Method Article

Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators의 식별 및 특성화를 위한 고처리량 호환 FRET 기반 플랫폼

DOI:

10.3791/50908

⸱

December 27th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, The Scripps Research Institute, 2Worm Institute of Research and Medicine (WIRM), The Scripps Research Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

보툴리눔 신경독소 A형 경쇄(BoNT/A LC)는 운동 뉴런에 들어가 기질 SNAP-25를 절단하고 신경 전달을 방해하여 이완 마비를 일으키는 금속프로테아제입니다. 고처리량 호환 FRET 기반 분석을 활용하여 작은 분자의 대규모 라이브러리를 BoNT/A LC 효소 활성에 미치는 영향을 스크리닝할 수 있습니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

보툴리눔 신경독소(BoNT)는 숙주 운동 뉴런에 결합하고, 세포에 내재화되며, 신경전달물질 방출에 필수적인 세포 내 단백질을 절단하는 강력하고 잠재적으로 치명적인 박테리아 독소입니다. BoNT는 숙주 세포 결합 및 내재화를 매개하는 중쇄(HC)와 아세틸콜린 방출에 필수적인 세포 내 숙주 단백질을 절단하는 경쇄(LC)로 구성됩니다. 독소 결합/내재화를 억제하는 치료법은 투여 기간이 짧지만, 세포 내 LC 활성을 표적으로 하는 화합물은 투여 기간이 훨씬 더 길며, 특히 독소의 반감기가 매우 길다는 점을 감안할 때 특히 관련이 있습니다. 최근 몇 년 동안 저분자는 대형 치료제(펩타이드, 압타머 등)에 비해 세포 투과성이 증가하여 잠재적인 LC 억제제로 집중적으로 분석되었습니다. 선도물질 식별에는 종종 고처리량 스크리닝(HTS)이 포함되며, 여기서 작은 분자의 대규모 라이브러리는 치료 표적 기능을 조절하는 능력을 기반으로 스크리닝됩니다. 여기에서는 잠재적인 BoNT 억제제의 HTS에 대해 자동화할 수 있는 상용 BoNT/A LC 기질과 재조합 LC를 사용한 FRET 기반 분석에 대해 설명합니다. 또한, 후속 2차 스크리닝 또는 여러 후보 화합물의 효능을 비교하는 데 사용할 수 있는 수동 기술에 대해 설명합니다.

Introduction

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보툴리눔 신경독소 A(BoNT/A)는 현재 알려진 가장 강력한 독소(LD50 ~1 ng/kg)1로, 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)이라는 박테리아에 의해 생성되는 강력한 신경독입니다. 영향을 받은 숙주 내에서 BoNT/A는 운동 뉴런을 결합하고, 세포질로 내재화하며, 궁극적으로 아세틸콜린 외포작용에 필수적인 뉴런 단백질을 절단함으로써 신경근 접합부에서 신경 전달을 방해합니다. 일단 뉴런 안으로 들어가면, BoNT/A는 몇 달 동안 지속될 수 있다2. 아세틸콜린 방출을 장기간 억제하면 정상적인 근육 수축을 방해하고 이완 마비를 초래하며, 심한 경우 심장 및/또는 호흡 부전을 유발할 수 있습니다. 매우 강력하고, 생산이 용이하며, 숙주 내에서 장기적인 영향을 미치기 때문에 CDC는 모든 BoNT 혈청형을 고위험 생물 테러 인자로 분류했습니다.

독소의 작용 메커니즘은 뉴런 표면 수용체에 대한 결합, 수용체 매개 세포작용(receptor-mediated endocytosis)을 통한 세포 흡수, 뉴런 세포질로의 전좌 등 수많은 단계를 포함합니다. BoNT/A는 무거운 사슬과 가벼운 사슬의 두 사슬로 구성되며 두 사슬 모두 독성에 필요합니다. 중쇄(HC)는 결합 및 전좌 도메인을 포함하는 반면, 경쇄(LC)는 엔도솜에서 세포질로 전위되는 아연 의존성 금속프로테아제입니다. 일단 세포질 내부로 들어가면 LC/A 금속프로테아제는 내부 세포질막에 국한되어 막으로 결합된 숙주 단백질 SNAP-25를 절단합니다. SNAP-25는 아세틸콜린 외세포작용(참고문헌 3에서 검토)에 중요한 역할을 하는 SNARE(Soluble N-Ethylmaleimide-Sensitive Factor Attachment Protein Receptor) 단백질 계열의 구성원입니다. SNAP-25의 LC/A 절단은 아세티콜린 신경전달물질 방출을 억제하고 근육 수축을 손상시키는 SNARE 복합 기능을 손상시킵니다.

