의 NMR 공명 확인하는 방법<sup&gt; 13</sup환원 메틸을 단백질에&gt; C-디메틸 N-말단 아민

요약

환원적으로 ¹³C- 메틸화 된 N- 말단 라이신의 α- 및 ε- 디메틸 아민 핵 자기 공명 신호를 할당하는 두 가지 방법이 설명됩니다. 한 가지 방법은 환원성 메틸화 반응의 pH 유도 선택성을 활용하고, 다른 방법은 아미노펩티다아제를 사용하여 N 말단 라이신을 선택적으로 제거합니다.

초록

핵 자기 공명 (NMR) 분광법은 단백질 구조 및 동적 연구 입증 된 기술이다. NMR로 단백질을 연구하기 위해, 안정적인 자기 동위 원소는 일반적으로 감도를 개선하고 순차적 공명 할당을 허용 대사 포함된다. 환원 ¹³ C-메틸화를 통해 표현 박테리아 숙주, 동위 원소 결합하는 가장 일반적인 방법에 순종하지 않는 단백질에 대한 대체 표시 방법입니다. 환원성 ¹³ C-메틸화는 ¹³ C-디메틸 아미노 그룹으로의 단백질의 일차 아미노기 (라이신의 ε-아미노기와 N-말단 α-아미노기를) 수정 온화한 조건 하에서 수행 화학 반응이다. 대부분의 단백질의 구조와 기능은 그 대사 라벨링에 대한 실행 가능한 대안 만들기, 수정에 의해 변경되지 않습니다. 환원 ¹³ C-메틸화는 스파 스, 동위 원소 라벨, N을 할당하는 전통적인 방법을 추가하기 때문에MR 신호는 적용되지 않습니다. 단백질 ⁽¹³⁾ C-디메틸 NMR 신호의 할당을 돕기 위해 질량 분석기 (MS)를 사용하여 대안의 할당 방법이 개발되었다. 이 방법은 각각의 차 아미노기에 ¹³ C-라벨의 부분과 다른 양에 의존한다. Lys1의 α-및 ε-다이 메틸 아미노 그룹이 개별적으로 MS로 측정 할 수 없기 때문에, 단백질의 N-말단 잔기가 리신 때 방법의 제한이 발생한다. 이 한계를 회피하기 위해,이 방법은 N-말단 α-아민 및 측쇄 ε-아민 모두와 연관된 ¹³ C-NMR dimethylamines의 공진을 식별하는 기술된다. N-말단 α-디메틸 아민과 암탉 흰자 리소자임, Lys1의 사이드 체인 ε-디메틸 아민의 NMR 신호는 ^{1 H-13} C 헤테로 핵 단일 양자 간섭 스펙트럼에서 확인된다.

서론

핵자기공명(NMR) 분광법은 단백질에 대한 귀중한 구조 규명 도구입니다¹. NMR 분광법은 네이티브 상태에서 단백질의 용액 구조를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 안정한 자기 동위원소의 낮은 자연적 풍부함을 극복하기 위해서는 ¹³C 및 ¹⁵N을 관심 단백질에 통합해야 합니다. 가장 일반적으로 사용되는 방법은 박테리아 숙주에서 재조합 발현입니다^2-3. 그러나 박테리아 숙주 과발현의 두 가지 단점은 번역 후 변형을 일으킬 수 없고 모든 단백질^3-4에 작용하지 않는다는 것입니다. 박테리아 발현이 단백질 생산에 실행 가능한 경로가 아닌 경우 비박테리아 숙주에서 과발현을 사용할 수 있지만 동위원소 표지는 어렵고 비용이 많이 듭니다⁵. NMR 분석을 위해 ^13C및 ^15N동위원소를 단백질에 통합하기 위한 대체 발현 방법에는 메틸 표지⁶ 및 단일 ^13C, ^15N아미노산^7-9를 위한 대사 전구체를 사용하는 희소 표지 기술이 포함됩니다. 본원에 사용된 희소 표지에 대한 화학적 접근법은 잘 확립된 환원성 ¹³C-메틸화 반응(그림 1

