이 문서에서는 우심실의 크기와 생쥐의 폐 고혈압의 심 초음파 평가를위한 프로토콜을 제공합니다. 응용 프로그램은 유전자 변형과 심장 근육 병증 및 폐 혈관 질환의 독소 유발 마우스 모델에서 표현형 결정 및 직렬 평가를 포함.
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이 논문에서
요약
초록
형질 전환 및 폐동맥 고혈압 (PAH)의 독성 모델은 널리 PAH의 병태 생리를 연구하고 잠재적 인 치료를 조사하는 데 사용됩니다. 질병의 동물 모델을 만드는 데 관련된 비용과 시간을 감안할 때, 그것은 연구자들은 정확하게 질병의 형질 발현을 평가하는 도구를 가지고하는 것이 중요합니다. 우심실 부전이 폐 고혈압의 중요한 표현이다. 심 초음파 설치류 모델에서 우심실 기능의 비 침습적 평가의 의지와 같은 도구를 사용하는 누구에 인간에게 분명 번역의 장점이 있습니다. PAH의 쥐 모델에 게시 된 심 초음파 검사 프로토콜이 부족하다.
그러나,이 프로토콜은 폐 혈관 또는 오른쪽으로 심장에 영향을 미치는 모든 질병에 적용 할 수있다,이 문서에서는, 우리는 RV 및 지배적 인 부정적인 BMPRII 돌연변이와 PAH의 마우스 모델에서 폐 혈관 기능을 평가하기위한 프로토콜을 설명합니다. 우리동물 준비, 이미지 수집 및 박출량, 심 박출량 및 폐동맥 압력의 추정 혈류 역학적 계산에 대한 자세한 설명을 제공합니다.
서론
높은 폐 압력과 우심실 (RV) 장애 동물 모델과 폐동맥 고혈압 (PAH)와 인간의 환자에서 폐 혈관 질환의 특징입니다. PAH의 형질 전환 및 독성 (예 monocrotaline 또는 저산소증) 모델은 널리 PAH의 병태 생리를 연구하고 잠재적 인 치료를 조사하는 데 사용됩니다. 질병의 동물 모델을 만드는 데 관련된 비용과 시간을 감안할 때, 그것은 연구자들은 정확하게 질병의 형질 발현을 평가하는 도구를 가지고하는 것이 중요합니다.
심 초음파 설치류 모델 1,2에서 심실 기능의 비 침습적 평가의 의지입니다. 심 초음파 검사는 같은 도구를 사용하는 누구에 인간에게 분명 번역의 장점이 있습니다. 또한, 일부 유전 모델은 불완전한 penetrance 3을 나타내고; 간접적으로 영향을받는 동물을 식별하는 능력은 귀중한 시간과 자원을 절약. disea의 비 침습적 평가동물을 희생하지 않고 자체의 심각도는 연구원이 순차적으로 조사 요법의 효과를 연구 할 수 있습니다. 이 번역 요법은 인체에 실험 4,5에 진출 할 수있는 신속성 주어진 특히 중요합니다.
인간, RV의 크기와 폐 고혈압의 심 초음파 평가 인해 retrosternal 위치와 RV 6의 불규칙한 형태에 특히 도전이다. 설치류 모델은 작은 크기의 추가 도전과 매우 빠른 심박수 (300 ~ 700 비트 / 분)가있다. 대부분의 설치류 영상이 마취 7,8에서 수행 불구하고 높은 프레임 속도와 작은 센서를 포함하여 최근의 진보는 이미지 품질과 몇 가지 실험 프로토콜에도 허용 의식 이미지를 개선했습니다. PAH의 쥐 모델에서 심장 초음파 검사의 우수한 실험 프로토콜은 MRI 및 침입 혈류 역학 1,9 모두에 대해 설명하고 검증되었다. 그러나 출판 심 초음파PAH의 쥐 모델에서 프로토콜이 부족하다.
이 문서에서는, 우리는 지배적 인 부정적인 BMPRII 돌연변이 및 폐동맥 밴딩 후 고립 된 RV의 후 부하의 모델 PAH의 마우스 모델에서 RV 및 폐 혈관 기능을 평가하기위한 프로토콜을 설명하지만,이 프로토콜에 영향을 미치는 모든 질병에 적용 할 수있다 폐 혈관 또는 오른쪽으로 마음. 우리는 동물의 준비와 RV의 크기와 기능뿐만 아니라, 주 폐동맥 (PA) 크기의 상세한 평가에 대해 설명합니다. 우리는 또한 박출량 및 심 박출량을 추정하는 데 필요한 기술과 계산을 보여줍니다. 기술적 인 한계는 폐 압력의 정확한 도플러 추정을 배제하지만, 우리는 PA 압력을 추정하기 위해 잘 검증 된 사람의 대리, 폐동맥 가속 시간을 적용했습니다.
