사용 Caenorhabditis의의 우 •은 개발 및 생리학에 고도 불포화 지방산의 기능을 탐구 할 수있는 유용한 모델입니다. 이 프로토콜의 C.의 보충의 효율적인 방법을 개시 엘레 고도 불포화 지방산 다이어트.
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이 논문에서
요약
초록
지방산은 다수의 세포 기능에 필수적이다. 이들은 세포막의 소수성 코어를 구성하고, 다양한 신호 전달 경로에 참여하는 등 효율적인 에너지 저장 분자를 봉사. Caenorhabditis의 엘레 오메가 -6와 오메가 -3 지방산의 범위를 생산하는 데 필요한 효소를 모두 합성한다. 이것은 간단한 해부학 가능한 유전 도구의 범위와 함께, 그것은 지방산의 기능을 연구하는 매력적인 모델합니다. 식물 지방산의 생리 학적 효과를 매개하는 유전자 전달 경로를 조사하기 위해, 우리는 C.를 보완하는 방법을 개발했다 불포화 지방산 elegans의 다이어트. 보충제 웜의 지방산 조성을 변경하는 효과적인 수단이며, 또한 지방산 결핍 돌연변이 체의 결함을 구하기 위해 사용될 수있다. 우리의 방법은 지방 acidsodium 소금으로 보충 선충의 성장 매체 한천 (NGM)를 사용합니다. 보충 판에있는 지방산은 incorpora가테드 다음 C.에 의해 흡수되어 세균의 음식 소스의 세포막에 보충 박테리아에 먹이 엘레. 또한 보충 웜 발생 지방산 조성의 변화를 모니터링하기 위해 가스 크로마토 그래피 프로토콜을 설명한다. 이것은 C의 크고 작은 집단의 다이어트를 보완 할 수있는 효율적인 방법입니다 엘레,이 방법에 대한 응용 프로그램의 범위에 대한 허용.
서론
지방산은 세포막의 필수 구조적 구성 요소뿐만 아니라 효율적인 에너지 저장 분자이다. 또한 지방산은 리파제에 의해 세포막에서 절단 될 수 있고, 효소 적 시그널링 이펙터 하나를 생성하도록 변형 될 수있다. 자연적으로 발생하는 고도 불포화 지방산 (PUFAs에)는 두 개 이상의 시스 이중 결합을 포함하고 있습니다. 오메가 -3 지방산과 오메가 -6 지방산은 지방산의 메틸 말단에 대하여 이중 결합의 위치에 기초하여 서로 구별된다. 건강한 식단은 오메가 -6와 오메가 -3 지방산을 모두 필요로한다. 그러나, 서양 식단은 오메가 -6 지방산과 오메가 -3 지방산이 가난한 특히 풍부하다. 높은 오메가 -6 오메가 -3 지방산 비율은 심장 혈관 및 염증성 질환의 위험이 증가하지만, 특정 지방산의 정확한 유익하고 해로운 기능이 잘 이해되지와 연관된다. 거위 Caenorhabditis의의 ELEGA그것은 오메가 -3 불포화, 대부분의 동물 3,4 부재 활동 등 오메가 -6와 오메가 -3 지방산의 범위를 생성하는 데 필요한 효소를 모두 합성 때문에 NS 지방산 기능 연구에 유용하다. 지방산 불포화 화 효소 결핍 돌연변이 발생 및 신경 학적 결함 4-6의 범위에 이르는, 특정 ....
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프로토콜
고도 불포화 지방산은 열, 빛과 산소에 민감합니다. 지방산의 보충 판을 준비 할 때 따라서주의가 필요 지방산 과잉 열과 빛에 노출되지 않도록. 0.1 % TERGITOL (NP-40)를 함유 NGM 매체 지방산 나트륨 염은 일정한 교반하면서 첨가 된 후, 오토 클레이브와 부분적으로 냉각된다. 플레이트는 어둠 속에서 건조 할 수있다. C.에 의해 지방산의 흡수 다음, 가스 크로마토 그래피로 모니터링 할 수있다 elegans의 이러한 플레이트 상에 배양 하였다.
1. 지방산 보충 미디어의 제조
- 적절한 크기의 플라스크에 미디어 구성 요소를 측정한다. 1 L 당 17g 박토 한천, 2.5 g의 트립 톤, 3g의 NaCl, 에탄올 1 ㎖ 5 ㎎ / ㎖의 콜레스테롤, 물에 녹여 10 ㎖의 10 % TERGITOL를 추가합니다.
- 밀리 포아 물 최종 원하는 볼륨의 80 %를 추가하고 다른 수와 동일 (빈 유리 병들과 함께 미디어를 압력솥지방산 피 시험 농도)뿐만 아니라, 적절한는 눈금 실린더.
- 55 ° C로 설정 물을 욕조에 차가운 미디어 매체는 유리 바이알을 오픈 깨는 안전 예방책을 사용하고 유리 입자가 지방산과의 혼합하지 않는 보장함으로써 지방산 나트륨 염 작업 ....
