방법 논문

에 대한 마이크로 미터 프로브의 원격 자기 발동

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DOI:

10.3791/50857

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2014년 5월 2일

 ,  ,  ,  , 
1Physicochime Curie, CNRS UMR 168, Institut Curie, Sorbonne Universités, UPMC, 2Unité de Génétique des Biofilms, Institut Pasteur, 3Laboratoire Jean Perrin, CNRS UMR 8237, Sorbonne Universités, UPMC

이 논문에서

요약

이 논문은 세균 바이오 필름과 현장에서 인터페이스에서 미생물에 의해 만들어진 복잡한 생활 소재의 로컬 기계적 특성을 측정 할 수있는 전용 자기 핀셋의 개발에 씨앗을 품고 자기 입자의 원격 작동에 따라 원래의 방법을 보여줍니다.

초록

인터페이스에 대한 세균의 부착과 성장을 입체적 이종 구조 소위 바이오 필름의 형성으로 이어질. 이러한 구조에 사는 세포는 세포 외 고분자 물질의 네트워크에 의해 매개 물리적 상호 작용에 의해 함께 개최됩니다. 세균 바이오 필름은 많은 인간의 활동에 영향을 미칠 및 해당 속성에 대한 이해는 개발의 더 나은 제어를 위해 매우 중요합니다 - 유지 보수 또는 근절 - 자신의 불리한 유익한 결과에 따라. 이 논문은 지금까지 단 거시적 균질 재료의 관점에서 검토, 현장에 있었다 바이오 필름의 지역의 물리적 특성을 측정하기 위해 목표로하는 새로운 방법을 설명합니다. 여기에 설명 된 실험은 원격으로 바이오 필름의 구조적 특성을 방해하지 않고 작동 할 수있는 지역의 프로브를 씨앗에 성장하는 바이오 필름에 자성 입자를 도입하는 것을 포함한다. 전용 자기 핀셋 deve을했다바이오 필름에 포함 된 각 입자에 정의 된 힘을 발휘하는 loped. 설치는 입자를 잡아 당기는 기간의 시간 경과 영상의 기록이 가능하도록 현미경의 무대에 장착된다. 입자 궤적이어서 당기는 시퀀스로부터 추출되고, 로컬 점탄성 파라미터함으로써 파라미터의 3 차원 공간 분포를 제공하고, 각 입자 변위 곡선으로부터 유도된다. 생물막 기계적 프로필 통찰력을 얻는 것은 구조적 특성 및 이들 구조의 특정 생물 사이의 관계를 명확히하기 위해 생물막 제어 목적 뷰 엔지니어의 관점에서뿐만 아니라, 기본적인 관점에서 필수적이다.

서론

세균 바이오 필름은 생물학적 또는 인공 표면 1-3와 관련된 박테리아의 사회입니다. 이들은 4,5 구성물을 보호하고 안정화 다당류 풍부한 세포 외 매트릭스의 제조와 결합 접착 성장 메커니즘에 의해 형성한다. 이 바이오 필름은 표면에 붙어있는 세포를 단순히 수동적 군집 아니지만, 조직 및 동적 복잡한 생물학적 시스템. 박테리아가 바이오 필름의 라이프 스타일에 플랑크톤에서 전환하면, 유전자 발현 및 세포 생리학의 변화는 항생제에 저항을 증가뿐만 아니라 관찰 많은 지속 및 만성 감염 (6)의 원점 인 면역 방어를 호스팅하고 있습니다. 그러나 이러한 생활 구조의 제어 개발은​​ 또한 유해 폐기물 사이트의 생물학적, 공업용 또는 contamin에서 토양과 지하수를 보호하기 위해 바이오 장벽의 형성 바이오 여과 등의 산업 및 환경 응용을위한 기회를 제공ATION.