현재 보툴리누스 중독 치료는 제한적이며 종종 말 중화 항체4의 투여를 포함합니다. 그러나 독소가 뉴런으로 빠르게 내재화되기 때문에 항체는 투여 시간이 좁습니다. 따라서 많은 연구자들은 BoNT/A LC가 더 나은 치료 표적이 될 수 있다고 믿고 있습니다. LC는 아연 의존성 메탈로프로테아제이기 때문에 LC/A 활성을 억제하는 한 가지 방법은 활성 부위 아연 이온을 킬레이트화하는 화합물을 개발하는 것이었습니다. 예를 들어, 하이드록사메이트 화합물은 활성 부위 아연을 킬레이트화하고 우수한 시험관 내 효능을 가지고 있습니다(현재까지 최고의 BoNT/A LC 소분자 억제제의 Kee는 77nM임)5. 그러나 많은 소분자는 낮은 수성 용해도, 빠른 대사 및/또는 높은 세포 독성을 포함한 생체 외 또는 생체 내에서 다양한 문제로 인해 치료제로 발전하지 못합니다. 따라서 약리학 및 약동학 특성이 개선된 새로운 화합물이 필요합니다. 저분자 화합물 식별에는 새로운 스캐폴드를 식별하기 위한 고처리량 스크리닝(HTS)이 포함되는 경우가 많습니다. BoNT/A LC 활성 스크리닝을 위한 초기 방법은 시간이 많이 걸리고 HTS 응용 분야에 적합하지 않은 짧은 펩타이드 기질 절단의 HPLC 검출을 기반으로 했습니다6-8. 그 후, Schmidt와 동료들9은 마이크로타이터 플레이트에 공유 결합으로 부착된 플루오레세인 표지 펩타이드 기질을 활용하는 고처리량 BoNT/A LC 활성 분석을 개발했습니다. BoNT/A LC는 기질을 절단하고 플루오레세인을 방출하며, 이는 형광계로 정량화할 수 있습니다. 이 분석법의 플레이트 형식을 사용하면 수많은 화합물을 동시에 스크리닝할 수 있습니다. 그러나 이 분석에서는 합성 펩타이드를 플루오레세인으로 라벨링하고 분석판을 유도체화된 기질 분자로 코팅해야 하는데, 이는 번거로운 기술입니다. 저농도에서 BoNT/A LC 활성을 검출하기 위한 훨씬 더 간단한 방법은 나중에 Schmidt 등에 의해 설명되었으며, 여기서 일련의 형광 기질을 사용하여 BoNT LC 활성을 실시간으로 모니터링했습니다10. 문헌에 설명된 추가 기술에는 미처리 추출물에서 BoNT 활성을 검출하고 정량화하기 위한 공진 후 탈분극 에너지 전달 기반 분석이 포함됩니다. 이 방법은 고처리량 응용 분야10,11에 사용할 수 있지만 형광 공명 에너지 전달(FRET) 및 편광 신호를 측정하기 위해 정교한 장비가 필요합니다. 마지막으로, BoNT 중독에 대한 여러 세포 기반 모델이 보고되었으며(참고 문헌11에서 검토됨) 이를 통해 연구자들은 세포 독성, 세포 투과성 및 안정성을 포함하여 앞서 언급한 화합물의 종종 제한적인 특성을 연구할 수 있습니다. 그러나 대부분의 기존 세포 기반 분석은 HTS에 적합하지 않으며 노동과 시간이 많이 소요됩니다.

