방법 논문

함수의 연구, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정을위한 신진 효모 단백질 추출 및 정제

DOI:

10.3791/50921

⸱

2013년 10월 30일

 , 
1Integrated Science Center, Biology Department, The College of William & Mary

이 논문에서

요약

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높은 품질의 효모 세포 추출물의 준비를 개별 단백질 또는 전체 프로테옴의 분석에 필요한 첫 번째 단계입니다. 여기에서 우리는 단백질의 기능, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정 사항을 보존하기 위해 최적화 된 신진 효모 세포에 대한 빠르고, 효율적이며 신뢰성있는 균질화 프로토콜을 설명합니다.

초록

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구슬을 쳐서 균질화 방해 악명 어려운 신진 효모 세포에서 DNA, RNA, 단백질 및 대사 산물을 해제하는 빠르고 효율적인 방법입니다. 여기에서 우리는 기능, 상호 작용과 단백질의 번역 후 수정 사항을 유지하기 위해 최적화 된 버퍼로 단백질의 추출을위한 비드 밀 균질의 사용을 설명합니다. 관심의 단백질을 발현 대수 성장 세포 선택 액상 성장 미디어에서 재배된다. 성장 매체를 유도 프로모터 (예 : 갈락토스)에서 단백질 발현을 유도하는 약으로 보충 할 수 있습니다 (예 : nocodazole) 세포주기 단계를 동기화하거나 (예 : MG132) 프로 테아 기능을 억제. 세포는 침전 및 분해 효소 및 / 또는 인산 가수 분해 효소 억제제를 포함하는 적절한 버퍼에 재현 탁하고도 즉시 처리 또는 나중에 사용하기 위해 액체 질소에 냉동. 균질화은 20 초 BEA의 여섯 사이클에 의해 수행됩니다D-구타 (5.5 m / 초), 얼음의 한 분 배양 한 다음 각. 결과 균질는 원심 분리에 의해 제거되고 작은 입자는 여과에 의해 제거 할 수 있습니다. 결과 삭제 전체 세포 추출물 (WCE)은 웨스턴 블롯 다음 SDS-PAGE로 전체 단백질의 직접적인 분석을 위해 TCA 20 %를 사용하여 침전된다. 추출물은 특정 단백질의 친화력 정화, 번역 후 수정 또는 공동 정화 단백질의 분석의 검출에 적합하다. 대부분의 단백질 정화 프로토콜의 경우와 같은 일부 효소와 단백질은 정제 및 다른 사람을위한 유일한 조건이나 버퍼 조성물에 명시된 조건을 불안정하거나 용해 할 수 필요할 수 있습니다. 후자의 경우, 제시된 프로토콜은 경험적으로 단백질 추출 및 정제를위한 가장 비드를 제패 전략을 결정하는 데 유용한 출발점을 제공 할 수 있습니다. 우리는 에피토프 태그가 SUMO E3 리가, Siz1, 세포주기의 추출 및 정제를 보여Slx5, sumoylated 및 인산화뿐만 아니라, SUMO-대상 유비퀴틴 리가 소단위 모두되어 단백질을 규제.

서론

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효모 유전학의 최고 힘은 전설이지만, 신진 효모 인 Saccharomyces cerevisiae의,에서 네이티브 단백질의 준비 및 분석은 종종 문제가 고민입니다. 후자는 상당한 기계적 강도와 효모 세포벽 1의 탄력성 때문이다. 다른 방법은 효소, 화학, 기계, 압력 기반의 전체 세포 단백질 추출물 2-6를 얻기 위해 효모 세포의 파괴에 대해 설명하고있다. 이 기술은 이후의 분석이나 정제 단계에 사용할 수있는 휴대 대표 네이티브 단백질 추출물을 산출하기 위해 효능 널리 다릅니다. 예를 들어, 효모 세포벽은 세포 용해 효소 (예 : zymolyase) 및 결과 spheroblasts으로 제거 할 수는 전단, 세제, 또는 단백질을 해제 삼투 용해에 의해 중단 될 수 있습니다. 이 방법은 성공적으로 많은 세포 내 fractionations의 시작 지점으로 고용하지만 긴에서 incubate을 필요로하고있다일부 단백질 7의 안정성과 호환되지 않습니다.

