교양 방광 상피 세포 간 인간 호중구 이주의 정량 평가

요약

우리는 uropathogenic 대장균 방광 감염 동안 급성 염증 반응의 중요 성분을 모방 체외 모델을 개발 하였다. transuroepithelial 호중구 마이그레이션 분석은 세균 감염이나 화학 유인 물질에 대한 응답으로, 투과 지원에서 배양, 방광 상피를 통해 인간의 호중구 이주의 양적 평가를 할 수 있습니다.

초록

염증의 사이트에 주변에서 면역 세포의 모집은 점막 표면에서의 선천성 면역 반응에 필수적인 단계입니다. 방광의 감염시, 다형 핵 백혈구 (PMN, 호중구)는 혈류에서 마이그레이션 및 방광 상피 세포를 통과. 호중구 응답이없는 상태에서 감염을 해결하지 않으면 방광 방어 PMN의 중요성을 보여줍니다. 방광 상피 uropathogenic 대장균 (UPEC)의 정착을 촉진하기 위하여, 요로 감염 (요로 감염)의 대부분의 원인 물질은, 부분적으로 정의 된 다양한 메커니즘을 사용하여 급성 염증 반응을 저해. 추가 호스트 및 세균성 병원체 사이의 상호 작용을 조사하기 위해, 우리는 UPEC에 타고난 면역 반응의 이러한 측면의 체외 모델을 개발했다. transuroepithelial 호중구 마이그레이션 분석에서, 보이든 챔버의 변형, 배양 방광 epithelial 세포 투과성 지원의 아래쪽에 합류로 성장하고 있습니다. PMN 인간 정맥 혈액으로부터 격리되어 방광 상피 세포층의 측저 측에인가된다. 세균 감염이나 화학 유인 물질 분자에 대한 응답으로 생리학 관련 기저 첨단으로 방향을 나타내는 PMN 마이그레이션은 혈구를 사용하여 열거됩니다. 이 모델은 UPEC 및 진핵 세포 사이의 상호 작용을 조사 할뿐만 아니라 PMN 의해 방광 상피의 순회를위한 분자 요구를 심문하는 데 사용될 수있다. transuroepithelial 호중구 마이그레이션 모델은 방광에 UPEC에 대한 초기 염증 반응에 대한 우리의 이해를 증진 할 것이다.

서론

몸 전체 세포의 이동은 종종 긴 거리에 걸쳐, 성장과 발달, 상처 치유 및 면역 반응에 필요합니다. 세포 이동은 복잡하고 신호 폭포와 골격 구성 요소의 재 배열 등 다양한 프로세스의 조정을 필요로한다. 세포는 정의 화학 그라데이션 (화성)으로 무작위로 (chemokinesis)를 이동뿐만 아니라 수 있습니다. 대부분의 기술은 체외에서 세포의 이동을 연구하기 위해 개발되었다. 가장 오래되고 가장 일반적인 방법, 보이든 챔버, 화학 주성 물질이 바닥 챔버와 그 세포에 배치 수직 두 개의 챔버 시스템의 구성은 상단 챔버 ^(1)에 배치됩니다. 두 개의 챔버를 분리 정의 된 크기의 기공을 가진 투과 필터를 통해 세포의 이동, 감시된다. 그 밖의 기술은 Zigmond 챔버 ⁽²⁾ 및 던 챔버 포함한 세포 이동을 조사하기 위해 개발되었다^3. 이러한 집단적인 접근 방식은 다양한 세포 유형의 운동으로 상당한 통찰력을 수득했다.