여기에서는 상업적으로 이용 가능한 FRET 기반 BoNT/A LC 기판을 활용하는 HTS 방법에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 기질은 SNAP-25 분할 서열을 기반으로 하며 말단 형광단과 담금질제를 포함하는 합성 13-mer 펩타이드입니다. BoNT/A 분열은 형광단과 담금질제를 분리하여 FRET를 없애고 측정된 형광을 증가시키며, 이는 형광계 플레이트 리더에서 지속적으로 측정할 수 있습니다. 이 분석은 새로운 종류의 BoNT/A LC 억제제를 식별하거나 이전에 확인된 화합물5,12-15의 상대적 효능을 결정하기 위해 당사 및 다른 실험실에서 일상적으로 사용됩니다. 이 분석은 단순성, 자동화 가능성, 저렴한 재료 비용 및 수많은 화합물을 동시에 스크리닝할 수 있는 기능으로 인해 HTS에 적합합니다(참고 문헌16; Caglič et al., 제출됨; Bompiani et al., in preparation)을 참조한다. HTS 외에도 이 분석은 화합물의 IC50 값(BoNT/A LC 활성의 50%를 억제하는 데 필요한 농도)을 측정하여 화합물의 상대적 효능을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 분석은 96-well 형식(프로토콜 텍스트의 Manual Screening 섹션)으로 수동으로 수행하거나 HTS(Protocol Text의 Automated Operation 섹션)를 위해 384-well 형식으로 자동화할 수 있습니다.

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Protocol

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수동 스크리닝 또는 IC50 결정

이 프로토콜은 화합물의 희석 시리즈를 준비하여 화합물의 상대적 효능(IC50 값)을 측정하거나 단일 농도에서 저분자 억제제를 수동으로 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다.

1. 버퍼, 시약 및 필요한 기기 준비

  1. 50ml의 분석 버퍼(40mM HEPES, pH 7.4 및 0.01% Tween-20)를 준비하고 필터 멸균합니다. 버퍼는 실온(RT)에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.
  2. 재조합 보툴리눔 신경독/경쇄(LC/A(1-425))17의 70 nM 작업 희석액을 분석 완충액에 준비하고 부드럽게 와류로 가열한 다음 얼음에 보관합니다. 각 화합물을 테스트하려면 최소 120μl의 LC/A 작업 희석이 필요합니다.
  3. 10% DMSO를 함유한 분석 버퍼에서 7μM FRET 기반 BoNT/A LC 기판 작업 희석액을 준비합니다. 먼저 기질의 5mM 원액을 100% DMSO의 적절한 부피로 희석한 다음 부드럽게 혼합하면서 천천히(적하 방향으로) 분석 버퍼를 추가합니다. 호일로 싸서 얼음에 보관하십시오. 각 화합물의 테스트에는 최소 130μl의 기판 작업 희석이 필요합니다.
  4. 형광 마이크로타이터 플레이트 리더를 구성하여 10초 동안 중간 속도로 플레이트를 흔든 다음 RT에서 90분 동안 5분마다(키네틱 모드) 각각 490nm 및 523nm의 여기 및 방출 파장에서 형광을 모니터링합니다. 산물 형성(즉, 형광의 증가)은 이 기간 동안 선형입니다(그림 1A).

2. 복합 희석 시리즈의 준비

  1. 화합물 농도 범위(즉, 희석 계열의 희석 수 및 희석 계수)를 결정하고, 농도 범위는 최적의 곡선 맞춤을 보장하기 위해 예상 IC50 값을 기반으로 선택됩니다. 알 수 없는 IC50을 가진 화합물의 경우 희석되지 않은 화합물 스톡을 가장 높은 화합물 농도로 사용하십시오.
  2. 튜브에 적절한 화합물 이름과 농도를 표시합니다.
  3. 모든 튜브에 100% DMSO를 분취하여 복합 직렬 희석을 준비합니다. 최소 2μl의 최종 희석 부피가 권장되며, 여기서 각 농도의 1μl는 분석 플레이트에서 웰당 사용됩니다. 예를 들어, 표준 1:3 희석 시리즈에서는 튜브당 2μl의 화합물과 4μl DMSO를 혼합해야 합니다.
  4. 화합물 및 와류의 연속 희석액을 준비하거나 각 희석 사이에 수동으로 완전히 혼합하십시오. 각 희석 사이에 피펫 팁을 교체하십시오. 표준 1:3 희석 시리즈의 경우, 희석 시리즈의 첫 번째 튜브에 있는 DMSO 4μl에 희석되지 않은 화합물 2μl를 첨가하고 잘 혼합합니다. 새 피펫 팁을 사용하여 첫 번째 희석액 2μl를 제거하고 두 번째 튜브에 DMSO 4μl를 추가합니다. 잘 섞는다. 나머지 희석액에 대해 반복합니다. 화합물 농도가 정확한지 확인하기 위해 화합물 희석액을 잘 혼합하십시오.
  5. 컴파운드 튜브를 덮고 RT에 따로 보관합니다.

