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방법 논문

의 NMR 공명 확인하는 방법

5.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50875

⸱

2013년 12월 12일

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Louisiana State University

이 논문에서

요약

환원적으로 13C- 메틸화 된 N- 말단 라이신의 α- 및 ε- 디메틸 아민 핵 자기 공명 신호를 할당하는 두 가지 방법이 설명됩니다. 한 가지 방법은 환원성 메틸화 반응의 pH 유도 선택성을 활용하고, 다른 방법은 아미노펩티다아제를 사용하여 N 말단 라이신을 선택적으로 제거합니다.

초록

핵 자기 공명 (NMR) 분광법은 단백질 구조 및 동적 연구 입증 된 기술이다. NMR로 단백질을 연구하기 위해, 안정적인 자기 동위 원소는 일반적으로 감도를 개선하고 순차적 공명 할당을 허용 대사 포함된다. 환원 13 C-메틸화를 통해 표현 박테리아 숙주, 동위 원소 결합하는 가장 일반적인 방법에 순종하지 않는 단백질에 대한 대체 표시 방법입니다. 환원성 13 C-메틸화는 13 C-디메틸 아미노 그룹으로의 단백질의 일차 아미노기 (라이신의 ε-아미노기와 N-말단 α-아미노기를) 수정 온화한 조건 하에서 수행 화학 반응이다. 대부분의 단백질의 구조와 기능은 그 대사 라벨링에 대한 실행 가능한 대안 만들기, 수정에 의해 변경되지 않습니다. 환원 13 C-메틸화는 스파 스, 동위 원소 라벨, N을 할당하는 전통적인 방법을 추가하기 때문에MR 신호는 적용되지 않습니다. 단백질 (13) C-디메틸 NMR 신호의 할당을 돕기 위해 질량 분석기 (MS)를 사용하여 대안의 할당 방법이 개발되었다. 이 방법은 각각의 차 아미노기에 13 C-라벨의 부분과 다른 양에 의존한다. Lys1의 α-및 ε-다이 메틸 아미노 그룹이 개별적으로 MS로 측정 할 수 없기 때문에, 단백질의 N-말단 잔기가 리신 때 방법의 제한이 발생한다. 이 한계를 회피하기 위해,이 방법은 N-말단 α-아민 및 측쇄 ε-아민 모두와 연관된 13 C-NMR dimethylamines의 공진을 식별하는 기술된다. N-말단 α-디메틸 아민과 암탉 흰자 리소자임, Lys1의 사이드 체인 ε-디메틸 아민의 NMR 신호는 1 H-13 C 헤테로 핵 단일 양자 간섭 스펙트럼에서 확인된다.

서론

핵자기공명(NMR) 분광법은 단백질에 대한 귀중한 구조 규명 도구입니다1. NMR 분광법은 네이티브 상태에서 단백질의 용액 구조를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 안정한 자기 동위원소의 낮은 자연적 풍부함을 극복하기 위해서는 13C 및 15N을 관심 단백질에 통합해야 합니다. 가장 일반적으로 사용되는 방법은 박테리아 숙주에서 재조합 발현입니다2-3. 그러나 박테리아 숙주 과발현의 두 가지 단점은 번역 후 변형을 일으킬 수 없고 모든 단백질3-4에 작용하지 않는다는 것입니다. 박테리아 발현이 단백질 생산에 실행 가능한 경로가 아닌 경우 비박테리아 숙주에서 과발현을 사용할 수 있지만 동위원소 표지는 어렵고 비용이 많이 듭니다5. NMR 분석을 위해 13C및 15N동위원소를 단백질에 통합하기 위한 대체 발현 방법에는 메틸 표지6 및 단일 13C, 15N아미노산7-9를 위한 대사 전구체를 사용하는 희소 표지 기술이 포함됩니다. 본원에 사용된 희소 표지에 대한 화학적 접근법은 잘 확립된 환원성 13C-메틸화 반응(그림 1)이며, 여기서 단백질의 1차 아미노기인 N-말단 α-아민 및 라이신, 측쇄 ε-아민이 메틸화됩니다. 일단 monomethylamines가 형성되면, 아민은 즉시 dimethylamines를 형성하기 위하여 더 높은 pKa 가치 때문에, 즉시 메틸화를, 다시 겪습니다.