효모 세포의 단백질의 화학적 추출을위한 독자적인 효모 용해 시약 (예 : 세제)를 상업적으로 사용할 수 있지만이 단백질 추출 시약 및 단백질의 후속 생화학 적 특성에 미치는 영향의 효과는 항상 8 명확하지 않습니다. 자주 프랑스어 프레스로 불리는 고압 균질는 효과적으로 최초의 고압에게 복종하고 압력 셀에있는 작은 구멍을 통해 그들을 압출하여 효모 세포를 휴식. 이 기술은 높은 품질의 추출물을 생산하지만, 장비는 매우 고가이며, 세포 또는 여러 샘플 9 소량 적합하지 않을 수 있습니다. 따라서, 비드 밀 효모 세포의 기계적 장애는 종종 기본 효모 단백질 제제 10에 대한 선택의 방법입니다. 이 기술은 산 워싱턴 주와 효모 세포 벽의 기계적 장애를 포함셰이커, vortexers 또는 비드 공장의 다양한 수행 할 수 유리 구슬을 흘렸다. 특히이 방법은 동시에 여러 작은 샘플 (세포 이하 1 ㎖)을 처리하는 데 사용할 수 있습니다. 많은 다른 구슬 또는 구슬 밀 중단 매트릭스는 이제 2 ㎖ 튜브에 세포 유형의 거의 모든 종류를 방해하는 상업적으로 사용할 수 있습니다. 다른 기술과 장비를 고려, 비드 밀 단백 분해 효소 및 / 또는 프로 테아 억제제의 적절한 버퍼를 활용하고, 특히 효모 세포의 파괴와 같은 sumoylation로 번역 후 수정 사항을 보존하는 데 도움이 매우 빠르게 발생하는 추가 이점이 있습니다 및 추출물의 온도 제어됩니다.

이 프로토콜은 단백질 기능, 상호 작용, 그리고 번역 후 수정 사항을 보존하는 궁극적 인 목표와 부드러운 상태에서 내생 이상 발현 단백질의 빠르고 효과적이며 신뢰할 수있는 추출에 초점을 맞추고 있습니다. 성장 매체, 세포 용해 버퍼조성 및 비드 밀 설정은 단백질 상호 작용과 같은 sumoylation와 ubiquitylation로 번역 후 수정 사항을 유지하기 위해 최적화되어 있습니다.

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프로토콜

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기본 조건에서 발아 효모 세포에서 발현 6xHIS - 태그 단백질의 정제

1. 단백질 발현의 효모 세포와 유도의 성장

(2에서 수정)

선택 사항 : 관심 대신 아래에 설명 된 갈락토스에 의한 문화의 단백질을 표현 대수 성장 효모 배양을 사용합니다.

  1. 플라스미드 인코딩 갈락토오스 유도 선택의 단백질 6xHIS - 태그와 함께 걸 + 효모 균주의 세포를 변환 할 수 있습니다. 예를 들어, 시약 목록을 참조하십시오.
  2. 2 % 자당을 포함하는 적절한 선택 배지 5 ㎖ (예 : SD-우라실)에 형질 전환을 접종. 30 ° CO / N, 회전을 품다.
  3. 600 nm에서 광학 밀도가 2 % 자당과 선택 배지 33 ㎖에 0.3 (= 0.3 OD 600)를 측정하므로 O / N 문화를 희석. (Δ150 RPM) 흔들어, 30 ° C에서 성장.
  4. 문화 OD 600 = 0.8에 도달했을 때-1.5, 2 % 갈 락토 가진 1x YEP의 최종 농도 6 %의 갈락토스 (표 1 레시피)과 배 YEP의 17 ML을 추가하여 원하는 단백질의 발현을 유도. 전체 문화 볼륨 지금은 50 ML이다. 부화, 추가로 5-6 시간 동안 30 ° C에서 떨고.
    참고 : 문화 볼륨이 변경 될 수 있습니다. 원하는 최종 볼륨의 3 분의 2로 단계 1.3, 희석을합니다. 단계 1.4에서 배 YEP / 6 % 갈락토스의 3 분의 1의 최종 볼륨을 추가합니다.
  5. 4 ℃에서 5,000 rpm에서 5 분 동안 유도 문화와 원심 분리기 세포의 Δ150-200 OD 600 단위의 OD 600을 측정
  6. 1X 프로테아제 억제제 칵테일 2 ML 나사 캡 튜브로 전송과 1 ML 얼음처럼 차가운 1X PBS로 세포 펠렛을 Resuspend.
  7. 4에서 15,000 rpm에서 1 분간 세포를 원심 분리기 ° C. 가만히 따르다 뜨는을.
  8. -80에서 즉시 세포 용해 또는 저장 ° C 더 사용할 때까지 다음, 액체 질소에 동결 세포 펠렛을 끼 웁니다.

