방법 논문

성인 쥐의 뇌의 기존 및 비 인습적 인 지역에서 신경 줄기 세포 성장

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⸱

DOI:

10.3791/50880

⸱

2013년 11월 18일

 , 
1Department of Medicine, University of Dresden, 2Center for Regerative Therapies Dresden

이 논문에서

요약

성인의 뇌에서 수확 한 신경 줄기 세포는 신경 시스템 개발의 기초 연구에서 재생 의학의 잠재적 인 임상 응용 프로그램을 탐험에 이르기까지 다양한 애플리케이션에 활용 증가하고있다. 이 실험 결과를 소리를하는 것이 중요합니다 이러한 세포를 성장하는 데 사용되는 분리 및 배양 조건에서 엄격한 통제를한다.

초록

최근 연구는 중추 신경계 (CNS) 재생 및 종양 줄기 세포의 인구 (SC에) 성인 뇌 내 거주자를 포함 것을 보여줍니다. 그러나 메커니즘이 정상적으로 정지 세포가 적절한 신경망의 기능뿐만 아니라, 신경 퇴행성 프로세스의 부상 및 완화 회복에 자신의 역할을 보장하기 위해 고용은 조금 이해된다. 이러한 세포는 혈관 및 면역 조절 성 시스템 모두로부터 신호들을 포함한 서스테인 환경을 제공 「틈새」이라고도 영역에 상주. 알 수없는 요인을 제외 정의 배양 조건에서 CNS의 SC와의 분리, 유지 보수 및 차별화, 따라서 자신의 생체 내 행동에 대한 통찰력을 제공하고, 약물 또는 유전자에 의한 치료에 액세스 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 성인 뇌의 특정 영역에서 CNS의 SC와의 문화를 생성하는 방법에 대한 자세한 정보를 제공하고 자신의 개발을 평가하는 접근신경 세포, 성상 세포, 그리고 체외에서 희소 돌기 아교 세포에 ifferentiation 가능성. 이 기술은 개별 SC에 자신의 자손을 연구하기 위해 시각화 할 수있는 단일 층 문화로 균일 한 세포 인구를 산출한다. 게다가, 다른 동물 모델 시스템과 임상 샘플을 가로 질러인가 될 수 손상된 성인 신경계 재생 반응을 예측하기 이전에 사용된다.

서론

한 세기 이상 전에 라몬 Y.를 Cajal에 의해 뇌 cytoarchitecture의 기본 관찰에 의해 규정 신경 생물학의 중심 교리는, 사춘기가 CNS 1에서 발견되는 신경 네트워크의 복잡성을 주어진 후 신경이 어려울 것을 가졌다. 1960 년대에 알트만의 작품, 그리고 나중에 카플란, 3 H-티미 딘이 실제로 뉴런은 성인 뇌의 서로 다른 영역에서 생성되고 있었다 나타내는 성숙한 신경 세포에서 발견 될 수 있다는 것을 입증에도 불구하고, 교리는 2, 3을 유지하는 것을 계속했다. 증거는 가수 두뇌 4에 존재하는 뉴런의 수의 계절적 변화를 설명 Nottebohm의 연구를 탑재하는 것을 계속했다. 그것은 1999 년까지되지 않았을 때 쥐의 연관 학습 과제의 성능뿐만 아니라 Kornack 및 Rakic ​​시연의 관측과 해마 증가 뉴런의 생성에 굴드 등. 출판 일딸랑 딸랑 소리는 덜 엄격한, 더 플라스틱 뇌의 개념이, 5 인식 된 성인 짧은 꼬리 원숭이, 6에 신경을 계속했다.