환원적 메틸화는 Means와 Feeney10에 의해 단백질을 화학적으로 변형하는 방법으로 처음 도입되었습니다. 이 반응의 장점은 완충 된, 생리적 pH 및 저온11,12에서 광범위한 적용 가능성과 온화한 반응 조건입니다. 포름 알데히드 및 환원제, 디메틸 아민 보란 복합체 (DMAB)와 같은 존재하에서, 라이신 ε - 아미노 그룹 및 N- 말단 α- 아미노 그룹은 선택적으로 메틸화 되어 디메틸화 된 아민을 생성한다. 포름 알데히드는 메틸렌 다리의 형성을 통해 단백질을 가교하는 것으로 알려져 있지만,이 과정은 환원제13 , 14에 의해 차단됩니다.

환원적 메틸화는 NMR과 X선 결정학으로 단백질을 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 환원성 메틸화(Reductive methylation)는 다른 방법으로는 다루기 어려운 단백질의 결정화를 촉진하기 위해 사용된다15. 암탉 난자 흰자 라이소자임은 디메틸화 형태로 결정화된 최초의 단백질이었습니다. 메틸화 된 라이소자임 구조와 메틸화되지 않은 라이소자임 구조에서 무거운 원자 사이의 제곱 평균 제곱근 차이는 0.40 Å16입니다. 이 비교는 단백질 구조가 환원성 메틸화 후에도 유지될 수 있음을 보여주며, 반응을 구조 규명을 위한 실행 가능한 라벨링 도구로 만듭니다.

환원성 메틸화 반응에서 13개의 C 표지 포름 알데히드를 사용하여 13개의 C- 디메틸화 아민이 생성됩니다. 13개의 C-디메틸아민은 단백질 역학, 구조 및 기능을 연구하는 데 널리 사용되는 NMR 검출 가능한 프로브입니다. NMR 및 환원성 13C-메틸화는 β2 아드레날린성 수용체17, 리보뉴클레아제 A18, 라이소자임19, fd 유전자 5 단백질20 및 시토크롬 c21에 대한 단백질-리간드 및 단백질-단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용되었습니다. 유사하게, 13C-메틸화 리보뉴클레아제 A22, 라이소자임23, fd 유전자 5 단백질24, 클로스트리듐 파스퇴리아눔 페레독신25, IgG26의 Fc 단편, 아포지단백 A-I27 및 MIP-1α28의 구조적 및 기능적 특성은 콘카나발린 A29-30 및 칼모듈린31에 대해 연구되었습니다.

환원적 13C-메틸화는 NMR로 단백질을 연구하는 데 널리 사용되었지만, 라벨링 방법은 NMR 공명26을 할당하는 어려움으로 인해 항상 제한되어 왔습니다. 환원적으로 13C- 메틸화 된 단백질에 대한 대부분의 할당 전략은 소수의 부위, 20, 28 개의 알려진 구조적 특성11 , 19 , 23 , 26 , 31 , 32 에 의존했습니다. 또는 광범위한 유전자 변형33. 이러한 연구 중 어느 것도 13개의 C-디메틸아민 피크를 모두 성공적으로 할당하지 못했으며, 칼모듈린 연구를 제외하고는 피크가 각 라이신의 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 할당되었습니다33. MIP-1α 이량체 형성에 대한 연구에서, 환원적으로 13C- 메틸화 아민의 NMR 할당을 돕기 위해 질량 분석법 (MS)을 사용하는 것이 처음보고되었습니다28. 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간(MALDI-TOF) MS를 사용하여 이량체 계면에서 라이신을 식별했습니다. 인간 MIP-1α 트립틱 펩타이드의 부분적으로 메틸화된 리신은 MS로 확인되었으며 2D, 1, H-13, C, HSQC, NMR 스펙트럼28에서 관찰된 온전한 단백질의 모노 및 디메틸아민 신호의 출현과 상관관계가 있었습니다. 우리 그룹은 MS의 사용을 확대하고 아미노산 서열34 외에 단백질의 구조나 특성에 대한 사전 지식이 필요하지 않은 할당 방법을 제시했습니다. 이 방법은 대부분의 단백질에 적용할 수 있습니다. 한 가지 예외는 단백질에 N-말단 라이신이 있는 경우인데, 이는 N-말단 라이신 α 및 ε-13 C-디메틸아민의 MS 동위원소 프로파일을 독립적으로 측정할 수 없기 때문입니다.