chemokinesis 및 주 화성의 기본 원리를 질의 이외에,이 챔버 분석법은 세포 외 기질 성분과 모두 내피와 상피 세포층을 통한 세포 이동의 조사를 용이하게했다. 다른 기술을 통해 두 챔버 시스템의 장점은 다공성 멤브레인이 콜라겐 또는 피브리노겐과 같은 단백질로 코팅 될 수 있으며, 세포 외 기질 같은 절연막의 세포 이동이 평가 될 수 있다는 점이다. 또한, 배양 된 세포주 성장 및 투과성 지지체에 차별화 될 수있다. 내피 세포 장벽을 가로 질러 세포의 움직임을 조사하기 위해, 배양 된 내피 세포 투과성 지지체의 상부 리저버에 접종하고 성장시킨다. 이러한 면역 세포와 같은 운동성 세포, EN에 걸쳐 낮은 저수지에 상부 저수지 및 마이그레이션에 추가생리적 정점 - 투 - 기저 방향으로 내피 장벽이 관찰된다. 이 모델은 혈류 중 면역 세포의 혈관 외 유출을 이해하는 귀중한되었습니다. 옮기는 내피 달리 상피 장벽을 가로 질러 세포의 이동은 일반적 측저에서 첨단으로의 방향에서 발생한다. 시험관에 이러한 이벤트를 모델링하기 위하여, 연구자들은 시드 및 투과성 지지체의 아랫면에 배양 된 상피 세포 성장. 운동성 세포 측저에서 첨단으로의 방향을 나타내는 상피 장벽을 가로 질러 상부 리저버와 이주에 첨가되고 모니터링된다. transepithelial 이주의 이러한 모델은 크게 점막 표면에서 염증 반응, 특히 폐의 그와 ^4,5 창자에 대한 우리의 이해에 기여했다.

반면, 요로 상피 세포를 통해 면역 세포의 인신 매매는 훨씬 적은 관심을 받고있다. 우리 understandi를 더하려면방광 상피 장벽 ^(6)를 통해 이동, (호중구 PMN) NG uropathogenic 대장균 (UPEC) 감염 중 요로의 선천성 면역 반응, 우리는 다형 핵 백혈구의 조사를 가능하게하는 시험 관내 분석, transuroepithelial 호중구 마이그레이션 분석을 개발 ^-8. transepithelial 이주의 다른 두 개의 챔버 모델과 마찬가지로, 배양 된 방광 상피 세포 투과성 지원의 밑바닥에 성장과 합류 상피 층을 형성하고 있습니다. 정맥혈로부터 단리 인간 호중구는, 상피 층 측저 측에인가되고, 생리 학적으로 관련 측저에서 첨단으로 방향 상피 전반 마이그레이션 E. 다른 균주 감염에 반응하여 정량화 대장균 또는 화학 유인 물질 분자의 존재. 많은 연구가 추가로 세포 유형의 부재에서, 호중구의 이동에 chemokinesis 및 화성 모두를 집중했다. 이 계정에 감염 동안 방광 상피 세포와 면역 세포 사이의 복잡한 상호 작용을 걸립니다 transuroepithelial 호중구 마이그레이션 분석은 유리하다. 이 다루기 쉬운 체외 모델 Uroepithelial에 표면에 면역 반응의 상세한 조사를 허용 할 가능성이있다.

프로토콜

1. 5637 방광 상피 세포를 배양

층류 조직 문화 후드 UV 조사 준비 및 70 % 에탄올로 닦여에서 다음 단계를 수행합니다.

