방법 논문

천연 단백질에서 아밀로이드의 빠른 생성

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DOI:

10.3791/50869

⸱

2013년 12월 5일

 ,  , 
1Department of Immunology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

이 논문에서

요약

단백질은 네이티브 구조를 채택하거나 불용성 아밀로이드로 잘못 접힐 수 있습니다. 잘못 접히는 경로를 선호하는 조건은 다양한 유형의 아밀로이드 섬유의 형성으로 이어집니다. 여기에 설명된 방법을 사용하면 in vitro에서 네이티브 단백질을 아밀로이드로 빠르게 전환할 수 있습니다.

초록

단백질은 특정 3차원 주름에서 추출된 기능을 발휘하여 유기체에서 중요한 작업을 수행합니다. 폴리펩티드의 본래 구조는 많은 목적을 달성하지만, 이제 대부분의 단백질이 베타 시트가 풍부한 아밀로이드의 대체 어셈블리를 채택할 수 있다는 것이 인식되고 있습니다. 불용성 아밀로이드 피브릴은 처음에는 여러 인간 질병과 관련이 있지만, 점점 더 다양한 중요한 세포 과정에 참여하는 기능적 플레이어로 나타나고 있습니다. 또한 환자 조직에 침착된 아밀로이드에는 핵산 및 글리코사미노글리칸(GAG)과 같은 비단백질 성분이 포함되어 있습니다. 이러한 보조 인자는 아밀로이드의 형성을 촉진하여 다양한 유형의 불용성 침전물을 생성할 수 있습니다. 단백질이 용해성 아밀로이드 전구체의 중간 단계를 통해 어떻게 잘못 접히는지에 대한 이해를 활용하여, 우리는 체외에서 네이티브 단백질을 아밀로이드 원섬유로 전환하는 방법을 고안했습니다. 이 접근법을 사용하면 아밀로이드를 대량으로 준비하고, 특정 단백질에서 생성된 아밀로이드의 특성을 조사하고, 전환에 수반되는 구조적 변화를 평가할 수 있습니다.

서론

단백질은 모든 유형의 세포에 존재하는 가장 풍부한 생물학적 거대분자입니다. 그들은 매우 다양한 크기, 구조 및 번역 후 변형으로 발생하며 원래 형태로 매우 광범위한 중요한 생물학적 기능을 수행합니다. 20개 이상의 비정상적인 폴리펩티드는 알츠하이머병, 파킨슨병, 제2형 당뇨병1-4와 같은 수많은 인간 병리학적 상태와 관련이 있습니다. 잘못 접힌 말단 단백질은 세포 외 또는 세포 내에서 발생하는 불용성의 안정적인 응집체인 아밀로이드 섬유로 축적됩니다.

특정 질병에서 특정 단백질의 함의에도 불구하고, 모든 폴리펩티드가 아밀로이드 변형을 가능하게 하는 내재적 특성을 가지고 있다는 개념을 뒷받침하는 증거가 증가하고 있습니다. 게놈 전체 염기서열 조사에서 "아밀롬"이 확인되었으며, 아밀로이드가 발생하기 쉬운 단편은 E. coli에서 인간에 이르는 모든 코딩 펩타이드 세그먼트의 약 15%를 구성합니다5. 이에 따라 최근 몇 년 동안 다양한 중요한 세포 과정에 참여하는 기능성 아밀로이드의 수가 증가하고 있습니다. 예를 들어, 박테리아는 아밀로이드를 조립하여 생존과 발병에 중요한 생물막과 포자 구조를 형성합니다6-9. 펩타이드 호르몬은 방출되기 전에 포유류의 분비 과립 내에 저장되는 동안 아밀로이드 침전물을 형성하며, 이는 단백질 아밀로이드 형태가 유익한 생물학적 기능을 제공 할 수 있음을 의미합니다6 , 10 , 11 . 또한, 단백질은 중요한 세포 신호를 전달하기 위해 아밀로이드 섬유로 조립될 수도 있습니다12,13.

