NF-κB에 의존하는 성인의 해마 신경의 조작 및 분석을위한 방법이 설명되어 있습니다. 자세한 프로토콜은 마우스의인지 결과의 조사를 위해 치아 이랑 (dentate gyrus)에 의존하는 행동 테스트 (공간 패턴 분리 - 바네스의 미로라고합니다)에 제공된다. 이 기술은 또한 다른 실험 설정에서 조사를 활성화하는 데 도움이됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
해마는 일시적인 기억의 형성 및 통합에 중요한 역할을하며, 공간 방향. 역사적으로, 성인의 해마가 포유 동물 뇌의 매우 정적 인 해부학 적 영역으로 조회되었습니다. 그러나, 최근의 연구 결과는 해마의 치아 이랑은 기존의 연결 회로의 수정뿐만 아니라, 성인 신경뿐만 아니라 포함, 성인의 엄청난 가소성의 영역임을 증명하고있다. 이 소성은 전사 인자 NF-κB가 중요한 역할을 담당하는, 전사 복잡한 네트워크에 의해 조절된다. 성인 신경, NF-κB 활성의 전뇌 특정 신경 세포의 억제를위한 형질 전환 마우스 모델을 사용할 수를 연구하고 조작 할 수 있습니다.
본 연구 방법은 구조적 측면, 신경 세포의 사멸 및 전구 확산,인지 의미, whic 포함하여 NF-κB에 의존하는 신경의 분석에 대해 설명합니다H는 특히 치아 이랑 (DG)에 의존하는 행동 테스트, 공간 패턴 분리 - 반스 미로 (SPS-BM)을 통해 평가되었다. SPS-BM 프로토콜은 단순히 성인 해마 신경의 특정 유전자의 영향을 평가하기 위해 설계된 다른 트랜스 제닉 동물 모델에 사용하기 위해 적응 될 수있다. 또한, SPS-BM는 약리학 제제를 사용하여, 예를 들면, DG 의존 학습을 조사하고 조작 겨냥한 다른 실험 설정에서 사용될 수있다.
서론
론적, 해마는 알려진 가장 오래된 해부 뇌 구조의 하나이다. 그런 장기 기억, 공간 방향, 및 각각의 메모리 형성 및 통합의 조절에 중추적 인 기능 등 다양한 복잡한 태스크를 책임진다. 해부학, 해마는 subgranular 영역 내에서 과립 세포와 약간의 신경 전구 세포를 포함하는 뿔 Ammonis (CA1, CA2, CA3 및 CA4) 지역과 치아 이랑 (dentate gyrus) (이랑 dentatus), 등의 피라미드 세포 층 (지층 pyramidale)로 구성 . 과립 세포는 소위 이끼 섬유 (과립 세포의 축삭)를 통해 CA3 영역을 향해 돌출.
지난 세기 말까지, 성인 포유류의 뇌 세포의 가소성과 신경을 결여 정적 인 기관이 될 것으로 추정했다. 그러나 지난 20 년간, 기록의 성장 양이 명확하게 일어나고 성인 신경을 보여줍니다 이상두 뇌 영역, subventricular 영역 (SVZ) 및 해마의 subgranular 영역.
우리의 이전 연구와 다른 그룹의 사람들은 전사 인자 NF-κB가 성인 신경의 중요한 분자 규제 중 하나이며, 심각한 구조적 해마 결함과인지 장애 1-6에서의 규제 완화의 결과가 있다는 것을 보여 주었다. ....
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프로토콜
윤리 문
본 연구는 정부의 동물 및 관리에 사용위원회, 국가 노스 라인 - 웨스트 팔리 아, (뒤셀도르프, 독일)의 LANUV의 규정에 따라 실시 하였다. 모든 동물 실험은 라이센스 번호 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW)에서 LANUV, 뒤셀도르프에 의해 승인되었다. 모든 노력이 조난 및 연구에 필요한 동물의 수를 최소화하도록 하였다.
1. 동물 관리 및 주택
- 연맹 유럽 실험 동물 과학 협회 (FELASA)에 의해 정의 된 명세서에 기술 된 프로토콜에 사용 된 모든 동물은 무균 상태에서 보관해야합니다.
- HEPA 공기 여과와 마우스는 낮의 조건 (12 시간 빛 / 어둠주기)에 따라 온도와 습도 조절 (22 ° C) 방에 표준 케이지에 보관해야합니다.
- 표준화 된 음식과 물을 임의로 제공한다.
- IκB / TTA 및 IκB는 / IF - 대조군 마우스가 사용되는 7, 18에서 설명한 바와 같이, PCR-기반의 유전형은 각 동물에 대해 수행되어야한다.
- 이하 사일의 나이 차이 말레 동물은 개별 변동을 줄이기 위해 사용되는 것이다.
- (....
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결과
IκB /의 교배 - 그리고 TTA 유전자 변형 마우스 라인은 해마에서 NF-κB 활성의 조건 억제에 이르게한다.
이중 형질 전환 마우스 (그림 1A)에서 IκBα-AA1-유전자의 발현을 조사하기 위해, 뇌 절연, 저온 절단 및 GFP (녹색 형광 단백질)에 대한 항체를 사용하여 염색 하였다. 공 초점 레이저 주사 현미경은 CA1과 CA3 지역에서 유전자의 고 발현을 공개하고, DG (그림 1B).