이 새로이 생성 된 신경 세포의 세포 소스에 대한 검색은 7 벽감으로 불리는 뇌의 영역에있는 줄기 세포 (SC에)의 이산 인구의 발견으로 이어질. subventricular 영역과 해마의 하위 세부 영역은 두 가지 주요 신경성 지역 8,9로 간주됩니다. 이 위치에서 분리 된 세포는 고전적인 배아 또는 태아의 파생으로 SC의 특성,자가 재생과 분화 가능성을 표시합니다. 신경줄 기세포 (NSCs의)의 경우, 이들은 뉴런, 아스트로 사이트, 및 희소 돌기 아교 세포로 분화 될 수있다. 또한, 이러한 SCS는 이러한 중간 필라멘트 단백질 네 스틴 10 태아 NSC 마커에 대한 긍정적 인 얼룩. 최근의 작업은 SC에이 t에 한정되지 않을 수 있음을 강조지역 우와, 그리고이 사실에 단단히 혈관 (11)와 관련된 세포의 대부분 대기 인구로 뇌 전반에 걸쳐 현지화.

SC에가 부상에 응답 동원 관측은 신경 퇴행성 질환 및 뇌졸중 (12, 13)에서 복구를 돕기 위해 회생 용으로 이들 세포를 이용할 수 있다는 가능성을 시사한다. 따라서 골아 세포, 연골 세포 및 지방 세포 (14)가 될 가능성이있는 혈관 주위 세포로 발견되는 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)이 결합 조직의 치유에 재생하는 역할 달리 아니다. 그러나 NSCs의 일상적인 흡인 및 밀도 구배 원심 분리 기술에 의해 골수에서 중간 엽 줄기 세포와 동일하게하여 수확 할 수없고 이후자가 세포 기반 치료에 활용. 결과적으로, 그러한의 emb 유래 태아 NSCs의 또는 신경 전구체의 사용과 같은 셀의 다른 소스ryonic 줄기 세포가 광범위하게 성공 (15)의 학위를 변화와 동물의 질병과 부상의 모델을 탐구하고 있습니다. 체세포 소스를 이용하여 유도 만능 줄기 세포 기술은 제한된 가용성 및 배아 세포와 태아 조직 (16)의 사용에 대한 윤리적 문제를 극복하고, 응용 프로그램의 광범위한 치료에 유용 세포 기반 치료법을 생산하는 또 다른 잠재적 인 수단을 제공합니다. 그러나, 이러한 연구 결과의 임상 번역 (17, 18)뿐만 아니라, 규제 통관에 구불 구불 한 경로를 접근 SC 기반 치료와 함께 다양한 신경 학적 조건을 치료하는 투쟁에서와 같이, 어려운 작업이 될 입증되었습니다. 다른 방법으로, 특정 약물 치료의 도입은 NSC의 숫자를 조절하고 파킨슨 질환과 뇌졸중의 19 모델의 회복을 촉진 할 수있다. 전략은 효과적으로 이러한 세포를 조작하는 방법을 이해 할 수있는 어떤접근 체외 시스템이 필요합니다.

NSCs의의 문화는 neurosphere를로 알려진 집계 문화, 또는 단일 층 8,20로도 수행 할 수 있습니다. 두 기술은 널리 다 능성 전구 물질의 확장을 제공 정의 배양 조건, 유사 분열 물질 소스로 표피 성장 인자 (EGF) 또는 기본 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF의)의 예 사용의 설립을 허용, 사용되어왔다. neurosphere 배양 고립 셀 분류 클론 번식 능력을 연구에 더 적합 할 수 있지만, 시스템 (21)은 팽창시 세포의 혼합 집단을 생성하는 것으로 나타났다. 또, neurosphere를의 밀폐 구조는 세포의 약리 조작 비실용적하게하고, 이러한 요인이있을 수 영향 해석 인해 neurosphere 자체 내에 설립 미시로 혼동 할 수있다. 단층 배양, 다른 한편으로는, 일 수있다SC의 성장과 분화를 조절하고 특히이 세포 집단을 대상으로 새로운 화합물을 발견 할 수있는 기회를 여는 신호 전달 메커니즘을 탐구 할 수있는 강력한 도구를 제공하고, 작은 분자 라이브러리의 높은 처리량 화면에 사용.