여기에서는 N-말단 라이신 잔기의 N-말단 α-디메틸아민과 측쇄 ε-디메틸아민 부위를 식별하기 위해 화학적 방법과 효소적 방법의 두 가지 방법을 제시합니다. 첫 번째 방법은 Córdova et al.에서 영감을 받았습니다.단백질 아세틸화의 선택성을 조절하기 위해 pH를 사용한 사람35. 이 반응은 낮은 pH에서 N-말단 α-아민과 높은 pH에서 측쇄 ε-아민을 선호하여 모세관 전기영동을 사용하여 연구에서 단백질 α 및 ε-아미노기를 구별할 수 있습니다35. 우리는 환원성 13C-메틸화 반응을 사용하여 단백질 아미노 그룹의 표지를 변경하고 MS 보조 할당 전략을 적용할 수 있도록 하기 위해 높은 pH와 낮은 pH를 사용하는 방법을 보여줍니다. N-말단 α- 및 ε-13C-디메틸아민을 할당하는 두 번째 방법은 재조합 Aeromonas proteolytica aminopeptidase를 사용하여 N-말단 잔류물을 선택적으로 제거하는 것입니다.

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프로토콜

1. 라이소자임의 환원적 메틸화

  1. pH 7.5에서 50mM 인산나트륨 완충액 500ml를 준비합니다. 실온에서 보관하십시오.
  2. 완전 라벨링된 샘플(FLS), 낮은 pH 부분 라벨링 샘플(LpH) 및 높은 pH 부분 라벨링 샘플(HpH)에 대해 3개의 1ml 마이크로 원심분리 튜브에 라벨을 부착합니다.
  3. 라이소자임 10mg의 무게를 측정하고 인산나트륨 완충액 2ml에 용해시켜 5mg/ml 농도의 수용액을 만듭니다. 포름알데히드가 빛 노출로 인한 분해로부터 보호되도록 알루미늄 호일로 튜브를 덮습니다. 각 튜브에 500μl의 라이소자임 용액을 추가합니다.
  4. 디메틸아민 보란 복합체(DMAB)와 13C-포름알데히드의 신선한 1.0M 용액을 준비합니다. 0 °C에서 보관하십시오.
  5. 완전히 라벨링된 샘플의 경우 1:10(반응성 아민: 포름알데히드)의 몰비를 사용하고 부분적으로 라벨링된 샘플의 경우 1:5 비율을 사용합니다. 또는 비율을 최적화할 수 있습니다. 예를 들어, 낮은 pH에서 α-13C-디메틸아민 피크의 우세를 확인하기 위해서는 2:7 비율이 필요했습니다.
  6. FLS에 6.1μl의 1.0M DMAB를 첨가하고 LpH 및 HpH에 3.2μl의 1.0M DMAB를 첨가한 후 부드럽게 와류합니다. 그런 다음 FLS에 12.3μl의 1.0M-13C-포름알데히드를 추가하고 LpH 및 HpH에 6.1μl의 1.0M 13C-포름알데히드를 첨가합니다.반응 혼합물을 4°C에서 2시간 동안 흔듭니다.
  7. 이전 단계에서와 같이 1.0 M DMAB와 13C-포름알데히드의 또 다른 분취액을 첨가하고 총 반응 시간 18-24 시간 동안 4 °C에서 밤새 반응 혼합물을 흔듭니다.
  8. 시료의 완충액을 pH 7.5의 인산염으로 교환하여 원심 필터(3kDa 분자량 기준)를 사용하여 과도한 시약과 부산물을 제거합니다.
  9. 부분적으로 라벨링된 샘플의 경우, pH 7.5에서 자연적으로 풍부한 포름알데히드로 샘플을 환원적으로 메틸화하여 균질하게 변형된 단백질을 생성합니다. DMAB와 자연적 풍부도 포름알데히드의 새로운 1.0M 용액을 준비합니다.
  10. 샘플 튜브를 호일로 덮고 LpH 및 HpH에 6.1μl의 DMAB를 첨가한 다음 부드럽게 와류를 수행합니다. 그런 다음 12.3 μl의 자연 풍부 포름 알데히드를 첨가하십시오. 반응 혼합물을 4°C에서 2시간 동안 흔듭니다.
  11. 이전 단계에서와 같이 1.0 M DMAB와 자연적 존재량 포름알데히드의 또 다른 부분 표본을 첨가하고 총 반응 시간 18-24시간 동안 4°C에서 밤새 반응 혼합물을 흔듭니다. 그런 다음 2.5-2.6단계를 사용하여 버퍼를 교환하고 MS를 위해 -20°C에서 50μg 샘플을 보관합니다.