프로토콜

1. 라이소자임의 환원적 메틸화

1. pH 7.5에서 50mM 인산나트륨 완충액 500ml를 준비합니다. 실온에서 보관하십시오.
2. 완전 라벨링된 샘플(FLS), 낮은 pH 부분 라벨링 샘플(LpH) 및 높은 pH 부분 라벨링 샘플(HpH)에 대해 3개의 1ml 마이크로 원심분리 튜브에 라벨을 부착합니다.
3. 라이소자임 10mg의 무게를 측정하고 인산나트륨 완충액 2ml에 용해시켜 5mg/ml 농도의 수용액을 만듭니다. 포름알데히드가 빛 노출로 인한 분해로부터 보호되도록 알루미늄 호일로 튜브를 덮습니다. 각 튜브에 500μl의 라이소자임 용액을 추가합니다.
4. 디메틸아민 보란 복합체(DMAB)와 ^13C-포름알데히드의 신선한 1.0M 용액을 준비합니다. 0 °C에서 보관하십시오.
5. 완전히 라벨링된 샘플의 경우 1:10(반응성 아민: 포름알데히드)의 몰비를 사용하고 부분적으로 라벨링된 샘플의 경우 1:5 비율을 사용합니다. 또는 비율을 최적화할 수 있습니다. 예를 들어, 낮은 pH에서 ^α-13C-디메틸아민 피크의 우세를 확인하기 위해서는 2:7 비율이 필요했습니다.
6. FLS에 6.1μl의 1.0M DMAB를 첨가하고 LpH 및 HpH에 3.2μl의 1.0M DMAB를....

결과

환원적 메틸화 및 pH

리소자임에서 pH 유도 화학 선택적 환원적 ¹³C-메틸화 반응이 입증되었습니다. 낮은 pH에서 반응은 측쇄 ε-아민보다 N-말단 α-아민을 선호하며, 높은 pH에서는 그 반대가 됩니다. 용액 내에서 단백질의 아미노기는 유리 아민과 짝산 사이의 평형 상태로 존재하며, 이는 pH로 조절 가능합니다. 이 반응의 최적 pH 범위는 사용되는 환원제에 따라 다릅니다. 이 경우, 디메틸아민 보란의 최적 pH는 7.0-9.0입니다. 환원제의 최적 범위를 벗어나 작업하면 반응 효율이 떨어지는데, 이는 본 실험에서는 오히려 장점이 됩니다. 환원적 메틸화 반응은 α-아민의 산 해리 상수(pK_a)가 (~7)²³로 ε-아민(~10)³²보다 낮기 때문에 pH 6.0에서 우선적으로 N-말단 α-아민을 변형시킵니다. pH 6.0에서 평형은 짝산 쪽으로 급격히 치우치며, α-아민이 .......

토론

환원적으로 ¹³개의 C-메틸화 단백질의 NMR 신호를 할당하는 것은 이 동위원소 표지 방법을 완전히 활용하는 데 필요합니다. 부분 ¹³C-혼입 데이터의 상관 관계를 통해 NMR 신호 할당을 돕기 위해 MS를 사용하는 것은 유망한 기술입니다. 다른 할당 방법에 비해 이 기술의 장점은 1차 아미노산 서열만 필요하다는 것입니다. α-디메틸아민과 ε-디메틸아민의 ^13C-혼입은 MS로 별도로 측정할 수 없기 때문에 N-말단 아미노산이 라이신일 때 MS 보조 할당 방법이 제한됩니다. 적정 실험은 일반적으로 α-디메틸아민 화학적 이동의 pH 의존성을 보여주지만 염교 및 기타 구조적 기여로 인해 화학적 이동은 신뢰할 수 없는 할당 방법입니다. 제시된 방법을 사용하면 이 문제를 해결할 뿐만 아니라 MS로 α- 및 ε-디메틸아미노 펩타이드에 대한 개별 ^13C% 혼입을 측정하는 문제를 피할 수 있습니다. 하나의 부위에 라벨이 붙어 있기 때문에 ^1.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아세토니트릴	시그마	34851
아미콘 울트라 4ml 원심 필터(3k MWCO)	피셔 사이언티픽	UFC800308(8pk)
아미노펩티다아제	크리에이티브 바이오마트	아미노펩티다제-86A
중탄산암모	시그마	A6141
황산암모늄	시그마	A5132
보란-디메틸아민 복합체	시그마	180238	사용하기 전에 1M 용액을 새로 만드십시오.
붕산	Sigma	B6768
소 췌장 인슐린	Sigma	I5500
C18 스핀 컬럼	Thermo Scientific	89870
중수소산화물	Cambridge Isotope Laboratories	DLM-4-100
1,2-dichloroethane-13C2	Sigma	714321	-80°C에서 저장된 80mM 원액. 24mM에서 NMR 스펙트럼에서 참조로 사용됩니다.
포름알데히드(36.5% wt/wt)	Sigma	33220	사용하기 전에 1M 용액을 새로 만드십시오.
13C-포름알데히드 (99%)	Cambridge Isotope Laboratories	CLM-806-1	사용하기 전에 1M 용액을 새로 만드십시오.
라이소자임(암탉 달걀 흰자)	Sigma	L6376
인산나트륨(이염기성 헵타하이드레이트)	Sigma	S9390
인산나트륨(일염기)	Sigma	S9638
트리신	시그마	T0377
트리플루오로아세트산	시그마	302031
700MHz Varian VNMRS, 5mm HCN 5922 프로브	애질런트 기술
Bruker UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF	Bruker

늄 ,