삶의 바이오 필름의 방법으로 특정 분자 기능이 점점 더 설명하는 동안, 지역 사회 개발 및 지속성을 구동 메커니즘은 불분명하다. 스캔 전기 또는 형광 현미경을 사용하여 마이크로 측정에 대한 최근의 발전을 사용하여이 살고있는 조직 구조, 화학 및 생물 학적 이질성 7 상당한 전시하는 것으로 나타났다. 그러나, 지금까지 바이오 필름의 역학은 주로 거시적으로 조사되었다. 예를 들어, 바이오 필름 ​​깃발의 관찰에 의한 유체 유량 8,9의 변화에 변형 바이오 필름 ​​조각의 일축 압축 한천 배지에서 올리거나 커버 한 후 10, 11, 환경에서 수집 된 바이오 필름의 전단과 병렬로 전송 슬라이드에 성장 플레이트 레오 미터 12,13, AFM 캔틸레버 (14) 나 전용 MICR 부착 세균 바이오 필름과 유리 구슬과 코팅을 이용하여 원자 힘 분광분리 된 바이오 필름 ​​조각 (15, 16)의 인장 강도를 측정하기위한 ocantilever 방법은 재료 (17)의 점탄성 특성에 대한 유용한 정보를 제공, 지난 10 년 동안 구현되었습니다. 그러나,이 재료는 흔히 이러한 방법에서의 경우와 네이티브 환경으로부터 제거 될 때 동일계 생물막 기계적 특성에 대한 정보가 손실 된 것으로 보인다. 또한, 균일 한 물질로서 바이오 필름의 처리는 커뮤니티 내 물성 가능한 이질성에 대한 정보를 벗어났습니다. 따라서, 구조 biofilm 형성의 역학과 같은 유전자 발현 패턴 또는 화학 그라데이션 같은 생물학적 특성의 정확한 의미는 거의 인식 할 수 없습니다. 바이오 필름 물성의 마이크로 설명으로 진행하기 위해, 새로운 전용 도구가 필요합니다.

이 논문은 달성하기 위해 생각 원래의 접근 방법의 자세한 사항생물막을 방해하고 마이크로 물질 특성의 공간적 분포의 그린 다음 기계 이질성을 사용하지 않고 현장에서 지역 기계 매개 변수의 측정. 실험의 원리는 성숙 생물막 자성 핀셋을 사용하여 원격 로딩 하였다 자성 미세 입자와 함께 성장하는 생물막의 도핑 달려. 현미경으로 몇 군데 제어 자력 응용 프로그램에서 입자 변위는 지역 점탄성 매개 변수 유도, 자신의 지역 환경을보고 각각의 입자 수 있습니다. 이 데이터에서 바이오 필름의 3D 기계 프로파일은 공간 및 환경 조건 의존성을 드러내는, 그릴 수 있습니다. 전체 실험 E. 여기에 표시됩니다 derepressed F와 같은 플라스미드를 운반하는 유전자 조작 변형에 의해 대장균 바이오 필름. 최근의 논문 (18)에 상술 결과는 그대로 생물막 기계의 내부의 독특한 비전을 제공.

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프로토콜

1. 박테리아 문화와 서스펜션 준비

  1. , Lysogeny 국물 (LB) 한천 플레이트에서 갓 식민지를 선택 LB 액체 배지를 100 μ g / ml의 암피실린 및 7.5 μ g / ml의 테트라 사이클린을 포함하는 5 ㎖에 접종하고에 37 ° C에서 5 ~ 6 시간 동안 그것을 품어 플랫폼을 흔들어.
  2. 그런 다음, 최소 배지 (M63B1)는 0.4 %의 포도당과 같은 항생제의 농도와 보충 5 ㎖의 세균 배양의 100 μ 리터를 추가합니다. 흔들리는 플랫폼에서 37 ° C에서이 갓 희석 문화 밤새 품어.
  3. 배양 16 시간 후, 5 ㎖ M63B1, 0.4 % 포도당에 하룻밤 문화 μL (100)를 추가합니다. 0.5 OD까지 흔들리는 플랫폼으로 37 ° C에서 튜브를 유지에 도달합니다. 서스펜션은 biofilm 형성에 대한 실험 채널에 주입 한 다음 준비가되어 있습니다.

2. 자기 입자 제조

  1. 10 ㎕의 자성 입자를 타고 -2.8 μ m 직경 - 재고하고 세척은 자기 샘플 랙의 도움으로 190 ㎕의 최소 배지에서 3 배.
  2. 5 × 6 구슬 / ㎖로 입자 농도를 조정합니다. 일반적으로 세척 비드 용액을 50 ㎕의 0.4 % 포도당과 M63B1의 추가 950 μ L와 혼합된다.