2. NMR 분석을 위한 샘플 준비

  1. pH 8.5 in H2O에서 2.0M 붕산나트륨 완충 용액을 준비합니다.
  2. 375μl의 2.0M 붕산나트륨 완충액을 4개의 15ml 원뿔형 튜브에 추가합니다. 상판을 파라필름으로 만들고 구멍을 뚫습니다. 플라스크를 동결 건조 플라스크에 넣고 샘플을 얼립니다.
  3. 냉동 샘플을 동결 건조기에 올려 건조시킵니다. 건조되면 제거하십시오.
  4. 피펫을 사용하여 각 튜브에 D2O 15ml를 넣고 섞습니다.
  5. 3개의 4ml 원심 필터(3kDa 분자량 기준)에 FLS, LpH 및 HpH로 라벨을 붙입니다.해당 샘플을 필터 튜브(~500μl)에 추가합니다. pH 8.5의 50mM 붕산나트륨 완충액 3.0ml를 각 튜브에 추가합니다. 세 번째 튜브용 밸런스 튜브를 만들고 4°C 및 7,500rcf에서 35° 고정각 로터가 있는 원심분리기를 사용하여 샘플을 500μl로 농축합니다.
  6. 각 필터 아래의 트랩을 비웁니다. 샘플에 3.0ml의 완충액을 더 추가하고 샘플을 다시 500μl로 농축합니다. 2.5 4x 단계를 반복합니다.
  7. 비신초닌산(BCA) 단백질 분석36을 사용하여 각 샘플의 농도를 측정합니다. 라이소자임 샘플을 50mM 붕산나트륨 완충액으로 희석하여 150μM 샘플을 만듭니다.
  8. 530μl를 5mm NMR 튜브로 전달하거나 250μM를 5mm 자기 감수율 일치 튜브로 전달합니다.
  9. D2 O에서 1,2-dichloroethane-13 C2 의 80 mM 원액을 준비합니다. 이 원액을 -80 °C에서 보관하십시오. 80 μl에서 24 mM로 희석하고 동축 삽입 튜브로 옮겨 NMR 분석에서 참조로 사용합니다. NMR로 샘플을 분석합니다. 참고: 1D 1 H-13C HSQC를 실행하고 각 공진에 대한 피크 면적을 적분합니다. 피크 면적은 완전히 라벨링된 샘플에 대해 동일해야 합니다.

