Neuroblast 이주는 출생 후 신경에 근본적인 이벤트입니다. 우리는 급성 뇌 조각의 시간 경과 영상을 사용하여 생체 내 출생의 일렉트로 그들의 이주 이후의 시각화하여 neuroblasts를 효율적으로 표시하기위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 비디오 추적하여 neuroblast 역학의 정량 분석에 대한 설명을 포함한다.
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방법 논문
마우스 급성 뇌 조각의 Neuroblast 마이그레이션의 생체 내 출생 일렉트로 및 시간 경과 영상
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
subventricular 영역 (SVZ)는 출생 후 뇌의 주요 신경 인성 틈새 시장 중 하나입니다. 여기에, 신경 전구 세포 증식과 후각 망울 (OB)으로 주동이의 철새 스트림 (RMS)을 따라 이동할 수 neuroblasts에 상승을 제공합니다. 이러한 장거리 이동은 OB 신생아 신경의 후속 성숙에 필요하지만,이 과정을 조절 분자 메커니즘은 아직 불분명된다. neuroblast 운동성을 조절하는 신호 전달 경로를 조사하는 신경의 기본적인 단계를 이해하는 데 도움이뿐만 아니라, 부상, 뇌졸중, 또는 변성에 의해 영향을받는 뇌의 사이트를 대상으로하도록 neuroblasts의 능력 부여, 치료 회생 가능성이 있습니다뿐만 아니라.
이 논문에서 우리는 생체 내 출생의 일렉트로 마우스 RMS의 neuroblast 마이그레이션 이후의 시간 경과 영상에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 출생 일렉트로 효율적 SVZ 조상 형질 할 수 있습니다다시 RMS를 따라 이주 neuroblasts을 생성하는 세포. 급성 뇌 슬라이스 문화의 디스크 시간 경과 현미경을 회전 공 촛점을 사용 neuroblast 마이그레이션 밀접하게 생체 조건과 유사한 환경에서 모니터링 할 수 있습니다. 또한, neuroblast 운동성 추적 및 정량적으로 분석 할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 RMS를 따라 이주 neuroblasts 레이블을 시각화하기 위해 GFP를 발현하는 플라스미드의 생체 내 출생의 전기 충격을 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 에 loxP 시스템을 사용하는 조건부 녹아웃 마우스에 shRNA를 또는 CRE 재조합 효소를 발현하는 플라스미드의 일렉트로 또한 관심의 유전자를 대상으로 할 수 있습니다. 급성 뇌 슬라이스 배양 물의 약리 조작 neuroblast 이주 다른 시그널링 분자의 역할을 조사하기 위하여 수행 될 수있다. 시간 경과 영상과 생체 전기 충격에 결합함으로써, 우리는 neuroblast 운동성을 조절하는 분자 메커니즘을 이해하고 개발에 기여할 수 있도록 노력하겠습니다소설의, 표준은 뇌의 복구를 촉진하기 위해 접근한다.
서론
포유 동물의 뇌에 새로운 뉴런 (신경)의 발생은 주로 두 지역에서 출생 후 발생, 해마 1의 치아 이랑 (dentate gyrus)의 좌우 심실과 subgranular 영역의 subventricular 영역 (SVZ). 최근 몇 년 동안 수집 된 증거는 해마와 후각 망울 메모리 기능 1-3 출생 후 신경을위한 중요한 역할을 지원합니다. 중요한 것은, 출생 후 신경은 치료 때문에 퇴행성 신경 질환과의 관계의 가능성, 뇌 4-6 부상 사이트를 마이그레이션 할 neuroblasts의 능력을 보유하고있다.
subventricular 영역 (SVZ)는 최근 중요한 신경성 틈새 시장으로 떠오르고있다. SVZ 파생 neuroblasts이 출생 후의 뇌 -1,7,8,8에서 가장 긴 마이그레이션 프로세스 만들기, 주동이의 철새 스트림 (RMS)를 통해 후각 망울 (OB)를 향해 이동한다. 포유류의 SVZ / RMS / OB 시스템이되고있다이러한 증식, 이동 및 분화 1,8 등의 신경에있는 다른 단계를 공부하는 유용한 모델. 많은 성장 인자와 세포 외 신호는 RMS를 따라 SVZ 신경과 이동을 조절하지만, 세포 내 분자 메커니즘은 지금까지 완벽하게되는
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프로토콜
이 절차는 영국 홈 오피스 규정 (동물 과학적인 절차의 법, 1986)에 따른다. 과학자들은 설립하고 자신의 기관 및 국가 동물 규제 기관에 의해 승인 된 지침을 따라야합니다.
1. 출생 에레
1.1. 유리 모세 혈관, DNA 솔루션 및 Electroporator의 준비
- DNA의 주입 뽑아 유리 모세관 (0.86 mm : 1.5 mm, ID OD)를 준비합니다. (셔터 P-97 모세관 끌어 당기는에 대한 지표 설정은 다음과 같습니다 : 열 283, 50를 당겨, 속도 (90), 시간 (50)). 약 2 μL의 부피에 해당하는 모세 혈관에 표시를합니다.