3. 채널 준비 및 바이오 필름 성장

  1. 채널 장착
    1. 2 개의 8 cm 긴 조각을 얻을 10cm 긴 두 개의 사각형 (800 μ의 M 측 길이) 붕규산 유리 모세관을 잘라.
    2. 첫 번째 반으로 잘라 - 개 - 2 개 cm 간격 1cm 오버행으로 양쪽 끝의 그림 1과 (그래서 슈퍼 접착제라고 함) 속효성 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 사용하여 두 개의 유리 슬라이드에있는 두 개의 모세관 조각을 붙입니다.
    3. 전체 셋업하고 상기 채널 접속에 필요한 필요한 튜빙 압력솥.
    4. 모든 살균 물질에서 수집층류 후드 : I) 장착 된 채널 및 트랩 1, II) 튜브 및 커넥터, ⅲ) 두 개의 버블 트랩 - 거품 필터는 일반적으로 아동의 물방울 수유 (트랩 1), 집에서 만든 버블 트랩을 보호하는 데 사용 큰 직경의 4 cm 길이 튜브 (함정 2)로, IV) 클램프, V) M63B1, 0.4 % 포도당 및 VI) 폐기물 병 가득 30 ML 주사기.
    5. 폐기물 병에 주사기 펌프, 소아 거품 필터, 집에서 만든 거품 트랩, 모세관 (그림 1, 패널 B), 튜브에 의해 제어 50 ㎖ M63B1 주사기 : 다음과 같은 순서로 루어 잠금 연결 관 또는 접합와 전체 설치를 연결합니다. 그 후 약 10 ㎖ / 시간, 실험 속도보다 더 높은 속도로 주사기 펌프를 켜기, 멸균 M63B1, 0.4 %의 포도당으로 설정을 입력합니다. 조심스럽게 추적하고 회로의 모든 거품을 제거합니다.
    6. 10 ~ 15 분 동안 시스템을 통해 매체의 흐름; 동시에 절에서 OD 0.5에서 세균 현탁액 1 ㎖를 혼합2.2 절에서 제조 세정 비드 용액 1 ㎖와 함께 1.3.
    7. 전후의 모세 혈관 : 첨부 (하지만 닫지 마십시오) 두 위치에서 튜브에 클램프. 흐름을 끕니다.
    8. 튜브를 잡고 돌보는 것은 공기의 유입을 방지하기 위해 종료 1 ML의 주사기를 사용하여 집에서 만든 버블 트랩 후 모세 혈관에 세균 비드 혼합물을 소개합니다. 튜브를 다시 연결하고 클램프를 닫습니다.
    9. 두 번째 모세관에 대해 동일한 절차를 반복하고 거품에 대한 모든 튜브를 확인합니다.
    10. 현미경 장치를 이동하고 정착 모세관의 표면에 부착하는 박테리아를 사용하려면 15 ~ 20 분 동안 방치한다. 약간 높은 수준에서 폐기물 용기와 현미경 무대에 모세관을 설치합니다. 현미경 옆에있는 카운터 위에 주사기 펌프를 배치합니다. 거품을 캡처 할 모세관 비행기보다 약간 높은 모세관 전에 버블 트랩을 올립니다.
  2. 바이오 필름 촉진제WTH
    1. 일반적으로 24 또는 48 시간이 실험에서 - 주사기 펌프의 유량을 조정하고 흐름을 시작, 생물막은 이제 필요한 기간 동안 모세관 표면에 개발할 것이다.
    2. 모세관 바닥면에 초점 샘플 이미지의 시간 경과 기록을 시작 -이 이미지의 보통 취득 주파수 / 분 적절히 생물막 성장을보고합니다. 이 비디오 모니터의 생물막 성장 후 제어 (동영상 1, 2에서 추출 및 3 참조).

4. 자기 족집게 설치

  1. 수동으로 제어 XYZ 미세 조작기의 자기 족집게 나사 상대적으로 모세관에 핀셋의 위치를​​ 조정하기 위해 현미경 무대에 미세 조작기를 나사. 적절한 자기장 변화가 관측 영역에 생성되어 있는지 확인하기 위해 그림 2와 핀셋을 놓습니다.
  2. 핀셋 T 연결한다O 전력 증폭기를 통한 함수 발생기는 24 초 영 신호 (4)의 시퀀스를 제공하는 신호 동기화를위한 20 초 후 시야 광 셔터로 전송 트리거 직류의 16 초의 제 시간의 40 초주기를 생성 그림 3에서와 같이 이벤트.
    주 :이 두 가지 작업은 모세관 설치 및 측정 시작 사이 언제든지 달성 될 수있다. 그림 4의 개요 스케치를 실험을 참조하십시오.