3. 플레이트 준비 및 스포팅 (표 1)

  1. 바닥이 평평하고 불투명한 검은색 96웰 플레이트를 구합니다. 표 1에서 권장하는 플레이트 설정을 참조하십시오. 여기서 각 화합물 희석 시리즈는 96웰 플레이트의 행으로 포맷되어 있습니다. 각 화합물 희석액 1 μl를 각 해당 웰(웰 1-9)의 바닥에 직접 수동으로 분배합니다. 테스트할 화합물의 최고 농도 1μl를 well 11(화합물 고유 형광 제어)으로 분배합니다.
  2. 알려진 강력한 억제제 1μl를 well 12(positive control)에 수동으로 분주하고 1μl 100% DMSO를 well 10(negative control)에 수동으로 분주합니다.
  3. 자동화된 피펫터를 사용하여 웰 1-10 및 12(복합 희석 및 양성 대조군) 측면에 79μl의 분석 완충액을 분주하고 웰 11(복합 고유 형광 대조군) 측면에 89μl를 분배합니다. 화합물이 있는 우물 바닥에 팁을 만지지 않도록 하여 우물을 교차 오염시키지
    4. 않도록 하십시오.
  4. LC/A 작업 희석액을 와류로 가열하고 자동 피펫터를 사용하여 웰 11(복합 고유 형광 제어)을 제외한 각 웰의 측면에 10μl를 추가합니다. 접시를 부드럽게 두드려 추가된 모든 효소가 웰 바닥으로 가
    5. 도록 합니다.
  5. 플레이트를 부드럽게 섞고, 덮고, RT에서 5분 동안 배양합니다. 이 incubation은 기질을 추가하기 전에 화합물이 LC/A에 결합할 수 있는 사전 평형 단계를 제공합니다.

4. 기판 첨가 및 형광 측정

  1. BoNT/A LC 기질을 부드럽게 와류로 회전시키고 자동 피펫터를 사용하여 각 웰의 다른 쪽에 10μl의 기질을 추가합니다. 효소가 이전에 첨가된 곳의 반대쪽 웰 측면에 기질을 추가해야 합니다.
  2. 플레이트를 부드럽게 두드려 시약을 혼합하고 즉시 플레이트 리더에 넣고 1.4단계에서 이전에 지정한 설정으로 형광 측정을 시작합니다.
  3. 효소 속도는 반응의 선형 기간 동안의 시간 대 상대 형광 단위(RFU)를 그래프로 표시하여 생성된 선의 기울기에서 계산됩니다.

표 1.제안된 분석 플레이트 레이아웃.

<테이블 테두리="1"> 글쎄요 # 글쎄요 설명 화합물 분석 버퍼 기판 LC (영어) 디엠소 1 개 복합 용량 1 1 μl 79 μL 10 μl 10 μl --- 2 개 복합 용량 2 1 μl 79 μL 10 μl 10 μl --- 3 복합 용량 3 1 μl 79 μL 10 μl 10 μl --- 4 개 복합 용량 4 1 μl 79 μL 10 μl 10 μl --- 5 개 복합 용량 5 1 μl 79 μL 10 μl 10 μl --- 6 복합 용량 6 1 μl 79 μL 10 μl 10 μl --- 7 복합 용량 7 1 μl 79 μL 10 μl 10 μl --- 8 복합 용량 8 1 μl 79 μL 10 μl 10 μl --- 9 개 복합 용량 9 1 μl 79 μL 10 μl 10 μl --- 10분 네거티브 컨트롤
(100% LC 활성) --- 79 μL 10 μl 10 μl 1 μl 11세 복합 고유 형광 제어 1 μl 89 μl 10 μl --- --- 12세 포지티브 컨트롤
(0% LC 활성) 1 μl 79 μL 10 μl 10 μl ---