3. 라이소자임의 아미노펩티다아제 분해

  1. 초순수에 라이소자임 5mg/ml 용액을 준비합니다.
  2. 라이소자임 용액 250μl를 깨끗한 1ml 원심분리 튜브에 넣습니다.
  3. 0.1M 트리신 용액 25μl, pH 8.0 및 2.16μg/ml Aeromonas proteolytica 아미노펩티다아제 용액 6μl를 추가합니다.
  4. 37 ° C에서 6 시간 동안 배양하십시오.
  5. 2.16μg/ml 아미노펩티다아제 용액 6μl를 샘플에 추가하여 아미노펩티다아제와 라이소자임의 1:50 몰 비율을 만듭니다. 37 °C에서 20 시간 더 배양하십시오.
  6. C18 스핀 컬럼을 사용하여 시료 30μl를 탈염합니다(제조업체의 프로토콜 준수). MALDI MS 분석을 위해 -20°C에서 보관하십시오.
  7. 프로토콜 2)에 설명된 대로 NMR에 대한 나머지 단백질 샘플을 준비합니다.

4. 질량 분석을위한 샘플 준비

  1. 2.3단계에서 보존한 50μg의 샘플을 사용하여 완충액을 100mM 중탄산암모늄, pH 8.0으로 교환하고 1ml 원심 필터(3kDa 분자량 컷오프)를 사용하여 농축액을 약 50μl로 교환합니다. 샘플을 1ml 원심분리기 튜브에 옮기고 알루미늄 호일로 감쌉니다.
  2. 2.0μl의 500mM 디티오트레이톨을 첨가하여 이황화 결합을 줄입니다. 용액을 60°C에서 1시간 동안 배양합니다.
  3. 갓 준비한 500mM 요오드아세트아미드 2μl를 첨가하여 티올기를 알킬화합니다. 실온에서 20분 동안 배양합니다.
  4. 호일을 제거하고 1.0 μl의 500 mM dithiothreitol 용액을 첨가하여 반응을 냉각시킵니다.
  5. 단백질을 소화하기 위해 2.0μg의 염기서열분석 등급 트립신을 첨가합니다. 혼합물을 37 ° C에서 16-24 시간 동안 배양합니다.
  6. pH가 2 미만이 될 때까지 TFA를 첨가하여 분해를 담금질합니다. (포름산과 아세트산도 사용할 수 있습니다)
  7. C18 스핀 컬럼에서 시료를 탈염하고 단백질을 80% 아세토니트릴/0.1% TFA로 용리시킵니다. 진공 농축기를 사용하여 샘플을 건조시킵니다.
  8. MALDI MS 분석을 위해 5.0μl의 50% 아세토니트릴/0.1% TFA로 샘플을 재구성합니다. MALDI 타겟 플레이트에서 동일한 부피의 재구성된 샘플과 2,5-디하이드록시벤조산 매트릭스 용액의 포화 용액을 혼합합니다. MALDI MS에서 시료를 분석합니다. 참고: 탠덤 MS를 사용하여 펩타이드 피크의 정체를 확인합니다. 질량 스펙트럼을 매끄럽게 하고 분석합니다. 각 디메틸아민 함유 펩타이드에 대해 프로파일에 있는 각 동위원소의 피크 강도와 피크 면적을 측정합니다. 앞에서 설명한 대로 13C-혼입의 백분율을 계산합니다34.

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결과

환원적 메틸화 및 pH

리소자임에서 pH 유도 화학 선택적 환원적 13C-메틸화 반응이 입증되었습니다. 낮은 pH에서 반응은 측쇄 ε-아민보다 N-말단 α-아민을 선호하며, 높은 pH에서는 그 반대가 됩니다. 용액 내에서 단백질의 아미노기는 유리 아민과 짝산 사이의 평형 상태로 존재하며, 이는 pH로 조절 가능합니다. 이 반응의 최적 pH 범위는 사용되는 환원제에 따라 다릅니다. 이 경우, 디메틸아민 보란의 최적 pH는 7.0-9.0입니다. 환원제의 최적 범위를 벗어나 작업하면 반응 효율이 떨어지는데, 이는 본 실험에서는 오히려 장점이 됩니다. 환원적 메틸화 반응은 α-아민의 산 해리 상수(pKa)가 (~7)23로 ε-아민(~10)32보다 낮기 때문에 pH 6.0에서 우선적으로 N-말단 α-아민을 변형시킵니다. pH 6.0에서 평형은 짝산 쪽으로 급격히 치우치며, α-아민이 ...