2. 효모 세포의 균질화 및 단백질의 추출

  1. 이전 단계에서 냉동 세포 펠렛으로, 산 세척 유리 구슬 200 μL와 얼음처럼 차가운 용해 버퍼 500 μl를 (표 1, 선택의 세포 용해 버퍼를 사용 제조법)을 추가합니다.
  2. 간단히 피펫 아래. 그것은 완전히 세포 펠렛을 resuspend을 할 필요가 없습니다. 항상 얼음에 튜브를 유지한다.
    참고 : 피펫 팁의 끝 부분과 위아래로 pipetting 전에 잘릴 수 있습니다.
  3. 4 ° C에, 장소 비드 밀, 균형, 잠금, 별, 제조업체의 지침에 따라 컴퓨터를 실행에 세포 튜브 (들).
  4. 5.5에서 20 초 동안 튜브 (들)을 포함하는 비드 비터 미터 / 초, 후 1 분 동안 녹은 얼음에 배치를 실행합니다. 총 배 반복합니다.
  5. 4에서 15,000 rpm에서 15 분간 원심 분리하여 추출 된 단백질을 취소 ° C. 선택 사항 : SpinX 필터를 통해 원심 분리하여 작은 입자를 제거합니다.
  6. 전체 세포 전자의 샘플을 준비서양 얼룩에 의해 관심의 단백질의 존재를 확인하기 위해 (WCE) xtract :
    1. 800 ㎕의 20 % 삼염화 초산 (TCA)에 대한 세포의 2 OD 600 단위 (삭제 추출물 등 5 μL 세포의 200 OD 600 단위를 수확 한 경우)와 해당 WCE 추가 할 수 있습니다. 혼합하는 소용돌이.
    2. 4 ℃에서 15,000 rpm에서 2.5 분 동안 원심 분리 뜨는을 가만히 따르다하지만, 펠렛을 유지하도록주의해야합니다.
    3. 4에서 15,000 rpm에서 2.5 분 동안 원심 분리 한 다음 펠렛와 소용돌이 튜브 TCA 2 %의 800 μL, ° C. 추가 뜨는을 가만히 따르다하지만, 펠렛을 유지하도록주의해야합니다.
    4. TCA 샘플 버퍼 100 μL (표 1 레시피), 펠릿을 용해하는 소용돌이를 추가합니다. 참고 : 샘플 버퍼 펠렛에 추가 한 후 (노란색으로 변) 산성되면, Δ10 μL 트리스베이스의 분주 추가 [1M] 샘플이 다시 파란색까지.
    5. 2-5 분 동안 100 ° C 열 블록에 품어.
    6. 소용돌이 AG펠렛의 잔해가 여전히 존재하는 경우 아인 완전히 용해합니다. 이 방법에 의해 제조 펠렛 완전히 용해 악명 어렵습니다. 완전히 알약을 용해 소용돌이로의 Δ10 분 걸릴 수 있습니다.
    7. -80에서 보관 샘플 ° C 더 사용할 때까지.
  7. 더 이상 사용할 때까지 -80에서 액체 질소와 저장소에 남아있는 삭제 WCE ° C의 분주 동결 웁니다.

3. 효모 세포 균질 액에서 단백질의 일괄 정화

참고 :이 정화 방법은 CO 2 + 금속 친 화성 수지에 6xHIS - 태그 단백질의 정제에 최적화되었다.