고처리량 스크리닝을 위한 자동 작동

5. 버퍼, 시약, 복합 플레이트, 바코드 및 필요한 기기 준비

  1. 밀봉된 스톡 컴파운드 플레이트를 실온에서 최소 1시간 동안 해동합니다.
  2. 분석 버퍼(40mM HEPES, pH 7.4 및 0.01% Tween-20)의 500ml(또는 스크리닝할 화합물 수에 따라 그 이상)를 준비하고 필터 멸균합니다. 여과된 분석 버퍼는 RT에서 수개월 동안 보관할 수 있습니다.
  3. 재조합 BoNT/A LC(1-425)의 8.75nM 작업 희석액을 분석 버퍼, 와류에서 준비하고 얼음에 보관합니다. 저용량 384웰 플레이트의 각 웰에는 8μl가 필요합니다. 10-15% 초과량 또는 약 3.7ml 또는 각 저용량 384웰 플레이트를 준비합니다.
  4. 10% DMSO를 함유한 분석 버퍼에서 3.5μM FRET 기반 BoNT/A LC 기판 작업 희석액을 준비합니다. 먼저 기질의 5mM 원액을 100% DMSO의 적절한 부피로 직접 희석한 다음, 부드럽게 혼합하면서 천천히 (적하 방향으로) 분석 버퍼를 추가합니다. 호일로 싸서 얼음에 보관하십시오. 저용량 384웰 플레이트의 각 웰에는 2μl가 필요합니다. 각 저용량 384웰 플레이트에 대해 10-15% 초과량 또는 약 1ml를 준비합니다.
  5. 각 검은색 384웰 저용량 마이크로타이터 플레이트[분석 플레이트]에 대한 바코드를 준비하고 바코드 스캐너가 판독할 수 있는 플레이트 측면에 라벨을 직접 부착합니다. 라벨이 플레이트 측면 위로 확장되지 않도록 하거나 플레이트 취급 및 적재에 방해가 될 수 있습니다. 번호판을 숫자 순서대로 쌓고 따로 보관하십시오. 상판을 덮습니다. 이 단계는 선택 사항이지만 여러 플레이트를 사용할 때 해당 화합물에 대한 결과를 쉽게 추적할 수 있습니다.
  6. 해동되고 밀봉된 스톡 컴파운드 플레이트를 200 x g에서 실온에서 30초 동안 원심분리합니다. 플레이트 씰을 조심스럽게 제거하고 남아 있는 접착제를 제거한 다음 깨끗한 플라스틱 뚜껑으로 플레이트를 덮어 증발을 방지합니다. 플레이트 표면에 접착제가 있으면 자동 뚜껑 이송 및 플레이트 적재를 방해할 수 있습니다. 덮인 플레이트를 액체 처리기에 부착된 호텔에 놓습니다. 플레이트를 덮지 않은 상태로 두지 마십시오. 그렇지 않으면 증발이 발생합니다.
  7. 적층형 형광 마이크로타이터 플레이트 리더를 구성하여 RT에서 3-6 사이클 동안 30분마다(키네틱 모드) 각각 490nm 및 523nm의 여기 및 방출 파장에서 각 분석 플레이트의 형광을 판독합니다.

6. 핀 툴 준비

  1. 384헤드 핀 도구에 뒤틀림, 쪼개짐 또는 큰 파편을 포함한 이상이 있는지 육안으로 검사합니다.
  2. 3개의 개별 트레이에 약 1인치의 100% 메탄올(HPLC 등급), 100% 이소프로판올(HPLC 등급) 및 초순수에 희석된 핀 도구 세척 용액을 채웁니다.
  3. 액체 처리기의 세척 스테이션을 100% DMSO로 채웁니다.
  4. 트레이에 깨끗하고 새 압지 2-3장을 쌓습니다. z축에서 로봇을 보정하여 핀이 압지와 접촉하지만 구멍을 뚫지 않도록 하는 것이 중요합니다.
  5. 세탁 후 핀을 건조시키기 위해 작업 영역에 팬 부착물을 고정합니다.
  6. 핀 도구를 리퀴드 핸들러의 로봇 암에 부착하고 DMSO에 담그고, 압지에서 건조하고, 세척 용액에 2분 동안 담그고, 압지에서 건조하고, 이소프로판올에 담그고, 압지에서 건조하고, 메탄올에 담그고, 압지에서 건조하고, 마지막으로 팬에서 건조하여 핀을 사전 세척합니다.