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결과
C의 보충 엘레 다이어트는 세균의 막에 지방산 통풍 관과 통합하는 세균의 먹이 원의 능력에 의해 제한된다. E.의 능력을 결정하기 위해 그 멤브레인으로 각종 지방산을 동화 대장균 OP50은 OP50가 없음 서플리먼트, 0.1 ㎜ 및 스테아린산 (18시), 올레산 나트륨 (18시 1분 N-9), 및 소듐 DGLA (20 0.3 mM의 농도와 함께 매체 상으로 도금 하였다 : 내지 3n-6). 플레이트를 어두운 곳에서 실온에서 2 일 동안 건조시키고, 3 일 동안 20 ° C에서 배양 하였다. 세균의 잔디가 부드럽게 화염 멸균 주걱 물에 잔디를 긁어 수집 하였다. 세균은 원심 분리에 의해 펠릿 화하고, 2.5 %의 H 2 SO로 처리 절차에 나열된 방법 3 단계 다음 GC / MS로 분석 하였다 지방산 메틸 에스테르를 생성하는 메탄올 중 4. 결과는 불포화 지방산 (올레산과 DGLA)가 t보다 더 높은 양으로 OP50에 통합 함.......
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토론
여기에서 우리는 C의 보충하는 방법을 설명 식이 불포화 지방산의 elegans. 위에서 언급 한 바와 같이 된 PUFA의 이중 결합의 반응 특성이 지방산은 열과 빛 (11)을 통해 산화에 민감하게 반응하는 원인이되기 때문에주의를 PUFA 보충 판의 제조에주의해야합니다. 산화를 방지하기 위해, 용지가 어두운 환경에서 55 ° C 저장 플레이트로 냉각되면, 액체 한천 배지에 PUFA을 추가하는 것이 중요하다.
기타 C.에 유리 지방산을 소개했다 엘레 DMSO 또는 에탄올 캐리어를 사용하여, 또는 다른 직접 외음부 12-14 마이크로 인젝션에 의해 지방산을 추가하여. 돌연변이 표현형의 부분 구조는 TERGITOL (NP40) 14 ~ 15를 사용하지 않고 성장판의 지방산 섭취에 의해 달성되었다. C.에 지방산을 소개하는 효과적인 다양한 방법이 .......
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
우리는 원고에 도움이 코멘트 대표 결과 그림 3과 제이슨 와츠와 크리스 웹스터에 표시된 예비 실험을 수행하기 위해 크리스 웹스터 감사합니다. 이 연구를위한 자금 조달은 JLW에 건강의 국립 연구소 (미국) (R01DK074114)에서 교부금에 의해 제공되었다. 이 작품에 사용 된 일부 선충 균주 연구 인프라 프로그램의 NIH 사무소 (P40의 OD010440)에 의해 재정 지원 Caenorhabditis의 유전학 센터에 의해 제공되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Bacto-Agar | Difco | 214010 | |
| 트립톤 | Difco | 211705 | |
| NaCl J.T. Baker | 3624-05 | ||
| Tergitol | Sigma | NP40S-500mL | |
| 콜레스테롤 | Sigma | C8667-25G | (에탄올 내 5 mg/mL) |
| MgSO4 | J.T. Baker | 2504-01 | |
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3254-05 | |
| KH2PO4 | J.T. Baker | 3246-05 | |
| 나트륨 디호모감마 리놀레네이 | NuCHEK | S-1143 | |
| 따뜻한 멸균 Millipore 물 | |||
| 수집을 위한 멸균수 | |||
| 뉴클레아제가 없는 DGLA 원액용 물 | Ambion | AM9932 | |
| 암피실린 | Fisher Scientific | BP1760-25 | 물 중 100mg/ml(RNAi 플레이트용) |
| 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG) | Gold Biotechnology | 12481C100 | 물 중 1M(RNAi 플레이트용) |
| HSO4 | J.T. Baker | 9681-03 | |
| 메탄올 | Fisher Scientific | A452-4 | |
| 헥산 | Fisher Scientific | H302-4 | |
| 디아민디노페닐린돌(DAPI) | Sigma | D9542 | |
| VectaShield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 유리 플라스크 | Corning | 4980-2L | |
| 교반이 있는 오토클레이브 가능한 유리병 | Fisherbrand | FB-800 | |
| 오토클레이브 유리 눈금 실린더 | Fisherbrand | 08-557 | |
| 교반 플레이트 | VWR | 97042-642 | |
| 55+ °의 수조; C | 정밀 과학 Inc. | 66551 | |
| Screwcap 갈색 유리 바이알 | Sun SRI | 200 494 | |
| 아르곤 가스 탱크 | |||
| 자동 피펫 에이 | Pipette-Aid | P-90297 | |
| 멸균 혈청학 피펫 (25 ml) | Corning | 4489 | |
| Bunsen Burner | VWR | 89038-534 | |
| 해부 현미경 | Leica | ||
| FAMEs 유도체화를 위한 | 실란화 유리관 | Thermo Scientific | STT-13100-S |
| Kimble-Chase | 1493015D | ||
| 임상 탁상용 원심분리기 | IEC | ||
| GC 크림프 바이알 | SUN SRi | 200 000 | |
| GC 바이알 인서트 | SUN SRi | 200 232 | |
| GC 바이알 캡 | SUN SRi | 200 100 | |
| 가스 크로마토그래프 | Agilent | 7890A | |
| 가스 크로마토그래피용 | Agilent | 30m x 0.25mm 용융 실리카 모세관 컬럼 | |
참고문헌
- Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease. Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).
- de Lorgeril, M., Salen, P. New insights into the health effects of dietary satu....
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재인쇄 및 허가