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프로토콜
1. 장비 준비
- 결함에 대한 초음파 변환기를 검사합니다. 사용되는 장비에 따라,이 단계는 불필요 할 수도있다.
- 기포가 관찰되는 경우, 변환기 헤드의 우측에 위치한 나사를 제거하고, 26 G 바늘 구멍을 통해 멸균을 추가한다. 트랜스 듀서 헤드 내부에 기포가 일반적이다. 그들은 품질의 이미지의 인수를 방해합니다.
- 누수 또는 구멍의 프로브를 포함하는 멤브레인을 확인합니다. 필요한 경우 교체합니다.
- 소프트웨어를 열고 프로브를 초기화합니다.
- 적절한 트랜스 듀서와 함께, 드롭 다운 메뉴에서 심장 패키지를 선택합니다. "초기화"를 클릭합니다. 35g보다 큰 쥐 35 g의 15-45 MHz의 프로브에서 마우스의 경우 20 ~ 60 MHz의 프로브를 사용합니다.
- 인구 통계 화면에서 조작, 동물 및 날짜를 선택하고 "시작"을 선택합니다.
2. 마우스 프레파라트마취, 머리 제거, 및 위치를 포함하여 이온
- 마취 : 유도 챔버 내의 위치 및 마우스를 이소 플루 란 기화기 및 배기 가스 용기를 포함하는 휴대용, 테이블 위에 마취 기계로 마취.
- / 분 3 L의 산소 유량과 3 %로 기화기를 설정한다. 이것은 비교적 높은 마취 환율 급속한 마취 효과를 달성하고, 따라서 심장 기능에 영향을 미칠 수있다 스트레스 반응을 최소화하기 위해 사용된다. 프로토콜의 짧은 기간은 동물에 대한 위험을 최소화합니다. 항상 마취 레이트가 동일한 유지하는 것이 매우 중요하다. 이 프로토콜은 따라서 다른 에이전트를위한 최적의 조건이 프로토콜에 따라 다를 수 있으며, 마취 등의 이소 플루 란 전용에 최적화되어 있습니다. 마취의 낮은 깊이는 실험 목적에 따라 선택 될 수 있지만, 마취 프로토콜이 확립되면, 그것은 변경해서는 안된다. 마취는 심장 박동 및 인접에 영향을 미치는R 혈역학 적 측정. 마취의 깊이는 실험 기간 동안 변경되면 따라서, 데이터가 분석에 유용하지 않을 수 있습니다. 여러 마우스는 하루에 몇 군데되는 경우, 개별적으로 마취.
- 이 실험 그룹간에 동일한 보장하기 위해 실내 온도를 모니터링합니다. 마우스가 가열 테이블에, 그래서 모니터와 비교됩니다 실험 그룹간에 동일하게 유지해야하는 경우에도 실내 온도는 vasoreactivity에 영향을 줄 수 있습니다. 이 프로토콜은 직접 동물의 온도를 측정하지 않지만, 일정 주위 테이블 온도는 실험 그룹 사이의 온도에 약간의 변화가 있음을 보장합니다.
- 머리 제거 : 마우스를 마취 한 후 제모 크림과 함께 가슴에서 머리를 제거합니다. 쇄골에서 면봉으로 응용 프로그램을 시작하고, 단지 횡격막 아래에 계속.
- 1 분 동안 다시 마취 실에 마우스를 놓고탈모가 작동 할 수 있도록합니다. 마취 효과가 있는지 확인하기 위해 단단히 마우스의 발 중 하나에 대한 미리보기 이미지를 누릅니다. 제공된 인출이없는 경우, 마취가 적절하다. 사지가 철회하는 경우, 다른 분 동안 마취 실에 다시 마우스를 놓습니다.
- 각막 손상을 방지하기 위해 마우스의 눈 연고 윤활 묻혀.
- 거즈 패드 X 2 2 가슴에서 머리를 제거합니다. 제모 크림에 사용되는 화학 물질은 부식성이며, 너무 오래 동안 방치하면 피부에 해가되므로 치료는 피부에서 모든 제품을 제거하기 위해주의해야한다.