결과적으로, 재현성 뇌 그 상이한 영역에서 성인 NSCs의 배양을 생성하는 기능은 중추 신경계 (CNS)의 개발 연구로부터 신규 한 재생 의료 방법을 탐구에 이르는 연구 광범위한 애플리케이션에 사용될 수있다 . 여기에 제시된 프로토콜은 해부 성인 쥐의 뇌에서 분리 CNS의 SC와의 차별화의 잠재력을 평가하는 방법을 보여줍니다.

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프로토콜

이 작품은 Helsinski의 선언과 ARVO 동물 정책을 준수합니다. 드레스덴 대학의 동물 시설의 지침에 따라 동물 조직 수집에 사용 된 모든 관련 방법은 미행했다. 동물은 취급 및 보관 실험 동물의 사용 및 관리에 대한 독일 연방 지침에 따라, 그리고 연구는 Landesdirektion 드레스덴에 의해 승인되었습니다했다. 적절한 안락사 방법에 대한 교육 기관의 동물 정책 (IACUC 또는 다른 보드)에 문의하십시오.

특정 주식 및 시약의 작업 농도는이 프로토콜에 수반되는 시약 테이블에서 찾을 수 있습니다.

1. 배양 접시 준비

  1. 75 μg의 충분한 볼륨 코트 요리 / ㎖ 폴리-L-오르니 틴 (즉, 2 ㎖ / 잘 6 잘 플레이트의) 하룻밤 2 일전 예약 해부 현재까지 세포 배양 인큐베이터에서.
  2. 기음 폴리-L-오르니 틴 다음날 5 분 동안 PBS 3 ㎖와 잘 배 각각 세척.
  3. 최종 세척을 제거한 다음 판에 피브로넥틴 (희석 1:250, PBS에 4 ㎍ / ml)에 추가하고 하룻밤 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.
  4. 해부의 날에 피브로넥틴을 기음과 요리를 PBS로 2 배 씻는다. 여전히 해리 조직 배양을위한 준비가 될 때까지 최종 PBS가 인큐베이터에 씻어 포함 된 번호판을 반환합니다. 이 때, 조직을 도금하는 PBS 사전을 제거합니다.
  5. 최대 3 주 동안 인큐베이터를 폴리-L은-ornithinein 코팅 스토어 플레이트. 피브로넥틴으로 코팅 된 플레이트는 최대 1 주 동안 저장 될 수있다. 긴급한 경우 피브로넥틴 코팅은 거의 같은 2 시간에서 수행 될 수있다. 피브로넥틴은 변성에 취약하며 솔루션을 선동하거나 요리를 건조하게하지 않는다.