7. 소량 액체 디스펜서의 준비

  1. 저용량(1-10 μl) 카세트를 액체 분화기에 부착하고 폐기물 라인을 적절한 용기에 연결합니다.
  2. 카세트의 디스펜싱 노즐을 육안으로 검사하고 뒤틀리거나 찢어지거나 막히지 않았는지 확인하십시오. 강수나 파편이 액체 분포에 영향을 미치므로 채널과 노즐을 깨끗하게 유지하는 것이 중요합니다.
  3. 초순수 30ml, 70% 에탄올 30ml, 초순수 30ml를 폐기물 용기에 직접 연결하여 채널을 프라이밍합니다.
  4. 소량의 384웰 분석 플레이트를 액체 디스펜서에 배치하고 각 웰에 알려진 양의 물을 추가합니다. 육안으로 검사하여 각 웰이 올바른 부피를 받고 있는지, 웰 사이에 유출이나 용액이 분배되지 않았는지 확인합니다.
  5. 튜브에 공기를 약 5초 동안 프라이밍하여 물을 제거하고 채널을 건조시킵니다.

8. BoNT/A Light Chain을 Assay Plate에 분배

  1. 액체 디스펜서 흡입 라인을 BoNT/A LC 작업 용액에 담그고 공기를 제거하도록 프라이밍한 다음 저용량 384웰 분석 플레이트의 각 웰에 8μl를 분배합니다. 플레이트는 액체 처리기의 작업 영역에 수동으로 배치하거나 부착된 플레이트 호텔을 사용하여 자동으로 배치하고 다시 쌓을 수 있습니다.
  2. 각 플레이트를 깨끗한 플라스틱 뚜껑으로 덮고 액체 처리기에 부착된 플레이트 호텔의 다른 열에 쌓습니다. 플레이트를 밀봉하지 않은 상태로 보관하지 마십시오. 그렇지 않으면 증발이 발생합니다.
  3. 초순수 30ml, 70% 에탄올 30ml, 초순수 30ml를 다시 폐기물 용기에 직접 연결하여 액체 디스펜서를 청소합니다.
  4. 채널을 건조시키기 위해 약 5초 동안 튜브에 공기를 주입합니다.

9. 분석 플레이트에 화합물 스탬핑

  1. Liquid Handler 플랫폼에서 복합 플레이트, 분석 플레이트 및 세척 용액이 있는 용기를 위한 영역을 할당합니다.
  2. 리튬-핸들러를 프로그래밍하여 컴파운드 플레이트와 분석 플레이트를 지정된 위치에 배치하고 스탬핑하기 전에 플레이트 뚜껑을 제거합니다.
  3. 8μl의 BoNT/A LC가 포함된 분석 플레이트에 화합물 50nl을 직접 스탬프합니다. 스탬핑 프로그램을 교정할 때 핀이 물에 잠겨 있는지 확인하되 분석 플레이트의 바닥을 긁지 마십시오. 100% DMSO에 화합물을 첨가하면 효소 변성이 분산될 때 국소 변성 영역이 생성될 수 있습니다. 따라서 DMSO만 있는 대조군과 처리되지 않은 대조군(즉, DMSO를 첨가하지 않은 효소)을 비교하여 효소 변성 수준을 평가할 때 주의를 기울여야 합니다.
  4. DMSO에 담그고, 블로팅 페이퍼에 건조하고, 이소프로판올에 담그고, 블로팅 페이퍼에 건조하고, 메탄올에 담그고, 블로팅 페이퍼에 건조하고, 마지막으로 팬에서 건조하여 각 플레이트 뒤에 핀을 청소합니다.
  5. 화합물이 효소로 분석 플레이트에 찍힌 후 스톡 복합 플레이트와 분석 플레이트를 별도로 쌓습니다. 증발을 방지하기 위해 스택의 상단 분석 플레이트를 덮고 따로 보관하십시오. RT에서 최소 5분 동안 화합물과 함께 LC를 배양해야 합니다. 많은 수의 플레이트를 스탬핑할 때 더 긴 배양 시간을 사용할 수 있습니다.