- 머리 제거 다음 피부 보습을 적용합니다.
- 위치 : 37 ° C로 설정 가열 테이블에 ventrodorsal 위치에 마우스를 놓고 정확한 위치는 이미지 품질의 인수에 필수적입니다. 체온, 호흡, 심장 박동을 캡처 할 수있는 테이블을 사용합니다. 통합 레일 시스템의 모든 사용정확한 위치와 이후에, 이미지 최적화를위한 OWS.
- 부드럽게 네 발을 테이프로 가슴에 전달 젤 한푼 크기의 금액을 적용합니다.
3. 이미지의 취득 : 흉골 긴 축보기 이미징
- 레일 시스템에 마운트 내부의 장소에 초음파 변환기를 잠금 및 트랜스 듀서의 금속 프로브가 심장 바로 위에 위치하도록, 시계 반대 방향으로 10 ° 회전합니다. 보다 구체적으로, 프로브는 두번째 또는 세번째 늑간에서 가슴의 왼쪽에, 그리고 흉골 측방한다.
- 올바른 뷰가 얻어 질 때까지, 레일 시스템 상에 위치 x-및 y-축을 조작.
- "B 모드"를 선택합니다. 이는 2D의 라이브 영상을 투사하기 위해 시스템 콘솔의 오른쪽 부분에서 발견된다.
- 모니터에 다음과 같은 해부학 적 구조를보기 :
- aort하는 정점에서 전체 심장- 정점까지 화면의 왼쪽과 오른쪽에있는 대동맥에 가시화 될 것입니다.
- 좌심실 (LV)의 루멘
- 좌심실의 후벽 (LPW)
- 심실 중격 (IVS)
- 우심실의 루멘 (RV)
- 전방 및 후방 승모판 전단지 (AML & PML)
- 상행 대동맥 (AO)
- 좌심방 (LA)
- 이미지를 "정지"로 검색 / 정지 버튼을 눌러이보기에서 대동맥 하나의 직경 측정을 얻습니다. 좌심실 수축기이며, 대동맥이 가장 큰 직경으로 될 때까지 이미지의 맨 아래에있는 비디오 루프를 통해 다시 끌어 마우스를 사용합니다.
- 화면의 왼쪽 상단 모서리에있는 측정 도구를 클릭하고 대각선 모양의 아이콘을 선택합니다. 마우스를 클릭하고 대동맥, perpendicula의 후방 벽에 전방에서 직선을 그릴 왼쪽긴 축에 연구. "프레임 스토어"버튼을 눌러 저장합니다.
- "시네 스토어"를 눌러 비디오 루프를 만듭니다
. 이미지의 4 취득 : 흉골 짧은 축보기 이미징
- 3, 9시 방향 (가로)으로 트랜스 듀서의 위치를 조정합니다. 각도가 약간 꼬리 쪽 트랜스 듀서를 조작하여 대동맥과 LV 루멘의 최고의 전망을 달성하기 위해 산. 금속 프로브는 흉골에 수평으로 직접 배치됩니다.
- 올바른 뷰가 얻어 질 때까지 레일 시스템에 대한 x-및 y-축을 조작. LV 루멘 모니터의 오른쪽에 볼 수 있습니다 외측 및 후 내측 젖꼭지 근육과 함께 볼 수 있습니다. 이 좌심실의 중간 부분을 나타내는 짧은 축에 대한 표준 참조 점이다, 치수 측정 한 위치. 뷰에서 다른 해부학 구조를 가지고 x-및 y-축이 원점에서 약간 벗어나는 것이 필요할 수 있지만 위치는 상기 뷰를 참조하여 설명한다.
- 짧은 축보기에서 다음과 같은 측정을 얻
- B 모드
- 대동맥의 두 개 더 직경 측정.
- 폐 유출 관의 세 가지 측정.
- 펄스 파 도플러 모드 (PW)
- 대동맥의 세 가지 속도 시간 적분 측정 (VTI)
- 폐동맥의 세 VTI 측정은 폐 밸브에 바로 인접를 측정했습니다.
- 최고 속도에 혈류의 처음부터 VTI 곡선을 추적하여 폐동맥 가속 시간을 측정한다.
- M 모드
- 디에서 좌심실 내경의 세 가지 측정astole (LVIDd)
- 수축기에 좌심실 내경의 세 가지 측정 (LVIDs)
- 오른쪽 심실 내경 (RVID)의 세 가지 측정. 이 넓혀진 경우 RV 루멘은이보기에 표시됩니다.