2. 해부 / 도금

  1. 이 프로토콜은 3 성인 쥐 (연령 3 ~ 6 개월)의 사용에 적용됩니다.
  2. CHIL내가 전에 쥐를 안락사에 얼음 블록을 구획 뇌.
  3. 얼음에 추가의 bFGF와 N2 매체의 5 ML을 포함하는 15 ML 팔콘 튜브를 놓습니다.
  4. 교육 기관의 수의 정책에 따라 쥐를 안락사.
  5. 머리의 중간 선 아래로 절개하여 두개골에서 뇌를 제거합니다. 신중하게 추출 할 수있는 두뇌를 허용 뼈를 벗겨 집게를 사용합니다.
  6. 얼음 차가운 PBS를 포함하는 10cm 페트리 접시에 두뇌를 놓습니다. 이것은 남아있는 머리카락과 혈액을 제거합니다. (그림 1A)
  7. 냉장 단면 블록에 두뇌를 놓습니다. (그림 1B)
  8. 그림 1C에서 그림과 같이 블록에 하나의 새로운 깨끗한 면도날을 삽입합니다.
  9. 그림 1D에 도시 된 바와 같이 처음에 두 번째 깨끗한 면도날 3mm의 꼬리를 삽입합니다.
  10. 조심스럽게 그들과 함께 관심있는 부분을 고려하여 블록에서 블레이드를 들어 올립니다.
  11. 초에게 플로트PBS에 침지시켜 블레이드 떨어져 위치시킵니다. (그림 1E)
  12. 관심 영역에서 수확 조직 # 5 집게를 사용하여 (이 예제에서 우리는 앞쪽에 접합면 (전방) ACA, 그림 층을 사용)과의 bFGF를 포함하는 1 ㎖ N2 매체를 포함하는 15 ML 원뿔 튜브에 수집합니다.
  13. 멸균 조건 하에서 프로토콜의 나머지를 계속 층류 세포 배양 후드로 튜브를 이동.
  14. 기계적 P1000 피펫의 부속 1 ㎖ 피펫 팁을 사용하여 조직을 해리. 상하 피펫 여러 번 (약 20X 초당 1 피펫 사이클의 속도로) 원뿔 튜브 (도 1G 1-3)의 아래에 대 피펫 팁의 개구를 누르면서. 용액이 균질 될 때 분쇄를 중지합니다.
  15. 이 솔루션은 어떤 큰 nondissociated 조직이 바닥에 정착 할 수 있도록 2 분 동안 앉아 수 있습니다. (그림 1G 4)
  16. homogen 수집eous 뜨는 및 N2 매체의 8.5 ML 플러스 20 NG / ML bFGF를, 500 NG / ML Dll4, 500 NG / ML ANG2, 200 nMJAK 억제제를 포함하는 원뿔 튜브에 배치합니다.
  17. 3 희석 세포 솔루션의 ML / 잘 사용하여 6 - 웰 플레이트의 3 우물에 그들을 플레이트.
  18. 37 ° C에서 5 % CO 2, 5 % O 2에 가습 세포 배양기에 플레이트를 놓습니다.

3. 데일리 케어

  1. 도금 후 24 시간을 억제제의 bFGF, ANG2, Dll4 및 JAK를 포함 N2 매체와 배양 접시에 매체를 교체합니다.
  2. 의 bFGF, Dll4, ANG2, 다음 날 JAK 억제제의 알약을 추가합니다.
  3. 미디어의 변화 10-14 일 총 요소 추가이 교류 과정을 계속합니다.

4. 분화 유도

  1. 매체를 포함 억제제의 bFGF, Dll4, ANG2 및 JAK을 철회하고 추가 요소를 포함하지 않는 N2 매체로 교체합니다.
  2. 격일 매체를 변경합니다.
  3. 10 일 이후 세포를 수정하고 면역 세포를 수행합니다.

5. 면역 세포 화학 감지

  1. 매체를 대기음 20 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드의 2 ㎖의 세포 배양 접시를 고정합니다.
  2. 5 분마다 PBS의 3 ㎖로 세척 배.
  3. 대기음 PBS는, 투과 한 후, 20 분 동안 5 % 정상 당나귀 혈청 (NDS) 및 0.1 % 트리톤 X-100을 함유하는 PBS 중 2 ㎖를 첨가하여 세포를 차단.
  4. 5 % NDS를 포함하는 PBS의 기본 항체 믹스를 준비합니다. TuJ1 (클래스 III β-튜 불린은), GFAP 및 CNPase 항체 분화 마커 트리플 염색을 위해 함께 사용될 수있는 반면 반대로 네 스틴 항체으로 SC를 식별하기 위해 사용될 수있다.
  5. 차단 솔루션을 기음과 각 웰에 차 항체 혼합물의 1.5 ML를 추가합니다. 90 분 동안 실온에서 품어.
  6. 기본 항체를 제거하고 PBS의 3 ㎖의 2 배를 씻어 5 분마다 5 % NDS를 포함하는 PBS의 3 ㎖로 1x는.
  7. Prepar전자 PBS의 보조 항체는 5 % NDS를 포함.
  8. 최종 세척을 기음과 각 웰에 차 항체 솔루션의 1.5 ML를 추가합니다. 실온에서 40 분 동안 어둠 속에서 배양한다.
  9. 차 항체 솔루션을 제거하고 새로 제조 DAPI의 얼룩 2 ㎖ (PBS 500 겨 / ㎖)를 추가합니다. 3 분 동안 품어.
  10. DAPI 솔루션을 대기음 후 5 분마다 PBS의 3 ㎖로 3 회 세척한다. 세포는 이제 형광 현미경으로 시각화 될 수있다.

