은 다를 수 있습니다. 따라서 올바른 농도를 선택해야 합니다. FtsZ 중합 농도는 임계 농도(일반적으로 2.5-10μM)보다 훨씬 높아야 합니다. FtsZ 조립 및 분해의 역학도 중요합니다. 일부 단백질은 50mM KCl에서 FtsZB에 대해 표시된 바와 같이 GTP 첨가 후 중합에서 상당한 지연을 나타냅니다. FtsZ 폴리머의 조립 및 분해 시간을 대략적으로 추정하기 위해 GTPase 분석 전에 광산란 분석을 수행하는 것이 유용합니다. 그 후, 배양 시간과 단백질 농도를 선택할 수 있습니다. FtsZ 중합을 위해 선택한 조건이 중요하기 때문에 각 방법에서 올바른 pH 및 KCl 농도를 사용하는 것이 중요합니다. 이 작업에서 우리는 pH 범위가 6.5-7.5이고 KCl 농도가 0M에서 300mM인 9가지 완충액을 연구했습니다. 우리는 B. subtilis 및 E.coli의 FtsZ와 이들의 생물학적 활성을 분석하는 가장 좋은 조건은 높은 KCl 농도와 함께 생리학적 수준(7.5)에 가까운 pH임을 알아차렸습니다. 높은 KCl 농도에서 FtsZ는 더 높은 GTPase 활성을 가지며 전자 현미경으로 더 잘 검출할 수 있는 폴리머를 생성합니다. 우리는 또한 생리학적 pH와 높은 KCl 농도가 FtsZ 조립 연구에 주로 사용되는 다른 완충액보다 FtsZ와 조절 단백질 사이의 상호 작용 연구에 더 좋다는 것을 확인했습니다. FtsZBs는 높은 KCl 농도에서 연구할 때 FtsZEc와 유사한 활성을 나타냅니다. 또한, 염 농도가 낮을 때 pH의 영향은 염 농도가 높은 완충액보다 더 눈에 띕니다. FtsZ는 KCl이 없는 완충액을 사용할 때 때때로 침전되므로 염이 없는 완충액은 피해야 합니다. FtsZ 중합체의 침전은 KCl 농도가 높은 완충액을 사용할 때 낮습니다. 이는 FtsZ와 SepF 및 ZapA와 같은 FtsZ 필라멘트를 조립하는 단백질 간의 상호 작용을 연구할 때 이러한 고차 구조가 원심분리로 쉽게 검출될 수 있기 때문에 이점이 될 수 있습니다. 모든 실험에서 우리는 10mM 농도의 MgCl2를 사용했습니다. 상대적으로 높은 Mg2+ 농도는 FtsZ 중합체를 안정화시키고 FtsZ의 GTPase 활성을 감소시키는 것으로 나타났습니다. 표 2에는 다양한 연구의 결과가 요약되어 있으며, 그렇지 않으면 동일한 완충액 조건을 사용하여 상이한 Mg2+ 농도에서 FtsZ 중합 및 GTPase 활성을 설명합니다 27. 유리 세포질 Mg2+의 측정된 농도는 0.9mM3입니다. GTP는 동등한 양의 Mg2+를 킬레이트화한다는 점에 유의해야 합니다. 따라서 GTPase 실험을 위한 최적의 Mg2+ 농도는 약 2-2.5mM로 생리학적 수준3에 가깝습니다. 그러나 실험에서 우리는 쉽게 감지할 수 있는 광산란 신호를 얻고 침강 분석 중에 FtsZ 중합체를 안정화하기 위해 10mM 농도의 MgCl2를 사용했습니다.

모델 유기체 대 장균 및 B. subtilis의 FtsZ에 프로토콜을 적용했지만 다른 유기체의 FtsZ에 적응할 수 있습니다. 생리학적 pH, 1가 및 2가 양이온의 농도는 유기체마다 다르다는 점에 유의해야 합니다. 따라서 FtsZ 중합을 위한 최적의 조건은 다를 수 있습니다. 서로 다른 박테리아의 배가 시간과 성장 조건의 차이로 인해 FtsZ의 조립 동역학과 최적의 실험 조건이 달라질 수 있습니다. 그러나 우리의 프로토콜은 다른 유기체의 FtsZ를 사용한 실험을 위한 좋은 출발점을 제공합니다. 프로토콜은 조절 단백질을 사용한 FtsZ 연구 또는 FtsZ에 대한 작은 화합물 및 약물의 효과 연구에 유용해야 합니다.

근원중합 [침전된 FtsZ의 %)GTPase [파이/FtsZ/분]Mg2+ 농도 [mM]FtsZ 농도 [μM]참조
FtsZEC~ 28%~ 2.11012이 작품
~ 50%~ 2.41012.527
~ 43%~ 3.5512.527
~ 27%~ 4.62.512.527
ND~ 5.42.5526
FtsZBs~ 30%~ 0.812이 작품
~ 52% (DEAE 덱스트란 포함)~ 0.5101011
ND~ 2.252.5526

표 2. FtsZ 중합 및 GTPase에 대한 Mg2+ 의 영향. 이 작업의 결과를 발표된 데이터와 비교한 결과. 모든 실험은 50mM MES/NaOH, pH=6.5, 50mM KCl에서 수행되었습니다.

공개 사항

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

감사의 글

우리 실험실에서의 작업은 네덜란드 과학 연구 기구(DJS)의 VIDI 보조금으로 자금을 지원받습니다. 투과 전자 현미경에 대한 접근을 제공하고 도움을 주신 Marc Stuart와 우리 대학의 전자 현미경 부서에 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
GTPRoche10106399001Part 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
두꺼운 폴리카보네이트 튜브Beckman Coulter343776Part 2
Optima MAX-XP 초원심분리기Beckman Coulter393315Part 2, 3
스냅온 캡이 있는 폴리알로머 튜브Beckman Coulter357448Part 3
AIDA Bio-package, 1D, 2D, FLRaytest 이소토펜메스거ä te GmbH15000001 Part 4
발광 이미지 분석기 LAS-4000FujifilmPart 4
Thermo Spectronic AMINCO-Bowman 발광 분광계Spectronic InstrumentsPart 5
형광 셀Hellma Analytics105-250-15-40Part 5
Square 400 Mesh, 구리, 100/바이알전자 현미경 SciencesG400-Cu파트 6
120kV에서 작동하는 CM120 전자 현미경PhilipsPart 6
96 ml x 0.2 ml 플레이트BIOplasticsB70501Part 7
말라카이트 그린 포스페이트 분석 키트BioAssay SystemPOMG-25HPart 7
PowerWave HT 마이크로플레이트 분광 광도계BioTekPart 7

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