10. 분석 플레이트에 기판 분배

  1. 액체 처리기의 흡입 라인을 BoNT/A LC 기판 작업 용액에 담그고 빛으로부터 보호하십시오. 디스펜싱 노즐이 건조하고 막히지 않았는지 확인하십시오. 채널을 프라임하여 모든 기포를 제거합니다.
  2. 분석 플레이트를 적층하지 않고 기질의 작업 희석 2μl를 각 웰에 분배합니다. 기판이 각 웰에 직접 분배되고 있는지 확인하십시오. 플레이트를 쌓고 첫 번째 플레이트 위에 빈 분석 플레이트 1개를 놓고 스택의 바닥 플레이트 아래에 빈 플레이트 1개를 놓아 플레이트 리더에서 판독 및 재적재하는 동안 증발을 방지합니다.

11. 형광 측정

  1. 분석 플레이트 스택을 즉시 형광 플레이트 리더에 로드합니다.
  2. 5.7단계에서 이전에 지정한 설정으로 형광 측정을 시작합니다. 각 화합물에 대한 분석 속도는 시간 경과에 따른 상대 형광 단위(RFU)의 그래프에서 계산됩니다. 억제되지 않은 속도를 얻기 위해 음의 대조군(DMSO)을 포함하는 것이 중요합니다. 알려진 억제제를 사용한 양성 대조군도 각 플레이트에 추가할 수 있습니다. 단일 시점의 대표적인 출력이 그림 2에 나와 있습니다.

12. 정리

  1. 롤러를 사용하여 각 복합 스톡 플레이트를 호일 씰로 밀봉하고 -80 °C에서 보관합니다.
  2. 각 분석 플레이트를 판독한 후 플레이트, 생물학적 위험 폐기물에 남아 있는 LC/A 또는 기질 희석액을 폐기합니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRET 기반 BoNT/A LC 분석은 알려진 억제제를 특성화하거나 소규모 라이브러리를 스크리닝하기 위해 저처리량 방식으로 수동으로 수행할 수 있으며, 또는 새로운 BoNT/A LC 억제제를 식별하기 위해 대규모 라이브러리에서 고처리량 스크리닝(HTS)을 위해 프로토콜을 축소 및 자동화할 수 있습니다. 취한 접근 방식에 관계없이 BoNT/A LC를 기질과 함께 배양할 때 시간이 지남에 따라 형광의 증가를 관찰해야 합니다(그림 1A는 시간 경과에 따른 형광의 대표적인 플롯을 보여줍니다). 화합물의 연속 희석을 테스트하면 다양한 기울기를 가진 일련의 라인을 얻을 수 있는 경우가 많습니다(그림 1B). 여기에 설명된 플레이트 레이아웃의 음, 10은 차량 전용(DMSO)이 추가됨에 따라 네거티브 컨트롤 역할을 합니다. 이 반응의 속도는 "100% 효소 활성"(또는 억제되지 않은 활성)으로 정의되며, 화합물이 존재할 때의 속도는 상대 속도 또는 퍼센트 억제를 얻기 위해 이 속도...

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Discussion

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여기에 설명된 FRET 기반 BoNT/A LC 분석은 BoNT/A LC 활성을 조절하는 소분자를 식별하고 특성화하는 매력적인 방법을 나타냅니다. 분석의 용액 기반 특성으로 인해 이 프로토콜은 프로토콜 텍스트의 자동화된 작동 섹션에 설명된 고처리량 스크리닝에 적합합니다. Z-인자는 HTS 캠페인에 대한 분석의 적합성을 결정하는 데 자주 사용됩니다18. Z = 1 – 3(σp + σn)/(μp - μn)으로 결정되면 Z-계수 1이 이상적이고 0.5-1 사이가 우수하며 0.5 미만이 한계입니다. 여기에 설명된 HTS 프로토콜의 Z-인자는 0.89입니다(양성 및 음성 대조군의 표준 편차는 각각p = 6.67 RFU/min 및 σn = 0.788 RFU/min σ입니다. 음성 및 양성 대조군의 평균 속도는 각각p = 196.1 RFU/min 및 μn = -7.67...