수년 동안 가장 많이 연구된 아밀로이드는 아밀로이드 베타 또는 프리온 펩타이드와 같은 인간 질병과 관련된 개별 펩타이드에서 제조되었습니다. 이러한 펩타이드는 일반적으로 잘 정의된 구조가 부족하고 시간이 지남에 따라 용액에서 자발적으로 아밀로이드를 형성하며, 이는 불용성 아밀로이드의 전구체 역할을 하는 부분적으로 잘못 접힌 중간체에 의해 매개되는 과정입니다. 아밀로이드의 전구체는 수용성 단백질 올리고머(soluble protein oligomer)라고도 하며, 이는 천연 펩타이드에서 생성될 때 드물고 불안정합니다14,15. 그러나 앞서 설명한 바와 같이 원칙적으로 거의 모든 단백질은 적절한 조건에서 아밀로이드 구조를 채택할 수 있습니다. 우리는 최근에 다양한 보조인자의 존재 하에서 쉽게 아밀로이드를 형성하는 천연 단백질의 안정화된 용해성 올리고머를 제조하는 방법을 확립했습니다16. 그 결과로 생성된 아밀로이드 섬유는 말단 단백질 잘못 접힌 응집체의 복잡한 특성을 반영합니다17,18. 여기서 우리는 보조 인자(cofactor)가 없는 단백질 원섬유를 지칭하기 위해 protein-only amyloid라는 용어를 사용하고, 비단백질 성분을 포함하는 fibrils를 지칭하기 위해 하이브리드 아밀로이드(hybrid amyloid)라는 용어를 사용합니다.

이전에는 고온, 소수성 환경 및 pH 변화19-23과 같이 단백질 잘못 접히는 것으로 알려진 조건을 적용하여 시험관에서 아밀로이드를 생성하는 다양한 방법이 개발되었습니다. 그러나 그들은 낮은 효율성, 가역 폴딩, 큰 배치 변동 또는 느린 역학과 같은 다양한 문제와 관련이 있습니다. 여기에 설명된 접근법은 재현 가능하고 확장이 쉬우며 아밀로이드 전환의 타이밍과 상태를 정확하게 제어할 수 있습니다.

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프로토콜

1. MES 버퍼 준비

  1. MES 완충액(0.1 M 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid 및 0.9 M NaCl)을 사용하여 단백질 전용 아밀로이드와 안정화된 용해성 단백질 올리고머를 모두 준비합니다. MES 1.95g과 NaCl 5.27g의 무게를 잰다. H2O를 추가하고 pH를 4.7로 조정합니다. 최종 부피를 100ml로 구성합니다. 4ºC에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.

2. 네이티브 단백질에서 직접 단백질 전용 아밀로이드 준비

  1. 선택한 단백질(모든 네이티브 단백질 또는 펩타이드)의 무게를 측정하고 MES 완충액에서 10mg/ml로 재구성합니다.
  2. 65ºC의 수조에서 4 시간 동안 배양하십시오. 기간이 끝날 무렵에는 용액에서 흰색 침전물이 보입니다.
  3. 샘플을 Tris-HCl(1M, pH 10.5) 10%(v/v)로 중화합니다.
  4. 투석 카세트의 단백질을 밤새 투석하여 추가 분석을 위해 원하는 완충액으로 교환합니다.
  5. 네이티브 단백질의 대조군 샘플은 열 침전 없이 2.1, 2.3 및 2.4 단계에 따라 준비할 수 있습니다(2.2 단계).

3. 네이티브 단백질의 안정화된 가용성 올리고머에서 하이브리드 아밀로이드 준비

  1. 안정화된 용해성 단백질 올리고머를 준비합니다.
    1. 선택한 단백질의 무게를 측정하고 MES 완충액에서 10mg/ml로 재구성합니다. 실온에서 15분 동안 그대로 두십시오.
    2. 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드 염산염(EDC)의 무게를 측정하고 MES 완충액에 20mg/ml의 신선한 재고를 준비합니다.
    3. 단백질과 EDC 용액을 2:5(v/v)의 비율, 즉 EDC 10mg당 단백질 2mg의 비율로 혼합합니다.
    4. 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
    5. 샘플을 Tris-HCl(1M, pH 10.5) 10%(v/v)로 중화합니다.
    6. 투석 카세트의 단백질을 밤새 투석하여 추가 분석을 위해 원하는 완충액으로 교환합니다.
    7. 안정화된 용해성 단백질 올리고머를 4ºC에서 최대 4주 동안 보관합니다.
  2. 안정화된 용해성 단백질 올리고머로부터 하이브리드 아밀로이드를 준비합니다.
    1. DNA 함유 아밀로이드를 제조하려면 DNA와 안정화된 용해성 단백질 올리고머를 1:1 비율(w/w)로 혼합합니다. 최소 2시간 동안 4ºC에서 그대로 두십시오. 이 기간 동안 초기 단백질 농도가 0.5mg/ml 이상일 때 용액에서 불용성 침전물을 볼 수 있습니다.
    2. RNA 함유 아밀로이드를 제조하려면 RNA와 안정화된 용해성 단백질 올리고머를 1:1 비율(w/w)로 혼합합니다. 최소 2시간 동안 4ºC에서 그대로 두십시오. 이 기간 동안 초기 단백질 농도가 0.5mg/ml 이상일 때 용액에서 불용성 침전물을 볼 수 있습니다.
    3. 헤파린 함유 아밀로이드를 제조하려면 헤파린과 안정화된 용해성 단백질 올리고머를 1:1 비율(w/w)로 혼합합니다. 최소 2시간 동안 4ºC에서 방치하십시오. 이 기간 동안 초기 단백질 농도가 0.5mg/ml 이상일 때 용액에서 불용성 침전물을 볼 수 있습니다.