IκBα-AA1-유전자는 유형-2B 전구 세포로 표현하고, 중간 미성숙 한 상태에서 성숙한 과립 세포에서 활성화되어 있습니다.
해마 신경 인성 영역에서 CAMKIIα 중심 IκBα-AA1을 표현하는 최초의 세포 유형을 확인하려면, IκB / TTA 동물에서 해마의 저온부는 doublecortin에 .......
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토론
성인 신경, 독시 싸이클린을 통해 신경 세포에서 NF-κB의 억제, 그 이후 재 활성화를 통해 그 조작의 가능성은 성인 뇌뿐만 아니라 신경 드 다시 세대에 신생아 뉴런에 수사 매혹적인 시스템을 제공합니다 . 이 시스템의 장점은 그 신경 세포의 죽음, 조상의 증식과 이동, 심각한 구조 및 해부학 적 변화뿐만 아니라, 명백한 학습 결함의 변화에 신경 결과뿐만 아니라에서 NF-κB 신호 전달 경로를 억제. 중요한 것은, IκB / TTA 동물의 표현형은 실험적으로 반전 독시사이클린의 투여 후 구조 될 수 있습니다. 표현형이 복귀 구조적 측면을 포함하고, 또한 DG 의존 2 학습에 상당한 개선으로 이어질 수 있습니다.
행동 실험에 대한 해석 결과를 보장하기 위해, 그것은 중요합니다 그 나이의 다른 작풍 만 수컷이하 4 일 이상의 후부가 사용 될 수있다. 또한, 모든 테스트는 일련의 동일한 오퍼레이터에 의해 수행되어야한다. 시험 장소에 관해서는, 우리는 강력하게.......
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공개 사항
저자는 이익에 대한 갈등이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
우리는 우수한 기술 지원 안젤라 Kralemann - 쾰러 감사합니다. 여기에 기술 된 실험 연구는 실험실에서 수행되었으며, CK 및 BK와 BK에 대한 연구 및 교육의 독일 교육부 (BMBF)의 부여에 독일 연구 협회 (DFG)의 보조금에 의해 지원되었다.
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재료
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| Moria MC17 퍼포레이티드 스푼 | FST | 10370-18 | 뇌 제거 |
| 해부 현미경 | Carl Zeiss | Stemi SV8 | 뇌 제거 |
| 수술용 가위 | FST | 14084-08 | 뇌 제거 |
| 수술 용 가위 | FST | 14381-43 | 뇌 제거 |
| Dumont #5 겸자 | FST | 11254-20 | 뇌 제거 |
| SuperFrost 슬라이드 | Carl Roth | 1879 | 면역조직화학을 위한 슬라이드 |
| 파라포름알데히드 | Sigma-Aldrich | P6148 | 고정액 |
| TissueTek OCT 화합물 | Sakura Finetek 1004200018 | 뇌 매립 | |
| Normal Goat Serum | Jackson Immunolabs | 005-000-001 | IHC 차단 |
| Normal Rabbit Serum | Jackson Immunolabs | 011-000-001 | IHC |
| Normal Donkey Serum | Jackson Immunolabs | 017-000-001 | IHC |
| 차단 anti-Neurofilament-M 항체 | 발달 연구 Hybridoma Bank | 2H3 | IHC, 희석 1:200 |
| 안티-더블코르틴 항체 | sc-8066 | Santa Cruz | IHC, 희석 1:800 |
| 항-GFP 항체 | Abcam | ab290 | IHC, 희석 1:2,000 |
| 항-BrdU 항체 | OBT0030G | 정확한 화학물질 | IHC, 희석 1:2,000 |
| Fluoro-Jade C | FJ-C | HistoChem | 신경 세포 사멸 |
| 측정 Betadine | Mundipharma | D08AG02 | 소독제 |
| Cryomicrotome | Leica | CM1900 | 뇌 절편 준비 |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3393 | 관류 |
| 경질 플라스틱으로 만든 원형 플레이트 (직경 120cm) | 실험실 제작 | SPS-BM용 무판, 지름 120cm | |
| Buraton 빠른 소독제 | 슈ü lke Mayr | 113 911 | 소독제 |
| 비디오 추적 시스템 TSE VideoMot 2 소프트웨어 패키지 포함 VideoMot2 | TSE 시스템 | 302050-SW-KIT | SPS-BM |
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| Cryotome | Reichert Jung/Leica | Frigomobil 1206 | 40 µ 준비; m brain slices |
| Mowiol 4-88 | Carl Roth | Art.-Nr. 0713 | 슬라이드 임베딩 |
| SYTOX green | Invitrogen | S7020 | 핵 염색 |
| 식품 펠릿 (Kellog's Froot Loops) | Kellog's | SPS-BM | |
| Prism, Version 3.0 | Graph Pad Software, San Diego, USA | SPS-BM | |
| Zen 2008 또는 Zen 2011 소프트웨어의 | Carl Zeiss | 소프트웨어 (컨포칼 현미경) | |
| D.P.X | Sigma-Aldrich | 317616 | Fluoro-Jade C 염색용 마운팅 매체 |
참고문헌
- Gutierrez, H., Davies, A. M. Regulation of neural process growth, elaboration and structural plasticity by NF-kappaB. Trends Neurosci. 34, 316-325 (2011).
- Imielski, Y., et al. Regrowing the adult brai....
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