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토론

환원적으로 13개의 C-메틸화 단백질의 NMR 신호를 할당하는 것은 이 동위원소 표지 방법을 완전히 활용하는 데 필요합니다. 부분 13C-혼입 데이터의 상관 관계를 통해 NMR 신호 할당을 돕기 위해 MS를 사용하는 것은 유망한 기술입니다. 다른 할당 방법에 비해 이 기술의 장점은 1차 아미노산 서열만 필요하다는 것입니다. α-디메틸아민과 ε-디메틸아민의 13C-혼입은 MS로 별도로 측정할 수 없기 때문에 N-말단 아미노산이 라이신일 때 MS 보조 할당 방법이 제한됩니다. 적정 실험은 일반적으로 α-디메틸아민 화학적 이동의 pH 의존성을 보여주지만 염교 및 기타 구조적 기여로 인해 화학적 이동은 신뢰할 수 없는 할당 방법입니다. 제시된 방법을 사용하면 이 문제를 해결할 뿐만 아니라 MS로 α- 및 ε-디메틸아미노 펩타이드에 대한 개별 13C% 혼입을 측정하는 문제를 피할 수 있습니다. 하나의 부위에 라벨이 붙어 있기 때문에 1...

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공개 사항

우리는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 미국 국립보건원(National Institute of Health)의 국립연구자원센터(National Center For Research Resources)의 수상 번호 R00RR024105의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세토니트릴시그마34851
아미콘 울트라 4ml 원심 필터(3k MWCO)피셔 사이언티픽UFC800308(8pk)
아미노펩티다아제크리에이티브 바이오마트아미노펩티다제-86A
중탄산암모시그마A6141
황산암모늄시그마A5132
보란-디메틸아민 복합체시그마180238사용하기 전에 1M 용액을 새로 만드십시오.
붕산SigmaB6768
소 췌장 인슐린SigmaI5500
C18 스핀 컬럼Thermo Scientific89870
중수소산화물Cambridge Isotope LaboratoriesDLM-4-100
1,2-dichloroethane-13C2Sigma714321-80°C에서 저장된 80mM 원액. 24mM에서 NMR 스펙트럼에서 참조로 사용됩니다.
포름알데히드(36.5% wt/wt)Sigma33220사용하기 전에 1M 용액을 새로 만드십시오.
13C-포름알데히드 (99%)Cambridge Isotope LaboratoriesCLM-806-1사용하기 전에 1M 용액을 새로 만드십시오.
라이소자임(암탉 달걀 흰자)SigmaL6376
인산나트륨(이염기성 헵타하이드레이트)SigmaS9390
인산나트륨(일염기)SigmaS9638
트리신시그마T0377
트리플루오로아세트산시그마302031
700MHz Varian VNMRS, 5mm HCN 5922 프로브애질런트 기술
Bruker UltrafleXtreme MALDI TOF/TOFBruker
늄 ,