- 850 밀리 초 간격 (100 V, 50 밀리 초 ON 펄스, 850 밀리 초, 펄스 5 OFF 펄스)로, 100 V에서 5 평방 펄스, 50 밀리 초 / 펄스 electroporator의 전압을 설정합니다.
- 1-2 ㎍ / μL의 최종 농도 고순도 (OD> 1.80 280분의 260)를 희석하여 독소 프리 플라스미드 DNA독소와 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 버퍼 또는 PBS를 무료. 그것은 DNA 용액 (성공적으로 주입했을 때 염료가 뇌실에 확산한다)에 0.1 % 빠....
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결과
SVZ에서 파생 된 철새 neuroblasts의 레이블은 보통 4~8일 성공적인 일렉트로 (그림 1B) 후, RMS 함께 관찰 할 수있다. 긴 시간의 가볼만한 곳으로는 선택 될 수있다, 그러나 대부분은 OB를 입력 때문에 적은 세포는 RMS에서 찾을 수 있습니다. Neuroblasts 정도 2~3주 일렉트로 후 (도시하지 않음) OB에서 성숙 과립 세포의 전형적인 형태와 기능을 습득 시작합니다. ~ 1 시간 동안 배양 한 후, 일렉트로 마우스 새끼의 뇌 조각은 안정적으로 최대 3 ~ 4 시간 동안 몇 군데하실 수 있습니다. 이전에 23, 26를보고, neuroblasts 양적 세포 추적 (그림 4)를 사용하여 분석 할 수있다 (그림 3 및 비디오 1) 복잡한 마이그레이션 역학을 표시 할 수 있습니다.
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토론
RMS를 따라 신경 전구 세포의 효율적인 마이그레이션 기능 신경 (10)에 자신의 후속 성숙을 보장합니다. OB 향하는 신경 전구 세포의 탁월한 스트림은 인간의 초기 단계에 볼 수 있습니다 초기 출생 후의 인간의 두뇌 발달 (27)에 중요한 역할을 할 가능성이있다. 또한,이 세포는 손상과 신경 퇴행의 4,28에 의해 영향을받는 뇌의 사이트를 대상으로 할 수 있습니다. 실시간으로 neuroblast 역학에 유전자 조작의 효과를 모니터링 할 수 있다는 것은 완전히 neuroblast 이동이 안내 및 규제 방법을 이해하는 것이 필수적이된다.
여기에서 우리는 급성 뇌 슬라이스 문화의 시간 경과 공 촛점 회전 디스크 현미경과 생체 출생 일렉트로을 결합하여 SVZ 파생 neuroblast 마이그레이션을 모니터링하는 프로토콜을 설명했다. 특히, 우리는 신경 전구 세포를 마이그레이션하는 것은 SVZ에서 플라스미드 E.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
MS와 YZ는 KCL과 KCL 중국 박사 studentships에 의해 지원된다. MO는 생물 공학 및 생물 과학 연구 협의회의 박사 과정 학생이기 의해 투자되었다. 우리는 일렉트로에 귀중한 조언을 마사루 오카베 및 월 이치 미야자키 PCX-EGFP 플라스미드 및 알랭 Chedotal와 아테나 입실 랜티 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 밀리셀 | 밀리포어 | PICM0RG50 | |
| 35 mm 유리 바닥 배양 접시 | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Gey의 균형 미디어 | 시그마 | G9779-500ML | |
| 포도당, 45% | 시그마 | G8769-100ML | |
| HEPES | 시그마 | H3375-25G | |
| 펜/ Strep | GIBCO | 15140-122 | |
| FCS | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 supplement | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM(페놀 레드-프리) | GIBCO | 31053-028 | |
| 패스트 그린 | 시그마 | F7252-5G | |
| 주입용 유리 모세관 | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| 흡인기 튜브 | Sigma | A5177 | |
| Sutter P-97 모세관 풀러 | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 Square Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Platinum Tweezertrodes 7mm | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| 풋스위치 모델 1250F | 하버드 장치 | 45-0211 | |
| 전극용 젤 | Cefar Compex | 6602048 | |
| Isoflurane | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| Glue | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX 스피닝 디스크 시스템 | Perkin Elmer | Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD 카메라가 장착된 맞춤형 설정(여러 레이저 소스 사용 가능) | |
| Volocity 소프트웨어 | Perkin Elmer | 획득, 정량화, 시각화 모듈 | |
| 현미경 검사용 환경 챔버 | Solent Scientific | 맞춤형 | |
| Ti-E 도립 현미경 | Nikon | CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA 대물렌즈는 이 백서에 설명된 응용 분야에 권장됩니다 |
참고문헌
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect ....
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재인쇄 및 허가