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결과

천연 단백질을 아밀로이드로 직접 전환하는 능력은 MES 완충액 내 고온에서 발생하는 구조적 변화에 의존합니다. 용액 내의 침전은 단백질 응집 및 잠재적인 아밀로이드 형성의 좋은 지표가 됩니다. 반면, 수용성 단백질 올리고머를 안정화하기 위해 EDC를 사용하여 단백질을 가교 결합함으로써 MES 완충액에서 유도된 올리고머 구조를 고정합니다. 그 결과, 안정화된 단백질 올리고머는 멀티머 단백질이 되며(그림 1), SDS-PAGE로 분리했을 때 단량체 천연 단백질이나 열 유도 응집체와는 구별됩니다.

안정화된 가용성 단백질 올리고머는 용액 내에서 안정적이므로, 보조 인자에 의한 아밀로이드 전환을 원하는 방식으로 별도로 수행하여 완충액 조건, 단백질 대 보조 인자의 상대적 비율 또는 기타 매개변수를 조절할 수 있습니다. 올리고머에서 아밀로이드로의 전환 과정은 빠르게 일어나므로, 핵산 또는 GAG와 혼합한 후 수 분 내에 불용성 침전물이 형성되더라도 이는 자연스...

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토론

여기에 설명된 방법은 거의 모든 단백질 또는 펩타이드로부터 시험관 내에서 아밀로이드 원섬유를 제조하는 신속하고 유연한 수단을 제공합니다. 단백질 전용 원섬유 또는 DNA, RNA 또는 글리코사미노글리칸을 포함하는 하이브리드 응집체 등 여러 가지 유형의 아밀로이드를 안정적으로 준비할 수 있습니다. 관련된 절차는 간단하고 간단하며 고급 기술 교육이 필요하지 않습니다. 이 방법으로 제조된 아밀로이드는 매우 안정적이며 4ºC에서 안전하게 보관하거나 -80ºC에서 장기간 냉동할 수 있습니다.

아밀로이드 및 아밀로이드 전구체의 성공적인 생성을 보장하는 가장 중요한 요소 중 하나는 MES 완충액의 적절한 산도입니다. 우리의 경험에 따르면 pH 범위가 3-5.5인 MES 완충액은 아밀로이드 및 아밀로이드 전구체의 성공적이고 재현 가능한 제조를 제공합니다. pH 6.5에서는 아밀로이드 전구체를 생성하는 효율이 크게 감소합니다. 이것은 다른 이전 보고서의 결과와 일치합니다 - 트리...

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공개 사항

우리는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 보조금 AI074809 및 텍사스 대학교 MD 앤더슨 암 센터 기관 연구 보조금 프로그램(University of Texas M. D. Anderson Cancer Center Institutional Research Grant Program)의 W.C. 보조금으로 지원됩니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(MES)시그마-알드리치M8250
NaCl피셔BP358-10
1-에틸-3-[3-디메틸-아미노프로필] 카르보디이미드 염산염(EDC)열/피어스22980
연어 정자의 DNA시그마D1626
토룰라 효모의 RNA시그마R6625
돼지 장 점막의 헤파린SigmaH3149
Tris baseFisherBP152-1
장비:
수조Fisher ScienceIsotemp 210
Slide-A-Lyzer 투석 카세트Thermo/Pierce66380

참고문헌

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