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결과

신경 줄기 세포를 수확되는 관심 영역을 확인하는 것은 중요한 첫 단계이며 그것은 세포의 합류 판을 얻​​는 데 걸리는 시간의 양을 정의 할 것이다. 예를 들어, SVZ는 고전 신경성 영역이며, 따라서 신경 줄기 세포의 상대적으로 높은 비율을 갖는다. 그러나, 여기에 제시된 기술은 종종 성인기 강력한 신경성 잠재력을 갖는 것으로 인식되지 않는 다른 영역으로 사용될 수있다. 이 프로토콜의 목적을 위해, 우리는 전방 접합면 (전방 부분)을 사용했다. 세포와 파편의 일부가 도금에 침전되지만, 매체는 일반적으로 다음의 본 저작이다 세포 물질의 양의 결과로 백탁 남아있을 것이다. 24 시간의 첫 번째 매체 변경이의 대부분을 제거합니다. 광학 현미경에 의해 시각 같이, 심지어 제 1 매질 변경 후에, 혈관과 함께, 남아있는 세포 물질의 다량있을 나타난다. 의 과정을 통해다음 몇 일, 별개의 증식 세포 인구의 식민지 현미경 (그림 2A)에서 표시 될 것입니다. 이들의 bFGF, ANG2, Dll4 및 JAK 억...

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토론

성공적으로 분리, 확장, 성인의 뇌에서 신경 줄기 세포의 분화에 중요한 단계의 대부분은 표준 조직 배양 기술에 공통으로 공유됩니다. 명심하는 목적은 성인의 뇌에서 분리 NSCs의 가능한 자신의 생체 내 특성 (그림 2,1)만큼을 유지해야한다는 것입니다. 종종 필요한주의와 적절한 속도 사이에 균형을 공격해야합니다. 두개골에서 뇌의 분리와 관심은 관심 영역의 식별이 훨씬 쉬워집니다. 동물 euthanization 다음 가능한 한 빨리 조직을 제거하고, 수확 및 세탁시 뇌 감기를 유지하는 것은 그것을 유지 더 엄격한과 크게 곰팡이를 구획 스테인리스 스틸에 배치 될 때 조직의 처리에 도움이됩니다. 이것은 또한 단면 처리 과정 동안 조직의 추출을위한 잠재력을 최소화한다. 프로토콜은 ABL 인의 혜택그들은 시험관에 배치되면이 세포 생존을 증가로 전자, 신속하게 도금의 지점에 세포를 얻을 수 있습니다. 이전 절편에 적절한 조직 세척 또한 문화에 오염의 가능성을 줄일 수 있습니다...

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공개 사항

우리는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

헬름홀츠 협회의 이니셔티브 및 네트워크 기금, 그 밖의 Kroener-는 Fresenius 재단에서 부여하고, 도이치 Forschungsgemeinschaft에서 부여를 통해 이미징 및 치료 환경 대사 질환, (-이 작품은 헬름홀츠 얼라이언스 ICEMED으로 (부분적으로) 투자되었다 SFB 655 : 조직에 세포).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
6-웰 조직 배양 접시BD Biosciences353934
Poly-L-ornithineSigma-AldrichP-3655

5 mg/ml 스톡 용액 이중 증류수에서 제조(-20°C에서 몇 달 동안 안정; C) .< / p > < p > 물 중 작업 농도 0.5 mg / ml (4 °에서 1 개월 동안 안정; C).

