방법 논문

NF-κB에 의존하는 성인 신경 발생의 변조 및 분석을위한 방법

DOI:

10.3791/50870

⸱

2014년 2월 13일

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1Cell Biology, University of Bielefeld, 2Molecular Neurobiology, University of Bielefeld

이 논문에서

요약

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NF-κB에 의존하는 성인의 해마 신경의 조작 및 분석을위한 방법이 설명되어 있습니다. 자세한 프로토콜은 마우스의인지 결과의 조사를 위해 치아 이랑 (dentate gyrus)에 의존하는 행동 테스트 (공간 패턴 분리 - 바네스의 미로라고합니다)에 제공된다. 이 기술은 또한 다른 실험 설정에서 조사를 활성화하는 데 도움이됩니다.

초록

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해마는 일시적인 기억의 형성 및 통합에 중요한 역할을하며, 공간 방향. 역사적으로, 성인의 해마가 포유 동물 뇌의 매우 정적 인 해부학 적 영역으로 조회되었습니다. 그러나, 최근의 연구 결과는 해마의 치아 이랑은 기존의 연결 회로의 수정뿐만 아니라, 성인 신경뿐만 아니라 포함, 성인의 엄청난 가소성의 영역임을 증명하고있다. 이 소성은 전사 인자 NF-κB가 중요한 역할을 담당하는, 전사 복잡한 네트워크에 의해 조절된다. 성인 신경, NF-κB 활성의 전뇌 특정 신경 세포의 억제를위한 형질 전환 마우스 모델을 사용할 수를 연구하고 조작 할 수 있습니다.

본 연구 방법은 구조적 측면, 신경 세포의 사멸 및 전구 확산,인지 의미, whic 포함하여 NF-κB에 의존하는 신경의 분석에 대해 설명합니다H는 특히 치아 이랑 (DG)에 의존하는 행동 테스트, 공간 패턴 분리 - 반스 미로 (SPS-BM)을 통해 평가되었다. SPS-BM 프로토콜은 단순히 성인 해마 신경의 특정 유전자의 영향을 평가하기 위해 설계된 다른 트랜스 제닉 동물 모델에 사용하기 위해 적응 될 수있다. 또한, SPS-BM는 약리학 제제를 사용하여, 예를 들면, DG 의존 학습을 조사하고 조작 겨냥한 다른 실험 설정에서 사용될 수있다.

서론

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론적, 해마는 알려진 가장 오래된 해부 뇌 구조의 하나이다. 그런 장기 기억, 공간 방향, 및 각각의 메모리 형성 및 통합의 조절에 중추적 인 기능 등 다양한 복잡한 태스크를 책임진다. 해부학, 해마는 subgranular 영역 내에서 과립 세포와 약간의 신경 전구 세포를 포함하는 뿔 Ammonis (CA1, CA2, CA3 및 CA4) 지역과 치아 이랑 (dentate gyrus) (이랑 dentatus), 등의 피라미드 세포 층 (지층 pyramidale)로 구성 . 과립 세포는 소위 이끼 섬유 (과립 세포의 축삭)를 통해 CA3 영역을 향해 돌출.

지난 세기 말까지, 성인 포유류의 뇌 세포의 가소성과 신경을 결여 정적 인 기관이 될 것으로 추정했다. 그러나 지난 20 년간, 기록의 성장 양이 명확하게 일어나고 성인 신경을 보여줍니다 이상두 뇌 영역, subventricular 영역 (SVZ) 및 해마의 subgranular 영역.

우리의 이전 연구와 다른 그룹의 사람들은 전사 인자 NF-κB가 성인 신경의 중요한 분자 규제 중 하나이며, 심각한 구조적 해마 결함과인지 장애 1-6에서의 규제 완화의 결과가 있다는 것을 보여 주었다. ....

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프로토콜

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윤리 문

본 연구는 정부의 동물 및 관리에 사용위원회, 국가 노스 라인 - 웨스트 팔리 아, (뒤셀도르프, 독일)의 LANUV의 규정에 따라 실시 하였다. 모든 동물 실험은 라이센스 번호 8.87-51.04.20.09.317 (LANUV, NRW)에서 LANUV, 뒤셀도르프에 의해 승인되었다. 모든 노력이 조난 및 연구에 필요한 동물의 수를 최소화하도록 하였다.

1. 동물 관리 및 주택

  1. 연맹 유럽 실험 동물 과학 협회 (FELASA)에 의해 정의 된 명세서에 기술 된 프로토콜에 사용 된 모든 동물은 무균 상태에서 보관해야합니다.
  2. HEPA 공기 여과와 마우스는 낮의 조건 (12 시간 빛 / 어둠주기)에 따라 온도와 습도 조절 (22 ° C) 방에 표준 케이지에 보관해야합니다.
  3. 표준화 된 음식과 물을 임의로 제공한다.
  4. IκB / TTA 및 IκB는 / IF - 대조군 마우스가 사용되는 7, 18에서 설명한 바와 같이, PCR-기반의 유전형은 각 동물에 대해 수행되어야한다.
  5. 이하 사일의 나이 차이 말레 동물은 개별 변동을 줄이기 위해 사용되는 것이다.
  6. (....

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결과

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IκB /의 교배 - 그리고 TTA 유전자 변형 마우스 라인은 해마에서 NF-κB 활성의 조건 억제에 이르게한다.