  1. 수지 평형
    1. 세포의 Δ20-40 OD 600 단위에서 준비 삭제 WCE의 샘플은 microcentrifuge 관에 친 화성 수지의 50-100 μl를 추가합니다. , 원하는 단백질 또는 아밀로오스와 같은 비특이적 수지를 표현하지 않은 세포에서 추출한 단백질은 대조군으로 사용할 수 있습니다특이 바인딩의.
    2. 세척 버퍼 1 ML과 배 수지를 세척 : 상단에 바닥 반전 수지는 현탁 한 후 4시에 5,000 rpm에서 1 분간 회전 될 때까지 ° C. 뜨는을 대기음.
      참고 : 같은 날에 추출 및 정제를 수행하는 경우, 수지 평형을 추출하기 전에 수행 할 수 있습니다.
  2. 친화력 정화를위한 단백질 바인딩
    1. 50-100 μL 세척 구슬로 클리어 해물 100-200 μl를 (Δ20-40 OD 600 단위)를 추가하고 용해 버퍼 1 ML에 총 볼륨을 가져옵니다.
    2. 2-5 시간 동안 4에서 장동 또는 흔들 ° C로 품어.
    3. 4 ℃에서 5,000 rpm에서 1 분간 회전
    4. 원하는 경우, 언 바운드 단백질의 후속 분석을 위해 남은 상층 액의 샘플을 저장합니다. TCA는 WCE (단계 2.6)에 대한 상기 설명 된대로 침전.
    5. 5,000 rpm에서 1 분 동안 회전 한 다음 세척 버퍼 1 ML과 함께 배에 바인딩 단백질과 수지를 씻어4 ° C. 세척하는 동안 샘플 차가운 유지하십시오.
  3. 바인딩 단백질의 용출
    1. 4에서 수지 nutate을 150 μL 용출 버퍼를 추가 ° 5 분 C, 4 5,000 rpm에서 1 분간 회전 ° C와 새로운 튜브에 뜨는을 저장합니다. 옵션 : 2X와 풀 elutions를 반복합니다.
    2. 서양 얼룩에 대한 용출 샘플을 준비 용출 된 단백질의 25 μL에와 25 μL 2X 리튬 도데 실 황산 (LDS) 샘플 버퍼를 추가 2 μL β-메르 캅 토 에탄올 (BME) 2 분 동안 100 ° C 열 블록에 품어.에게
      참고 : 표준 2X Laemmli에 샘플 버퍼를 사용할 수도 있습니다.
    3. 액체 질소에 동결 초과 용출 단백질을 끼 웁니다.
      선택 사항 : 65 배 LDS 샘플 버퍼의 동일한 볼륨 수지 스트립 나머지 단백질 ° C 5 분, 새로운 튜브에 LDS-용출 단백질을 제거한 다음이 아닌 수지, 용출 된 단백질에 2 μL BME를 추가합니다. 이 순서는 conjuga 어떤 이온 항체의 제거를 방지하는 것입니다비즈 테드.
    4. -80 ° C 더 사용할 때까지 매장 샘플.
  4. 적절한 항체와 서양 얼룩 및 프로브 단백질을 시각화합니다.
    1. 각 샘플의 20 μl를 (Δ1-3 OD 600 대)과 선택의 SDS-PAGE 젤의 단백질 사다리의 3-10 μl를로드합니다. 정기적으로이 프로토콜에 사용되는 젤 4-12% 비스 - 트리스 8 % 트리스 - 글리신 있습니다.
    2. 50 분 동안 200 V에서 젤을 실행합니다.
    3. 20 ~ 30 분 (표 1의 조리법)를위한 19 V에서 세미 드라이 송금 젤에서 PVDF 막에 단백질을 전송합니다.
    4. 4 % milk/1x 트리스 블록 막 4 ° C (표 1 레시피)에서 RT 또는 O / N에서 1 시간 동안 식염수 TWEEN (TBST)를 버퍼.
    5. 4 ° C.에서 RT 또는 O / N에서 1-3 시간 동안 4 % milk/1x의 TBST에 대한 관심의 항원 - 태그 단백질 일차 항체로 막을 배양
    6. 5 분 1X TBST로 각각 3 배 막 씻으십시오.
    7. 적절한로 막을 배양보조 고추 냉이 퍼 옥시 데이즈 (HRP) 복합 RT에서 1-3 시간 동안 항체.
    8. 1X TBST의 큰 볼륨 15 분 각 배 막 씻으십시오.
    9. 사란 랩 ECL 기판과 랩으로 막 커버.
    10. 필름 막 노출하고 단백질을 시각화하기 위해 개발.