5. 크리프 곡선 취득

  1. 좌측의 자극과 같은 관찰 필드 모세관의 좌측 에지의 에지를 가지고 현미경 스테이지의 XY 이동 제어를 사용하고 있습니다. (도 2 참조)을 각각의 모세관 에지에 의해 정의 된 x-및 y-축의 교차점과 폴 피스의 에지 분석 참조의 원점을 가라.
  2. 미세 초점 C를 이용하여 모세관의 수직 위치를 조정현미경 위치 ontrol의 노브를 누릅니다. 일반적으로 첫 번째 검사 평면이 μ 4-7 간의 M 모세관 바닥 위에 있습니다. 비디오 1은 공간 참조의 원점은 왼쪽 상단이 (XY) 필드에 해당.
  3. 전류 발생기와 동시에 전환하여 섹션 4.2 및도 3에 설명 된 이벤트를 40 초 시퀀스를 트리거 수동 비디오 하나의 화상 취득 시퀀스를 발생시킨다.
  4. 필요한 영상을 획득하는 등 왼쪽에있는 현미경 단계의 250 μ m 번역에 의해 이웃 오른쪽 필드에 모세관을 이동하고 슬라이스 2의 비디오 2를 생성하는 섹션 5.3로 작동합니다. 250 × 250 μ 평방 미터의 일반적으로 3 ~ 4 필드는 비행기를 변경하고 새로운 평면에 동일한 작업을 반복하기 전에 X 축을 따라 수집됩니다.

6. 힘 교정

  1. 이중 증류수 190 μ L과 2 × 10 9 입자 / ㎖에서 자성 입자의 10 μL와 글리세롤의 39.8 g을 혼합하여 글리세롤 용액을 제조하고이 혼합물을 실험 채널을 채우고 현미경 스테이지에 배치 바이오 필름 샘플에 대하여 기술 된 바와 같이.
  2. 4 절에 표시된대로 자기 족집게를 설치 한 후, 5.4 절에 표시된대로 자기의 힘을 적용하고 보정 파일을 도출하기 위해 모세관에있는 각각의 단일 입자 속도 (V)와 위치를 추출하는 시​​간 경과 이미지를 확인합니다. 이 파일은 스톡스 법에 따라 모세 혈관의 분석 영역에서의 위치의 함수로 적용된 힘을 포함해야합니다, F = 6πRηv (R : 입자의 반경).

7. 분석

  1. 섹션 5에 나타낸 바와 같이 획득 된 영상의 모든 스택의 각 프레임에서 입자의 위치와 텍스트 파일을 구하는 "입자 추적"소프트웨어를 사용합니다.저기서g 화상 스택 포착 주파수는, 시간의 함수로서 입자 변위 (예를 들어도 5와 비디오 4)를 산출한다.
  2. 힘 교정 파일을 사용하여 준수 곡선을 변위 곡선 변환 (- J (t) - 재료의 총 준수를 시간의 함수로) 준수의 공식에 따라 :
    figure-protocol-1
    이는 재료 변형의 관계를 제공하고 이전 Schnurr 및 동료 (19)에 의해 제정 된대로 비압축성 균질 점탄성 매체에 매립 반경 R의 프로브 입자 스트레스를 적용 하였다.
  3. 점탄성 재료에 대한 일반 햄버거 모델에 크리프 컴플라이언스 곡선을 조정하고 점탄성 매개 변수, J 0을 도출, J 1, η 0, 각 입자에 대한 η 1 ( 그림 6) 버거 '공식에 따라 :
    figure-protocol-2
    참고 :이 현상 학적 분석은 이전과 같은 거시적 인 레올 로지 데이터에게 20-22를 해석하는 바이오 필름 ​​등의 생물학적 물질을 포함한 물질의 광범위한 사용되어왔다.

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결과

전형적인 분석은 원래의 배치를 방해하지 않고 생활 생물막에 미크론 스케일에서 점탄성 파라미터의 공간 분포를 제공 할 것이다. 탄성 컴플라이언스 - - 깊이와 함께 바이오 필름의 횡 방향 치수를 따라 Y 축, Z 축의 함수로서 주어진다 전형적인 결과는 J 0의 값을도 7에 나타낸다. 각 점은 크리프 곡선 분석은 J 0 값을 제공 한 구슬에 해당합니다. 데이터는 거의 3 크기 순서뿐만 아니라 그 강력한 측면 이질성을 통해 바이오 필름의 깊이에 따라 변화 지역을 준수 모든 바이오 필름의 높이에서 열렸다 것으로 나타났다.