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 작업은 미국 국립보건원(National Institutes of Health, AI082190에서 T.J.D.)과 캘리포니아 재생 의학 연구소(California Institute for Regenerative Medicine)의 보조금(TB1-01186 및 CL1-00502)의 지원을 받았습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HEPESTeknovaH1021
Tween-20Fisher ScientificBP337-100
메탄올 (HPLC 등급)Sigma-Aldrich34860
이소프로판올 (HPLC 등급)Sigma-Aldrich650447
96-well Black assay plateCostar3915
384-well Low-volume black assay plateGreiner788076
SNAPtide FITC/Dabcyl 기판목록 Biological Laboratories521FRET 기반 BoNT/A LC 기판
핀 세척 용액V& P ScientificVP 110
보푸라기 없는 압지V& P ScientificVP 540DB
Biomek 씰 및 샘플 알루미늄 호일 뚜껑Beckman Coulter538619

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schantz, E. J., Johnson, E. A. Properties and use of botulinum toxin and other microbial neurotoxins in medicine. Microbiol. Rev. 56, 80-99 (1992).
  2. Sloop, R. R., Cole, B. A., Escutin, R. O. Human response to botulinum toxin injection: type B compared with type A. Neurology. 49, 189-194 (1997).
  3. Willis, B., Eubanks, L. M., Dickerson, T. J., Janda, K. D. The strange case of the botulinum neurotoxin: using chemistry and biology to modulate the most deadly poison. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 47, 8360-8379 (2008).
  4. Tacket, C. O., Shandera, W. X., Mann, J. M., Hargrett, N. T., Blake, P. A. Equine antitoxin use and other factors that predict outcome in type A foodborne botulism. Am. J. Med. 76, 794-798 (1984).
  5. Capek, P., et al. Enhancing the Pharmacokinetic Properties of Botulinum Neurotoxin Serotype A Protease Inhibitors Through Rational Design. ACS Chem. Neurosci. 2, 288-293 (2011).
  6. Schmidt, J. J., Bostian, K. A. Proteolysis of synthetic peptides by type A botulinum neurotoxin. J. Protein Chem. 14, 703-708 (1995).
  7. Schmidt, J. J., Bostian, K. A. Endoproteinase activity of type A botulinum neurotoxin: substrate requirements and activation by serum albumin. J. Protein Chem. 16, 19-26 (1997).
  8. Schmidt, J. J., Stafford, R. G., Bostian, K. A. Type A botulinum neurotoxin proteolytic activity: development of competitive inhibitors and implications for substrate specificity at the S1' binding subsite. FEBS Lett. 435, 61-64 (1998).
  9. Schmidt, J. J., Stafford, R. G., Millard, C. B. High-throughput assays for botulinum neurotoxin proteolytic activity: serotypes A, B, D, and F. Anal. Biochem.. 296, 130-137 (2001).
  10. Schmidt, J. J., Stafford, R. G. Fluorigenic substrates for the protease activities of botulinum neurotoxins serotypes A, B, and F. Appl. Environ. Microbiol. 69, 297-303 (2003).
  11. Pellett, S. Progress in cell based assays for botulinum neurotoxin detection. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 364, 257-285 (2013).
  12. Boldt, G. E., et al. Synthesis, characterization and development of a high-throughput methodology for the discovery of botulinum neurotoxin a inhibitors. J. Comb. Chem. 8, 513-521 (2006).
  13. Henkel, J. S., et al. Catalytic properties of botulinum neurotoxin subtypes A3 and A4. Biochemistry. 48, 2522-2528 (2009).
  14. Joshi, S. G. Detection of biologically active botulinum neurotoxin--A in serum using high-throughput FRET-assay. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 65, 8-12 (2012).
  15. Smith, G. R., et al. Reexamining hydroxamate inhibitors of botulinum neurotoxin serotype A: extending towards the beta-exosite. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 3754-3757 (2012).
  16. Eubanks, L. M., et al. An in vitro and in vivo disconnect uncovered through high-throughput identification of botulinum neurotoxin A antagonists. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 2602-2607 (2007).
  17. Baldwin, M. R., Bradshaw, M., Johnson, E. A., Barbieri, J. T. The C-terminus of botulinum neurotoxin type A light chain contributes to solubility, catalysis, and stability. Protein Expr. Purif. 37, 187-195 (2004).
  18. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  19. Capkova, K., Hixon, M. S., McAllister, L. A., Janda, K. D. Toward the discovery of potent inhibitors of botulinum neurotoxin A: development of a robust LC MS based assay operational from low to subnanomolar enzyme concentrations. Chem. Commun. , 3525-3527 (2008).
  20. Pires-Alves, M., Ho, M., Aberle, K. K., Janda, K. D., Wilson, B. A. Tandem fluorescent proteins as enhanced FRET-based substrates for botulinum neurotoxin activity. Toxicon. 53, 392-399 (2009).

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