1. 10 % 소 태아 혈청 (FBS) [칭했다 RPMI +]를 함유하는 RPMI-1640 배지를 준비 필터 수욕 0.22 ㎛의 세공 크기 필터를 사용하여 살균하고, 온난 한 37 ° C.
2. 5637 세포의 cryovial을 해동 (미국 유형 문화 수집 HTB-9, 방광 암에서 파생 된) 37 ° C의 물을 욕조에. 빠르게 20 ㎖ RPMI +를 포함하는 75cm ² 조직 문화 플라스크에 해동 세포를 전송합니다.
3. 세포가 약 95 %의 합류 (플라스크 당 ~ 6 × 10 ⁶ 세포), 약 5 일 때까지 5 % CO _2와 가습 분위기에서 37 ° C에서 플라스크를 품어.
4. 5637 세포를 배양하는 방법 :
   1. 플라스크에서 매체를 제거합니다. 10 ㎖ 둘 베코의 인산 완충 살린로 세포를 씻어실온에서 전자 (DPBS).
   2. 6 ㎖의 따뜻한 (37 ° C) 0.05 % 트립신, 플라스크에 0.02 %의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 추가하고 15 분 동안 5 % CO _2와 37 ° C에서 알을 품다.
   3. 5 분 300 XG에서 원심 분리하여 15 ML 원뿔 관, 펠릿에 세포를 전송합니다. 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 제거합니다.
   4. 20 ml의 RPMI +를 포함하는 새로운 75cm ² 플라스크에 6 ㎖의 RPMI + (10 ⁶ 세포 / ml), 및 전사 1 ㎖ (10 ⁶ 세포)에서 세포를 재현 탁.
5. 세포가 95 %의 합류에 도달하면 4 일마다 세포를 배양하는 단계 1.4를 반복하거나.

2. 침투성 서포트에 5637 셀 시드와 성장

무균 기술을 사용하여 조직 문화 후드에서 다음 단계를 수행합니다. 최적의 결과를 위해, 10 개 미만의 서브 컬쳐를받은 5637 세포를 사용합니다.

1. 멸균 집게를 사용하여 멸균 25mm 깊은 조직 배양 접시에 투과 지원을 반전.
1.4.1-1.4.3 단계에 따라 95 %의 합류에 5637 세포의 75cm ² 플라스크를 Trypsinize.
2. 1000 μL 피펫을 사용하여 조심스럽게 혈구 세포를 사용하여 계산에 의해 결정된 3 × ¹⁰⁶ 세포 / ml의 농도로 1 ~ 2 ㎖의 RPMI +의 세포를 재현 탁.
3. 멤브레인을 건드리지 않고 각 성의 지원에 세포 현탁액 (1.5 × 10 ⁵ 세포)의 50 μl를 적용합니다. 접시에 뚜껑을 배치하고주의 깊게 더 이상 16 이상의 시간 동안 5 % CO _2와 37 ° C에서 접시를 놓습니다.
4. 물론 당 0.6 ML RPMI의 +를 포함하는 24 - 웰 플레이트에 살균 집게, 바로 투과 지원을 사용. 각 성의 지원의 상부 저수지에 0.1 ㎖의 RPMI +를 추가합니다. 5 % CO _2와 37 ° C에서 알을 품다.
5. 2 일마다 배지를 교체합니다. 먼저, 대기음 하부 저장조이어서 상부 리저버로부터 중간 및 하부 저장조 (0.6 ㎖)에 역순으로 신선한 RPMI +를 적용한 후 상부 rese에rvoir (0.1 mL)을 첨가 하였다.
6. 세븐 일 5637 세포 투과성 지원을 파종 한 후, 세포의 합류를 평가합니다. RPMI + (~ 0.35 ㎖)으로 상부 저수지를 입력합니다. 매체는 상부 및 하부 저장조 사이 평형화되지 않는 경우 셀을 충분히의 합류.