피브로넥틴R& D Systems1030-Fn원액을 교반하지 마십시오
여과 장치Corning Life Sciences430769
DMEM/F-12Mediatech10-090-CV완전한 N2 매체 준비는 아래 참고 사항을 참조하십시오
Apo-transferrinSigma-AldrichT-2036
InsulinSigma-AldrichI-0516
PutrescineSigma-AldrichP-57801 M 재고 용액 ddH2O (20°C에서 안정; C 6 개월 동안)
나트륨 셀레 나이트시그마 - 알드리치S-5261500 &마이크로; ddH2O의 M 원액(-20에서 안정 > C 6 개월 동안)
프로게스테론시그마 - 알드리치P-8783100 &마이크로; 에탄올의 M 원액 (-20°C에서 안정; C 6개월)
페니실린/스트렙토마이신인비트로겐15140-122
인산염 완충 식염수Mediatech21-040-CV
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)R& D Systems233-FB작업 농도 20 ng/ml 
델타4 (Dll4)R& D Systems1389-D4작업 농도  500 ng/ml
Angiopoetin 2 (Ang2)R& D Systems623-AN작동 농도  500 ng/ml
JAK 억제제Calbiochem420099작동 농도 200 nM 
소 혈청 알부민Sigma-AldrichA-2058
15 및 50 ml 원뿔형 튜브Corning Life Sciences430053, 430829
기타 필요한 품목은 다음과 같습니다 : 면도날 및 집게를 포함한 일반 해부 도구, 성인 쥐 (3-6 개월; Sprague-Dawley 또는 Long Evans), CO2 중독 챔버, 세포 배양 및 인큐베이터용 층류 후드 인큐베이터(가습, 37 ° C, 5% CO2, 5% O2). 참고: 완전한 N2 배지 준비를 위해 DMEM/F-12(500ml) 한 병에 아포트랜스페린 0.05g, 인슐린 0.0125g(10mM NaOH 1ml에 갓 사전 용해), 50μ를 추가합니다. Putrescine의 l, 30 μ 나트륨 셀레 나이트의 l, 100 μ 프로게스테론 스톡의 l, 그리고 페니실린/스트렙토마이신 용액 5ml.  필요한 경우 pH를 7.2로 조정합니다. 필터 살균 및 4°C에서 보관; C는 최대 3 주 동안 빛으로부터 보호 합니다.
면역형광 시약 표
파라포름알데히드전자 현미경 과학15719
일반 당나귀 혈청(NDS)시그마-알드리치D-9663
트리톤 X-100시그마-알드리치T-8787
4,6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)시그마-알드리치D-84175 mg/ml 재고 메탄올
1차 항체 테이블
NestinChemiconMAB353

희석 계수: 1:400

종: 마우스 IgG1

Hes3Santa Cruzsc-25393

희석 계수: 1:100

종: 토끼 IgG

Sox2R& D SystemsMAB2018

희석 계수: 1:100

종: 마우스 IgG2a

CNPaseChemiconMAB326

희석 계수: 1:200

종: 마우스 IgG1

β-tubulin III (TUJ1)R& D SystemsMAB1195

희석 계수: 1:500

종: 마우스 IgG2a

신경교섬유산성 단백질(GFAP)Dako North AmericaZ0334

희석 인자 1:500

종: 토끼

2차 항체 표
Alexa    568InvitrogenA-21124

희석 인자: 1:200

종: 염소 항 마우스 IgG1

Alexa 488InvitrogenA-21131

희석 인자: 1:200

종: 염소 항 마우스 IgG2a

Cy5Jackson ImmunoResearch59883

희석 계수: 1:200

종: 염소 안티 토끼

의 용액

참고문헌

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