- 세 가지 다른 심장주기 동안 LV의 전벽의 두 이완기 피크 사이의 거리를 추적하여 M-모드를 사용하여 심장 박동을 세 번 측정한다.
- B 모드
- B 모드 측정 :
- 대동맥의 반월판 막에 초점이 올 때까지, 유두근보기에서 cranially Y 축을 조작 할 수 있습니다.
- 가장 큰 직경에서 단지 밸브 위의 대동맥의 측정을 얻습니다.
- 화면의 왼쪽 상단 모서리에있는 측정 도구를 클릭 한 대각선 모양의 아이콘을 선택합니다.
- 왼쪽은 마우스를 클릭하고 대동맥의 후방 벽에 전방에서 직선을 그립니다.
- T 조작그는 X 및 Y 축 주 폐동맥이 될 때까지 분기합니다. 이 구조 및 모니터 대동맥의 오른쪽에, 전방으로 보일 것이다.
- 주 폐동맥의 고리가보기에 올 때까지 y 축 cranially를 조작 할 수 있습니다. 그것은 명확 대동맥으로 정의되지 않습니다.
- 이미지를 "일시 정지"와 수축기의 측정 값을 얻을 수 있습니다.
- 총 3 측정 값을 수집합니다.
- 펄 스파 (PW) 도플러 측정 : PW 모드는 주로 동맥과 정맥을 통해 혈액의 흐름 혈역학 적 평가를 위해 사용됩니다. 이 프로토콜에서는 대동맥과 폐동맥의 세 가지 속도 시간 적분 측정을 검색하는 데 사용됩니다.
- 단계 4.3.1 및 글 머리 기호 1에 설명 된대로 다시보기로 대동맥을 가져옵니다.
- "PW 모드"를 선택합니다. 이것은 시스템 콘솔의 우측 상단에 위치하고 있으며 대동맥을 통해 혈류 도플러 판독을 생성 할 것이다.
- SA 배치단지 대동맥 밸브의 수준의 위 엠플 볼륨. x-및 y-축이 충분한 도플러 봉투를 구하는 약간 조정될 필요가있다. 봉투 흰색 테두리 및 중공 내부를 나타내는 층 혈류량을 가져야한다.
- 충분한 뷰가 얻어지면, 이미지를 "동결"및 도플러 포락선의 테두리를 추적. 이 VTI을 계산합니다.
- 모니터의 상단 오른쪽의 이미지에서 볼 수있는 분할 된 노란 선까지 0 °에있는 시스템 콘솔을 시계 방향에있는 "각도"노브를 돌립니다. 이 황색 선은 용기를 통한 혈액의 흐름의 방향을 나타낸다. 트랜스 듀서 자체는 심장의 단면 또는 가로보기를 생성하는 방식으로 경사져 있기 때문에, 라인 대동맥을 통한 혈액의 흐름에 수직으로 정렬하기 위해, 0 °로 조정되어야한다.
- 중앙의 폐 밸브의 수준으로 샘플 볼륨 근위 배치우심실 유출로 기관 이상으로 VTI 측정을 반복한다. 혈액의 흐름은 반전 또는 모니터 대동맥과 관련하여 혈액의 흐름과 반대 표시됩니다.
- 단계 4.3.1 및 글 머리 기호 1에 설명 된대로 다시보기로 대동맥을 가져옵니다.
- M 모드 측정 : M-모드 영상은 하나의 초음파 빔을 따라 조직의 움직임 높은 시간 해상도를 제공하고, 판막 심근과 혈관 벽의 움직임을 연구뿐만 아니라, 공동의 크기를 정량화하는 데 사용된다.
- "B 모드"재개 "참조 뷰"(유두근의 수준에서 좌심실의 단면도)를 구하는 것이 트랜스 듀서의 위치를 변경.
- 압박 "M 모드". 이는 다음과 같은 해부학 적 구조의 움직임이 "리본"로 볼 수있는 연속 비디오 피드를 생성합니다. 넓혀진 경우, RV 루멘 매우 얇은 검은 리본으로 사료의 상단에 나타납니다. 심실 중격 (IVS)는 직접 RV 아래 불투명 한 리본으로 표시됩니다루멘. LV 루멘 직접 IVS 아래에 볼 수 있습니다. 이는 사료의 대부분을 차지하는 큰 검은 색 공간이다. LV 루멘 이하 불투명 리본으로 간주 될 LV의 후벽 (LVPW)입니다.