3. 세균 접종의 준비

1. 무균 기술을 사용하여, 모자와 250 ㎖의 플라스크에 적합한 배양액 20 ㎖를 추가합니다. E.에 루리아 - 베르 타니 (LB) 국물을 사용하여 대장균 문화, 그리고 적절한 국물에 항생제를 추가합니다.
2. 멸균 접종 루프를 사용하여 글리세롤 재고 세균이나 줄무늬 판과 국물을 접종. UPEC 균주를 들어, (1 형 필리의 생산을 촉진하기 위해) 동요하지 않고, 약 16 시간 동안 37 ° C에서 세균성 문화를 배양한다.
3. 원심 분리기 튜브에 박테리아 문화를 전송합니다. 10 분 8,000 XG에서 원심 분리하여 박테리아 펠렛.
4. 뜨는을 가만히 따르다와 ~ 10 ⁹ CFU / ㎖에 해당 = 1.000 _(600)를 과다 복용 PBS에있는 박테리아를 재현 탁.
   1. 열 살해 세균의 자극을 생성하려면, 나누어지는 30 분 동안 55 ° C에서 재 부유 세균 (150 μL의 예 ~ 1.5 × 10 ⁸ CFU)을 배양한다. 세균의 죽음을 확인하기 위해 열 죽인 정지 나누어지는 플레이트.
5. 즉시 사용하기 전에, 재 부유 세균 (라이브 또는 열 사망) 10 배 따뜻한 혈청 RPMI ⁸ CFU / ㎖ ~ 10은 미세 원심 분리 튜브에 [RPMI-되나] 희석.

4. 말초 혈액에서 인간의 호중구의 분리

성인 자원 봉사자의 혈액의 컬렉션은 사전 검토 및 기관 검토위원회의 승인을 필요로합니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 적절하게 인간의 혈액에 노출을 방지하기 위해 유해 물질의 폐기.

1. 건강한 성인 V에서 정맥 혈액의 약 25 ㎖의olunteer은 정맥 절개에 훈련 된 직원 3 멸균 나트륨 헤파린 함유 혈액 수집 튜브로 유입되어야한다.
   1. 단단히 팔꿈치 위, 팔 위쪽 주위에 고무 지혈대를 감 쌉니다.
   2. 멸균 70 %의 알코올을 사용하여 닦아, 엔트리 사이트, 전주 포사 소독.
   3. 나비 날개 바늘 시스템에 플라스틱 관 홀더를 부착합니다.
   4. 를 향하도록 30 ° 각도 이하, 경사에서 전주 정맥에 바늘을 삽입합니다. 혈액의 분출은 플라스틱 튜브에 나타날 때 바늘이 정맥 구멍이있다.
   5. 플라스틱 튜브 홀더에 채 혈관을 삽입한다. 제 포집 관이 가득 차면, 제 포집 관으로 대체. 세 번째 튜브를 반복합니다.
   6. 세 번째 컬렉션 튜브 약 절반 가득 차있을 때, 지혈대를 제거합니다.
   7. 멸균 면봉으로 구멍 사이트를 덮고 천천히 정맥에서 바늘을 철회. 바늘과 장소 난을 통해 방어 태세를 밀어NA의 생물은 용기를 날카로운 물건.
   8. 펑크 사이트에 압력을 적용합니다. 접착 붕대 구멍 사이트와면 공을 커버.
   9. 부드럽게 헤파린을 분산시키는 혈액 수집 튜브를 반전.

무균 기술을 사용하여 조직 문화 후드에서 다음 단계를 수행합니다.

2. 10 ㎖ 피펫을 사용하여 부드럽게 신선한, 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 혈액을 전송합니다. 3 %의 해당하는 양 (W / V) 덱스 트란 0.9 % 염화나트륨의 추가와 반전으로 섞는다. 20 분 동안 실온에서 직립 관을 배양한다.
3. 하층을 방해하지 않고 조심스럽게 상층 대기음 새로운 50 ㎖ 원추형 튜브에 옮긴다. 10 분 300 XG에서 원심 분리하여 펠렛은 세포. 상층 액을 버린다.
4. 혈액의 초기 부피에 상당 0.9 %의 NaCl의 양에서 세포 펠렛을 재현 탁.
5. 세포 현탁액, P 하에서 밀도 원심 용액 10 ㎖ 레이어두 개의 상 사이의 계면을 예약. 없이 브레이크와 30 분 400 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다.
6. 잔류 적혈구를 용해하기 위해, 10 ㎖의 차가운 0.2 %의 NaCl에서 세포 펠렛을 재현 탁. 30 초 동안 배양 한 다음 즉시 등장 성을 복원하기 위해 10 ㎖ 차가운 1.6 %의 NaCl을 추가합니다.
7. 6 분 300 XG에서 원심 분리하여 펠렛은 세포. 상층 액을 버린다.
8. 세포 펠렛은 적혈구, 용해의 일반적으로 3 라운드를 무료로 나타날 때까지 반복 4.6-4.7 단계를 반복합니다.
9. 1000 μL 피펫을 사용하여, 소재, 세포 펠렛 주로 PMN을 재현 탁 따뜻한 (37 ° C)로 RPMI-세포 혈구를 사용하여 계산하여 결정될 10 ⁷ 세포 / ㎖의 농도. 사용할 때까지 37 ° C에서 세포를 유지합니다. 각각 염색 후 핵 형태의 트리 판 블루 배제 및 시각화에 의해 평가 일반적으로, PMN 생존 및 순도는> 99 %이다.