참고문헌

  1. Bax, A., Grzesiek, S. Methodological Advances in Protein NMR. Accounts of Chemical Research. 26 (4), 131-138 (1993).
  2. Shimba, N., Yamada, N., Yokoyama, K., Suzuki, E. Enzymatic Labeling of Arbitrary Proteins. Analytical Biochemistry. 301 (1), 123-127 (2002).
  3. Palomares, L., Estrada-Moncada, S., Ramírez, O. Production of Recombinant Proteins. Recombinant Gene Expression. Balbás, P., Lorence, A. 267, Humana Press. New York City, New York, USA. 15-51 (2004).
  4. Graslund, S., et al. Protein Production and Purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  5. Terwilliger, T. C., Stuart, D., Yokoyama, S. Lessons from Structural Genomics. Annual Review of Biophysics. 38, 371-383 (2009).
  6. Goto, N. K., Kay, L. E. New Developments in Isotope Labeling Strategies for Protein Solution NMR Spectroscopy. Curr. Opin. Struct. Biol. 10 (5), 585-592 (2000).
  7. Lian, L., Middleton, D. Labelling Approaches for Protein Structural Studies by Solution-State and Solid-State NMR. Progress in Nuclear Magn. Reson. Spectroscopy. 39 (3), 171-190 (2001).
  8. Mason, A., Siarheyeva, A., Haase, W., Lorch, M., van Veen, H., Glaubitz, C. Amino Acid Type Selective Isotope Labelling of the Multidrug ABC Transporter LmrA for Solid-State NMR Studies. Febs Lett. 568 (1-3), 117-121 (2004).
  9. Chen, C., et al. Preparation of Amino-Acid-Type Selective Isotope Labeling of Protein Expressed in Pichia pastoris. Proteins:Structure Function and Bioinformatics. 62 (1), 279-287 (2006).
  10. Means, G., Feeney, R. Reductive Alkylation of Amino Groups in Proteins. Biochem. 7 (6), 2192 (1968).
  11. Jentoft, J. E., Jentoft, N., Gerken, T. A., Dearborn , D. G. C-13 NMR-Studies of Ribonuclease-A Methylated With Formaldehyde-C-13. J. Biol. Chem. 254 (11), 4366-4370 (1979).
  12. Rayment, I. Reductive alkylation of lysine residues to alter crystallization properties of proteins. Macromolecular Crystallography, Pt A. 276 (97), 171-179 (1997).
  13. French, D., Edsall, J. T. The Reactions of Formaldehyde with Amino Acids and Proteins. Adv. Protein Chem. 2, 277-335 (1945).
  14. Jentoft, N., Dearborn, D. G. Labeling of Proteins by Reductive Methylation Using Sodium Cyanoborohydride. J. Biol. Chem. 254 (11), 4359-4365 (1979).
  15. Walter, T., et al. Lysine Methylation as a Routine Rescue Strategy for Protein Crystallization. Struct. 14 (11), 1617-1622 (2006).
  16. Rypniewski, W., Holden, H., Rayment, I. Structural Consequences of Reductive Methylation of Lysine Residues in Hen Egg-White Lysozyme - An X-ray Analysis at 1.8-Angstrom Resolution. Biochem. 32 (37), 9851-9858 (1993).
  17. Bokoch, M. P., et al. Ligand-specific regulation of the extracellular surface of a G-protein-coupled receptor. Nat. 463 (7277), (2010).
  18. Jentoft, J., Gerken, T., Jentoft, N., Dearborn, D. C-13] Methylated Ribonuclease-A - C-13 NMR Studies of the Interaction of Lysine 41 with Active Site. 256 (1), 231-236 (1981).
  19. Sherry, A., Teherani, J. Physical Studies of C-13-Methylated Concanavalin A - pH and Co2+-Induced Nuclear Magn. Reson. Shifts. J. Biol. Chem. 258 (14), 8663-8669 (1983).
  20. Dick, L., Sherry, A., Newkirk, M., Gray, D. Reductive Methylation and C-13 NMR Studies of the Lysyl Residues of fd Gene 5 Protein - Lysines 24, 46, and 69 May be Involved in Nucleic Acid Binding. J. Biol. Chem. 263 (35), 18864-18872 Forthcoming.
  21. Moore, G. R., et al. N-epsilon,N-epsilon-dimethyl-lysine cytochrome c as an NMR probe for lysine involvement in protein-protein complex formation. Biochem. J. 332, 439-449 (1998).
  22. Jentoft, J. E., Gerken, T. A., Jentoft, N., Dearborn, D. G. Studies of the Active-Site Lysine of Ribonuclease-A By C-13 NMR. Biophys. J. 25 (2), 56 (1979).