데이터는 또한 바이오 필름의 기계적 특성이 지원되었는지 강한 표시를 제공하고, 여기에서 확산 및 비대칭 형상 (도 8)를 나타내 컴플라이언스 값의 분포에 액세스를 준높은 고분자 겔을 가교. 사실, 유사한 동작은 이전에 집중 높은 가교 말라 젤 23에

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토론

이 자성 입자는 파종 및 원래 상태에있는 성장하고있는 바이오 필름의 점탄성 매개 변수의 현장의 3D 매핑에 사용 실험을 당겨. 이 방법은 E.의 기계적 이질 밝혀 대장균 바이오 필름은 여기에서 성장 강하게 기본적인 세포 외 기질 (extracellular matrix)의 의미와 가교의 더 정확하게 그 정도를 제안, 바이오 필름 ​​물성을 지원하는 생물막 구성 요소를 지적하는 단서를 주었다.

세균 바이오 필름의 기계적 특성 패턴의 인식은 이러한 복잡한 물질의 포괄적 인 표현을 구축하기위한 매우 중요합니다. 이러한 연구 결과는 기계적인 패턴과 같은 바이오 필름 개발을 뒷받침하는 원동력을 명확히하는 데 도움이 유전자 발현 microniches, 생물 학적 이질성을 연결하는 인과 관계를 명확하게하는 방법을 엽니 다.

지금까지 바이오 필름 메카의 문제nical 속성보기의...

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공개 사항

우리는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

이 작품은 국립 회사 직원에서 교부금 라 공들인, PIRIbio 프로그램 Dynabiofilm와 CNRS 학제 간 리스크 프로그램에서 붓다가 지원하는 부분에 있었다. 우리는 E.를 제공하기 위해 원고와 크리스토프 Beloin의 비판적 읽기 필립 Thomen 감사합니다 이 연구에서 사용 된 대장균 균주.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Table 1: 시약 및
세포 자성 입자Life technologies14307DMicrometric magnetic particle, 2.8 µ m 직경
암피실린 (항생제)Sigma-AldrichA9518
테트라사이클린 (항생제)Sigma-Aldrich87128
박테리아 균주 MG1655gfpFUGB, Institut Pasteur, France암피실린 및 테트라사이클린에 내성이 있는 표면에서 F pili를 생성합니다.
Table 2 : < / strong> 소
아 관류 용Prodimed-Plastimed6932002
중공 광장 모세 혈금속 과학8280-100붕규산 유리로 제조. 정사각형 0.8 mm x 0.8 mm
튜빙 실리콘 퍼옥사이드VWR international228-0512직경 1 mm
튜빙 실리콘 퍼옥사이드VWR international228-0700직경 3 mm
Table 3: Biofilm growth
lysogeny Broth (LB) solutionAmresco-VWRJ106-10PK박테리아를 성장시키는 데 사용되는 표준 매체.
M63B1 솔루션박테리아를 성장시키는 데 사용되는
포도당Sigma-AldrichG8270포도당 0.4%로 M63B1 매체를 만드는 데 사용됩니다.
표 4: 전자
카메라 EMCCD   하마마츠C9100-02
히터 컨트롤러세계 정밀 기기300354
함수 발생기애질런트 기술33210A
전력 증폭기집에서 만든최대 4A의 진폭을 가진 전류 신호를 제공합니다.
주사기 펌프Kd ScientificKDS-220
셔터Vincent AssociatesUniblitz T132
자기 핀셋집에서 만든두 개의 전자기 극, 각각 직경 0.56mm 구리선의 2,120회 회전이 있는 구리 코일과 연자성 합금 코어(Supra50-Arcelor Mittal, 프랑스)는 <강>그림 10에 표시된 청사진에 따라 정사각형 모양입니다. 두 개의 코어는 모세관의 길이를 따라 한 방향으로 자기력을 생성하기 위해 남극을 향하도록 북극을 향하도록 장착됩니다. 그림 11에서 코일 배선에 대한 세부 정보를 참조하십시오.
표 5: 광학
도립 현미경 NikonTE-300
S Fluor x40 Objective (NA 0.9, WD0.3)Nikon이것은 생물막을 심층적으로 관찰할 수 있는 긴 작동 거리 대물렌즈입니다.
에피 형광 필터 : 1) 녹색 형광 : Exc 480 / 20 nm; DM 495; 엠 510/20  2) 적색 형광의 경우: Exc 540/25 nm; DM 565; Em 605/55Chroma1)#49020 2)#31002힘 적용 시 입자 변위는 적색 형광 필터 블록을 사용하여 기록됩니다.
Table 6: 이미지 분석
ImageJNIH - 입자 추적기 플러그인
모세 혈관 및 튜브 필터 관 복합 집에서 만든 표준 최소 배지.

참고문헌

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