5. Transuroepithelial 호중구 마이그레이션으로말

무균 기술을 사용하여 조직 문화 후드에서 다음 단계를 수행합니다. 단계 2.7에서의 결정에 따라, 융합 5637 세포층 베어링 만 투과 지원을 사용합니다. 포함하는 24 - 웰 플레이트 RPMI은 - 수 있습니다 사전에 준비하고, 5 % CO ₂ 사용할 때까지와 37 ° C로 유지 될 수있다.

1. 나누어지는 1은 24 - 웰 플레이트에 RPMI 당을 잘 따뜻하게 밀리리터, 투과 지원 당 3 우물을 준비합니다.
2. 투과성 지지체의 상부 및 하부에서 저장조 매체 대기음.
3. 멸균 집게를 사용하여, 단계 5.1에서 제조 된 24 웰 플레이트에 투과 지원을 전송합니다. 잘에서 잘으로 지원을 전송하여 투과 지원을 세 번 씻으십시오.
4. 세균 접종 물이 사용되는 경우, 무균 25mm 깊은 조직 배양 접시에 투과성 지지체를 반전. 화학 유인 물질 (예를 들어, N-포르 밀 메트로 - 레우 - 반페 (fMLF) 또는 IL-8)를 사용하는 경우, 5.6 단계로 진행합니다.
5. 라이브 또는 사망 BACT와 실험erial 자극, 60 μL RPMI-(모의 감염)이나 세균 접종 단계 3.5에서 준비 (6 × 10 ⁶ CFU)에 각 성의 지원의 혀끝의 측면을 접종. 접시에 뚜껑을 넣고 1 시간 동안 5 % CO _2와 37 ° C에서 알을 품다.
6. 24 웰 로우 부착 판에 잘 RPMI 당 0.6 ML을 추가, 투과 지원 기준도 1을 준비합니다. RPMI이 -하는 PMN 입력을 열거 0.5 ㎖를 포함하는 3 우물을 준비합니다.
   1. 화학 유인 물질은 박테리아 대신에 사용되는 경우, 단계 14.3에서 제조 된 24 - 웰 플레이트 RPMI-0.6 ml로 화학 유인 물질을 추가한다.
7. 24 웰 로우 부착 판에 마우스 오른쪽 투과 지원합니다.
8. 각 성의 지원의 상부 저수지 (기저 측)에, 단계 4.9 준비 0.1 ML PMN (10 ⁶ PMN)를 추가합니다. 직접 500 μl를 포함하는 우물에 100 μL의 PMN 추가 RPMI을. 1 시간 동안 5 % CO _2와 37 ° C에서 알을 품다.
9. 멸균 집게를 사용하여 부드럽게 긁어우물의 가장자리에 투과 지원의 멤브레인은 혀끝의 측면에서 추가 PMN을 제거하고 지원을 처분한다.
10. 부드럽게 1,000 μL 피펫 팁을 잘 각각의 바닥을 긁어 PMN를 수집하고, 튜브의 미세하기 PMN 현탁액을 전송합니다.
11. 혈구를 사용하여 PMN을 열거합니다.
12. 하부 리저버에 PMN의 총 수를 계산하기 위해, 6000에 의해 ^1mm이있는 PMN의 개수 (100 NL)를 곱한다. PMN 번호 10 ⁶ 입력 PMN 정상화로 데이터가 입력 PMN의 백분율로보고하거나 할 수있다.