- 이미지를 고정하고 호흡이 발생하지 않는 지점에 필요한 경우 비디오 루프를 통해 철수. 마우스 respires는, 화상 취득함으로써, 일정한 빈도로 발생 피드 왜곡 "도말"아티팩트를 생산, 격막 및 흉부 벽의 이동에 의해 방해되는 경우.
- 대각선 아이콘을 사용하여 다음과 같은 측정을 얻
- LV의 세 가지 측정은 IVS와 LVPW 사이의 최대 거리로 표시 이완기 차원을, 끝.
- IVS와 LVPW 사이의 최단 거리로 표시 좌심실 수축 기말 차원의 세 가지 측정.
- 심장 아이콘을 클릭하고 수축기 피크를 측정하여 이루어집니다 심박수의 세 가지 측정LVPW의 수축기 최고.
- RV 루멘이 넓혀진 경우, 대각선 아이콘을 사용하여 세 개의 측정 값을 얻을 수 있습니다.
- "시네 저장"버튼을 누르면 "B"모드에서 짧은 흉골 축보기의 비디오 루프를 기록합니다.
- , "파일"로 이동하여 측정을 요약하자면 "찾아 연구"를 선택, "세션 종료"버튼을 클릭 한 다음 "세션 데이터를 커밋합니다."
- IACUC 프로토콜에서 설명한대로 마우스를 복구하고 청소.
- 이후 분석을 위해 엄지 손가락 드라이브에 CSV 파일로 데이터를 내 보냅니다.
- 심장 기능 (표 1)의 다음과 같은 매개 변수를 계산합니다 :
- 좌심실 유출 요로 지역
- 좌심실 박출량
- 좌심실 박출량
- 분수 단축
- 폐동맥 지역
- 폐동맥 가속 시간
- 우심실 박출량
- 심장 지수
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결과
이 프로토콜의 주요한 목표는 RV 크기와 기능을 계량하고, 병에 걸린 폐 맥관이되는 정도를 이해할 수있다. 마우스와 심장 초음파 검사를 모두 장비의 적절한 준비는 정확하고 재현 가능한 결과를 얻는 것이 필수적이다. 마우스는 자신의 가슴에가 depilated해야 손발이 테이프로 이미징 플랫폼에 고정. 마취,이 경우 이소 플루 란에, 코 콘을 통해 관리됩니다. 센서는 이미지 품질을 저하시킬 수 결함, 특히 기포에 대해 검사되어야한다. 마음의 좋은 품질 4 실의 전망을 얻기 때문에이 프로토콜은 흉골 짧고 긴 축을 사용하는 RV의 평가에 초점을 맞추고 마우스에서 상당히 어렵습니다. 이러한 전체의 중요한 해부학은도 1a 및도 1b에 도시된다.
RV의 크기는 유용한 흉골 장축 뷰에서 평가되고 interventricul에 자유 벽으로부터의 거리로서 측정된다M 모드 (그림 2)를 사용하여 AR 중격. 일반 RV가 매우 작기 때문에...
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토론
질환의 마우스 모델, 유전자 변형 또는 독소 관련 하나는 모델이 실제로는 모방하기위한 것입니다 인간의 질병을 되풀이되었습니다 것을 표현형의 확인이 필요합니다. 이 유효성은 종종 종양의 예 개발을위한, 특정 기능의 존재 또는 부재에 의해 달성 될 수있다. 그러나, 좌심실 비대 또는 PAH의 우리의 유전자 변형 모델의 대동맥 협착 모델 등의 혈역학 적 이상을 초래할 모델의 유효성을 검사하기가 더 어렵습니다. 이러한 모델은 비 침습적 심장 기능의 혈류 역학과 이상을 측정하는 혈류 역학 또는 도구의 터미널 측정 중 하나를 필요로합니다. 이 병에 걸린 동물 (14)의 희생을 요구하지 않고 혈류 역학 및 심장 기능의 실시간 정량을 할 수 있기 때문에 심장 초음파 검사는 모델에 매우 중요합니다. 또한, 각각의 동물은 질병이나 치료에 대한 응답의 자연 역사를 따라 연속적으로 이미지화 할 수 있습니다. 우리는 proficien 추정이 프로토콜에 따라 오른쪽 심장의 심 초음파 검사에서 CY 약 20 시험을 수행 한 후 획득 ...
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공개 사항
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참고문헌
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