이중 형질 전환 마우스 (그림 1A)에서 IκBα-AA1-유전자의 발현을 조사하기 위해, 뇌 절연, 저온 절단 및 GFP (녹색 형광 단백질)에 대한 항체를 사용하여 염색 하였다. 공 초점 레이저 주사 현미경은 CA1과 CA3 지역에서 유전자의 고 발현을 공개하고, DG (그림 1B).

IκBα-AA1-유전자는 유형-2B 전구 세포로 표현하고, 중간 미성숙 한 상태에서 성숙한 과립 세포에서 활성화되어 있습니다.
해마 신경 인성 영역에서 CAMKIIα 중심 IκBα-AA1을 표현하는 최초의 세포 유형을 확인하려면, IκB / TTA 동물에서 해마의 저온부는 doublecortin에 염색.......

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토론

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성인 신경, 독시 싸이클린을 통해 신경 세포에서 NF-κB의 억제, 그 이후 재 활성화를 통해 그 조작의 가능성은 성인 뇌뿐만 아니라 신경 드 다시 세대에 신생아 뉴런에 수사 매혹적인 시스템을 제공합니다 . 이 시스템의 장점은 그 신경 세포의 죽음, 조상의 증식과 이동, 심각한 구조 및 해부학 적 변화뿐만 아니라, 명백한 학습 결함의 변화에​​ 신경 결과뿐만 아니라에서 NF-κB 신호 전달 경로를 억제. 중요한 것은, IκB / TTA 동물의 표현형은 실험적으로 반전 독시사이클린의 투여 후 구조 될 수 있습니다. 표현형이 복귀 구조적 측면을 포함하고, 또한 DG 의존 2 학습에 상당한 개선으로 이어질 수 있습니다.

행동 실험에 대한 해석 결과를 보장하기 위해, 그것은 중요합니다 그 나이의 다른 작풍 만 수컷이하 4 일 이상의 후부가 사용 될 수있다. 또한, 모든 테스트는 일련의 동일한 오퍼레이터에 의해 수행되어야한다. 시험 장소에 관해서는, 우리는 강력하게.......

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공개 사항

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저자는 이익에 대한 갈등이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

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우리는 우수한 기술 지원 안젤라 Kralemann - 쾰러 감사합니다. 여기에 기술 된 실험 연구는 실험실에서 수행되었으며, CK 및 BK와 BK에 대한 연구 및 교육의 독일 교육부 (BMBF)의 부여에 독일 연구 협회 (DFG)의 보조금에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Moria MC17 퍼포레이티드 스푼 FST10370-18뇌 제거
해부 현미경Carl ZeissStemi SV8뇌 제거
수술용 가위 FST14084-08뇌 제거
수술 용 가위 FST14381-43뇌 제거
Dumont #5 겸자FST11254-20뇌 제거
SuperFrost 슬라이드Carl Roth1879면역조직화학을 위한 슬라이드
파라포름알데히드Sigma-AldrichP6148고정액
TissueTek OCT 화합물Sakura Finetek 1004200018뇌 매립
Normal Goat SerumJackson Immunolabs005-000-001IHC 차단
Normal Rabbit SerumJackson Immunolabs011-000-001IHC
Normal Donkey SerumJackson Immunolabs017-000-001IHC
차단 anti-Neurofilament-M 항체발달 연구 Hybridoma Bank2H3IHC, 희석 1:200
안티-더블코르틴  항체sc-8066Santa CruzIHC, 희석 1:800
항-GFP 항체Abcamab290IHC, 희석 1:2,000
항-BrdU 항체OBT0030G정확한 화학물질IHC, 희석 1:2,000 
Fluoro-Jade CFJ-CHistoChem신경 세포 사멸
측정 BetadineMundipharmaD08AG02소독제
CryomicrotomeLeicaCM1900뇌 절편 준비
Heparin sodium saltSigma-AldrichH3393관류
경질 플라스틱으로 만든 원형 플레이트 (직경 120cm)실험실 제작SPS-BM용 무판, 지름 120cm
Buraton 빠른 소독제 슈ü lke Mayr113 911소독제
비디오 추적 시스템 TSE VideoMot 2 소프트웨어 패키지 포함 VideoMot2TSE 시스템302050-SW-KITSPS-BM
Triton X-100의 추적 및 분석 Sigma AldrichT8787투과성화/IHC
CryotomeReichert Jung/LeicaFrigomobil 120640 µ 준비; m brain slices
Mowiol 4-88Carl RothArt.-Nr. 0713슬라이드 임베딩
SYTOX greenInvitrogenS7020핵 염색
식품 펠릿 (Kellog's Froot Loops)Kellog'sSPS-BM
Prism, Version 3.0Graph Pad Software, San Diego, USASPS-BM
Zen 2008 또는 Zen 2011 소프트웨어의Carl Zeiss소프트웨어 (컨포칼 현미경)
D.P.XSigma-Aldrich317616Fluoro-Jade C 염색용 마운팅 매체
, , 통계적 평가

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gutierrez, H., Davies, A. M. Regulation of neural process growth, elaboration and structural plasticity by NF-kappaB. Trends Neurosci. 34, 316-325 (2011).
  2. Imielski, Y., et al. Regrowing the adult brai....

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NF kappa BAdult NeurogenesisSpatial Pattern SeparationBarnes MazeConfocal MicroscopyHistological AnalysisTransgenic MiceDentate GyrusBehavioral TestingImmunofluorescence Staining

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