결과

transuroepithelial 호중구 마이그레이션 분석은 다양한 자극 (그림 1B)에 대한 응답에서 배양 방광 상피 세포 층에 걸쳐 인간의 PMN 이동의 정량적 인 평가를 가능하게한다. 프로토콜은 간단하지만, PMN 이주 영향 결과적으로 본 분석의 재현성에 영향을 미칠 수있는 변수의 개수가있다. 기술 및 생물 복제물 사이의 변동성을 감소시키는 투과성 지지체와 PMN을 준비하는 동안의 대책이되어야한다. 예를 들어, 충분히 합류 5637 세포층을 함유에만 투과성 지지체는 실험에 사용한다. 5637 세포의 합류는 액체 불 투과성을 측정하는 기능 분석을 사용하여 평가된다. 상부 리저버에 첨가 매체 투과성지지 걸쳐 평형화되면, 5637 세포는 실험을하기에 충분히 합류 않는다. 상부 리저버에서 볼륨이 유지되는 경우, 투과성수 지원 PMN 마이그레이션을 평가하기 위해 사용될 수있다. 우리는 세포의 합류에 소폭 상승이 시스템에 transepithelial 전기 저항을 측정하고,이 방법을 선택하면, 치료는 달...

토론

배양 방광 상피 세포 라인과 갓 고립 된 인간의 PMN을 사용하여, 우리는 transuroepithelial 호중구 이주의 체외 모델을 설립했다. 이 모델은 요로 감염 (UTI) 동안 선천성 면역 반응, 일반적으로 UPEC ^(9)에 의해 발생하는 매우 흔한 세균 감염의 복잡성을 해부하기 시작있는 수단이되었습니다. 방광이나 방광염의 감염 동안, 방광 루멘 PMN 모집 세균 통관 ^(10)을 위해 필수적입니다. 염증 반응의 얼굴에 발판을 설정하려면, UPEC는 UPEC 면역 압력 ^6,11의 부재에서 방광 상피 세포에 침입 할 수있는 기간을 연장 방광에 PMN의 도착을 지연. 이 표현형, 초기 시점에서 UPEC로 PMN 이동의 억제는 transuroepithelial PMN 마이그레이션 우리의 체외 모델에서 관찰된다. 비병원성 E. 감염 대장균 MG1655의 이끌어uropathogenic E. 감...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
트랜스웰 인서트 (i.e.  투과성 지지대)	Corning	3472	6.5 mm, 3 μ m pore, polyester membrane insert
BD Vacutainer Blood Collection Tubes	Becton, Dickinson and Company (BD)	366480	sodium heparin이 포함된 16 mm x 100 mm x 10 ml 녹색 캡 튜브
BD Safety-Lok 혈액 수집 및 주입 세트	Becton, Dickinson and Company (BD)	367281	21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing
BD Vacutainer one-use, 쌓을 수 없는 홀더	Becton, Dickinson and Company (BD)	364815
Dextran	Sigma-Aldrich	D4876	Leuconostoc mesenteroides
Ficoll-Paque PLUS 밀도 원심분리 솔루션	GE Healthcare	17-1440-02
초저 부착 플레이트	Corning	3473	24-well, 투명 평면 바닥
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)	Sigma-Aldrich	F3506	DMSO에서 10mM
재조합 인간 CXCL8/IL-8	. D Systems	208-IL	은 PBS에서 100 &mu로 재구성되었습니다. g/ml

은 R&로 재구성되었습니다