  23. Gerken, T., Jentoft, J., Jentoft, N., Dearborn, D. Intramolecular Interactions of Amino Groups in C-13 Reductively Methylated Hen Egg-White Lysozyme. J. Biol. Chem. 257 (6), 2894-2900 (1982).
  24. Dick, L. R., Geraldes, C., Sherry, A. D., Gray, C. W., Gray, D. M. C-13 NMR of Methylated Lysines of fd Gene-5 Protein - Evidence for A Conformational Change Involving Lysine-24 Upon Binding of A Negatively Charged Lanthanide Chelate. Biochem. 28 (19), 7896-7904 (1989).
  25. Gluck, M., Sweeney, W. V. C-13-NMR of Clostridium-Pasteurianum Ferredoxin After Reductive Methylation of the Amines Using C-13 Formaldehyde. Biochimica Et Biophysica Acta. 1038 (2), 146-151 (1990).
  26. Jentoft, J. E. Reductive Methylation and C-13 Nuclear-Magnetic-Resonance in Structure-Function Studies of Fc Fragment and Its Subfragments. Methods in Enzymology. 203, 261-295 (1991).
  27. Sparks, D., Phillips, M., Lundkatz, S. The Conformation of Apolipoprotein A-I in Discoidal and Spherical Recombinant High Density Lipoprotein Particles - C-13 NMR Studies of Lysine Ionization. J. Biol. Chem. 267 (36), 25830-25838 (1992).
  28. Ashfield, J., et al. Chemical Modification of a Variant of Human MIP-1 Alpha, Implications for Dimer Structure. Protein Science. 9 (10), 2047-2053 (2000).
  29. Goux, W., Teherani, J., Sherry, A. Amine Inversion in Proteins - A C-13-NMR Study of Proton Exchange and Nitrogen Inversion Rates in N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha-[C-13]Tetramethyllysine, N-Epsilon,N-Epsilon,N-Alpha,N-Alpha[C-13]Tetramethyllysine Methyl-Ester, and Reductively Methylated Concanavalin-A. Biophysical Chemistry. 19 (4), 363-373 (1984).
  30. Sherry, A. D., Keepers, J., James, T. L., Teherani, J. Methyl Motions in C-13 Methylated Concanavalin-as Studied by C-13 Magnetic-Resonance Relaxation Techniques. Biochemistry. 23 (14), 3181-3185 (1984).
  31. Huque, M., Vogel, H. C-13 NMR Studies of the Lysine Side Chains of Calmodulin and Its Proteolytic Fragments. Journal of Protein Chemistry. 12 (6), 695-707 (1993).
  32. Brown, L., Bradbury, J. Proton-Magnetic-Resonance Studies of Lysine Residues of Ribonuclease-A. Eur. J. Biochem. 54 (1), 219-227 (1975).
  33. Zhang, M., Vogel, H. Determination of the Side Chain pKa Values of the Lysine Residues in Calmodulin. J. Biol. Chem. 268 (30), 22420-22428 (1993).
  34. Macnaughtan, M., Kane, A., Mass Prestegard, J. Spectrometry Assisted Assignment of NMR Resonances in Reductively C-13-Methylated Proteins. J. Am. Chem. Soc. 127 (50), 17626-17627 (2005).
  35. Cordova, E., Gao, J., Whitesides, G. M. Noncovalent Polycationic Coatings for Capillaries in Capillary Electrophoresis of Proteins. Anal. Chem. 69 (7), 1370-1379 (1997).
  36. Smith, P. K., et al. Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  37. Larda, S. T., Bokoch, M. P., Evanics, F., Prosser, R. S. Lysine methylation strategies for characterizing protein conformations by NMR. J. Biomolec. NMR. 54 (2), 199-209 (2012).
  38. Bradbury, J. H., Brown, L. R. Determination of Dissociation Constants of Lysine Residues of Lysozyme by Proton-Magnetic-Resonance Spectroscopy. Eur. J. Biochem. 40 (2), 565-576 (1973).
  39. Frey, S. T., Guilmet, S. L., Egan, R. G., Bennett, A., Soltau, S. R., Holz, R. C. Immobilization of the Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica on Mg2+/Al3+ Layered Double Hydroxide Particles. Acs Appl. Mater., & Interfaces. 2 (10), 2828-2832 (2010).
  40. Poncz, L., Dearborn, D. G. The Resistance to Tryptic Hydrolysis of Peptide-Bonds Adjacent to N-epsilon,N-Dimethyllysyl Residues. J. Biol. Chem. 258 (3), 1844-1850 (1983).

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