섬유아세포 매개 피브린 겔 다짐 관찰 및 정량화

요약

시간 경과 현미경 검사법과 이미지 처리 기술은 48시간 동안 환경적으로 통제된 생물 반응기에서 섬유아세포 매개 젤 다짐 및 피브린 섬유 재정렬을 관찰하고 분석하는 데 사용되었습니다.

초록

콜라겐과 피브린 젤에 내장된 세포는 겔 섬유에 견인력을 부착하고 발휘합니다. 이러한 힘은 젤 미세 구조의 로컬 및 글로벌 재구성 및 재조정으로 이어질 수 있습니다. 이 과정은 세포의 위치, 젤의 형상 및 젤의 기계적 제약 사이의 상호 작용에 부분적으로 의존하는 복잡한 방식으로 진행됩니다. 이러한 변수가 글로벌 섬유 정렬 패턴을 생성하는 방법을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 기하학적으로 간격이 있는 각질(섬유아세포의 클러스터) 사이의 압축 공정을 관찰하기 위해 환경 제어 생물 반응기와 결합된 시간 경과 차동 간섭 콘트라스트(DIC) 현미경 을 사용합니다. 그런 다음 이미지를 사용자 지정 이미지 처리 알고리즘으로 분석하여 변형맵을 가져옵니다. 이 기술에서 얻은 정보는 상처 치유, 질병 개발 및 조직 공학 응용 분야의 프로세스를 이해하는 데 중요한 영향을 미치는 다양한 세포 매트릭스 상호 작용의 기계생물학을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

세포 매트릭스 상호 작용을 연구하기위한 중요한 도구는 세포 채워진 콜라겐 젤^1,2이다. 겔은 조직의 생체 내 특성에 더 가깝고 전통적인 2D 배양^3에서제공하는 것보다 세포 행동을 이해하는 데 더 적합한 3D 환경을 제공한다. 섬유아세포가 콜라겐 젤 내에서 균질하게 분포된 초기 연구에 따르면 세포는 콜라겐 섬유를 빠르게 통합하고 겔^4,5을압축하는 것으로 나타났다. 자유 부동 젤의 수축 섬유 아세포는 겔이 완전히 다짐^1,6,7에도달 한 직후 정지 상태로 전환한다. 경계에 제약이 있는 겔의 섬유아세포는 활성, 합성 상태^8에 남아 있으며 겔 형상 및 외부 제약 에 의존하는 방식으로 섬유 정렬을 생성합니다^5,9. 세포 활동의 차이는 세포가 젤의 콜라겐 섬유에 대한 통합을 통해 견인력을 발휘함에 따라 발생하는 내부 장력(또는 그 부족)의 결과로 나타난다.

이 기술의 변이체는 콜라겐 젤 내에서 떨어져 섬유아세포 이질(즉, 세포의 덩어리)을 배치하고 세포 매트릭스 상호 작용을 관찰하고 각기 (때로는 인대 와 같은 스트랩이라고도 함)^10-12사이의 섬유 정렬의 점진적 개발을 포함한다. 각기 ....

프로토콜

1. 스텐실 준비

파라필름에 스텐실을 준비하여 원하는형상(그림 1A 및1B)에 따라 각 각 각 절제물의 위치를 레이아웃합니다. 공간은 각각 약 1-2mm 떨어져 익스플. 이 거리는 각성 사이의 섬유 정렬을 생성하기위한 이상적인 간격에 해당합니다. 샘플이 테이프로 준비될 커버글래스 영역 아래에 스텐실을 부착합니다.

2. 살균

실험 전에 70% 에탄올을 사용하여 생물 반응기의 모든 성분을 철저히 청소하고 UV 빛 아래에서 2-3 시간 동안 살균하십시오. 대체 용기가 생물 반응기 대신에 사용되는 경우 적절한 살균 기술을 사용해야 합니다. 유리 바닥 페트리 접시사용에 대한 의견은 4.12 단계를 참조하십시오.

3. 피브린 젤 준비

생물 반응기의 성분이 살균 된 후, 커버 글래스의 표면에 피브린 젤의 얇은 층을 캐스팅. 6.6 mg /ml 피브린 젤을 만들기위한 피브리노겐 및 트롬빈 재고 솔루션을 준비하기위한 세부 사항은 Sander 외에서설명된다. ^....

결과

조직 리모델링은 세포와 주변 매트릭스 사이의 상호 물리적 상호 작용에 의해 부분적으로 구동되는 복잡한 과정입니다. 세포는 주변 섬유를 재구성하고 섬유 네트워크에서 장력을 생성합니다. 섬유와 기계적 환경의 정렬은 차례로 세포 행동을 제어하므로 세포와 매트릭스 가 전 세계적으로 재구성되어 리모델링 된 조직을 생성합니다. 본 실험에서, 항종의 세포는, 처음에 형태학에서 둥근, 겔로 확장하고 피브린 섬유에 부착하기 시작했다(도 3). 세포는 겔을 통해 전파되는 견인력을 발휘하고, 결합 사이의 축에 평행하게 유도된 섬유 정렬을 유도하였다. 몇 시간 내에 "스트랩"이 보이게되었습니다(그림 3A). 스트레인 측정은 또한 가장 큰 균주가 축으로 횡단되는 것을 나타내었습니다(그림3D 및 3E). 이 지역의 섬유는 축쪽으로 자유롭게 변환할 수 있기 때문에 균주는 이 지역에서 가장 높습니다.

토론

이 프로토콜은 세포 매개 ECM 리모델링과 관련된 역학을 관찰하고 정량화하기 위한 목적으로 개발되었다. 이러한 과정은 다수의 생물학적 현상의 기초와 엔지니어링 조직에 대한 중요한 의미를 갖는다^2,22,흉터^1,23을감소시키고, 병리학 조직을 리모델링^12,24. 시간 경과 DIC 현미경 검사법의 사용은 세포 견인력의 결과로 발생하는 피브린 섬유의 변위와 정렬을 해결하고 정량화 할 수 있습니다. 여기서 관찰된 재구성은 리모델링 과정의 첫 번째 단계이며, 콜라겐^11에서관찰된 조직 패턴을 따른다. 개편은 피브린 분해와 ECM 합성의 조합이 뒤따릅니다. 리모델링의 재구성 단계는 몇 시간에서 며칠 동안 일어나는 반면, 리모델링 과정의 합성 단계는^13을전개하는 데 몇 주가 걸립니다. 여기에 설명된 시스템은 몇 주 동안 작동할 수 있으므로 이러한 후기 이벤트를 모니터링하도록 조정할 수 있습니다.

이.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시그마-알드리치	F8630
시그마-알드리치	T4648
Gibco	11965-092
Gibco	15140-122
시그마-알드리치	A2942
시그마-알드리치	H0887
시그마-알드리치	223506
Gibco	25200-056
Invitrogen	3000
Lonza	DE14-701F
분자 프로브	F8858
GIBCO	A10483-01
GIBCO	11430-030
Fisher-Scientific	SS264-1
Sigma-Aldrich	A3428-25MG
Biotense 생물 반응기	ADMET
Ti-Eclipe 현미경	Nikon
# 0 35mm 유리 바닥 페트리 접시	MatTek	P35G-0-20-C
# 0 35mm 유리 상단 페트리 접시	MatTek	P35GTOP-0-20-C
플라스틱 Luer 피팅, Luer 끝이 있는 PVC 튜브	Cole-Parmer	30600-65

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