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결과

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우리의 대표적인 결과를 설명 비드 구타와 단백질 추출 프로토콜 스트림 응용 프로그램 (표 2에 요약)의 다양한 단백질의 재현성 준비에 유용 밝히지. WCEs의 쿠마시 염색 이어 SDS-PAGE 단백질 (~ 12> 250 kDa의)의 넓은 범위 재현성 효모 세포 (그림 1A)에서 추출 할 수 있음을 보여줍니다. 분자량의 범위 이산 밴드는 양질의 단백질 추출물의 지표입니다. 추출물의 품질은 서양 특정 에피토프 태그가 단백질 블롯으로 확인 할 수 있습니다. 그림은 Δ120kDa (그림 1B)에서 마이그레이션 갈락토오스 과발현, V5 태그가 SUMO ligase의 Siz1에 대한 대표적인 결과입니다. 일반적으로, 부분적으로 분해 단백질은 예상 무게 아래에 여러 조각으로 실행됩니다, 그러나 여기에만 전체 길이 단백질이 관찰된다. 주어진 단백질 또한, 고 분자량의 부가 물번역 후 수정을 나타낼 수 있습니다. 예를 들어, 갈락토오스 과발현 su...

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토론

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이 프로토콜은 그대로, 네이티브의 준비에 초점을 맞추고, 사후 translationally 다운 스트림 응용 프로그램의 신진 효모 세포에서 단백질을 수정했습니다. 이 프로토콜을 시도하기 전에, 그것은 관심의 단백질이 쉽게 상태에게 12 변성에서 준비 단백질 추출물에서 발견 할 수 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 클론 항체를 사용할 수없는 경우는 융합 단백질은 서양 말에서 감지 할 수 있도록 태그에게 관심의 단백질을 항원 것이 유리할 수 있습니다. 본 프로토콜에서는, 우리는 HA, 6xHIS-V5, 또는 MYC 에피토프 태그 SIZ1 태그이 전략은 우리가 명확 서양 오 (그림 1)에 단백질과 sumoylated 형태를 식별 할 수 있었다. 높은 친화력 안티 GFP 항체가 (데이터가 표시되지 않음)에 얻기 어려운 가능성이 있기 때문에 우리는 GFP - 태그 단백질을 검출 덜 성공을했다. 또 다른 중요한 문제는 관심의 단백질의 발현 수준에 관한 것이다. 개인의 수준...

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공개 사항

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저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 글

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우리는 그들의 지원을 위해 Kerscher 연구실의 모든 구성원을 감사드립니다. 저희는 효모 균주 MHY3765에 대한 마크 Hochstrasser 감사합니다. 이 작품은 NSF 교부금 1,051,970 (OK)로와 하워드 휴즈 의학 연구소 학부 여행 그랜트 먼로 학자 프로그램 그랜트 (ES를)에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Omni Bead Ruptor 24
ThermoScientificYSC3869유도 및 추출에 사용할 수 있는 GAL+ 효모 균주의ORF
균주 pYES2.1 TOPO 벡터Life TechnologiesK4150-01유도 및 추출에 사용할 수 있는 GAL+ 효모 균주; V5/6xHIS 태그
포함 Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktail ( 100x)Thermo Scientific1860932
2.0 ml 스커트 튜브 with Tethered Screw CapBioExpressC-3369-3튜브가 비드 파열
유리 비드, 산 세척, 425-600 µ m (30-40 US sieve)Sigma-AldrichG8772
Corning Costar Spin-X 원심분리기 튜브 필터Sigma-AldrichCLS8161정화 용해물의 추가 필터링에 사용
TALON Metal Affinity ResinClontech6355026xHIS 태그 단백질의 정제용
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)Life TechnologiesNP0007SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅
NuPAGE 4-12% Bis-Tris GelLife TechnologiesNP0321BOX웨스턴 블로팅 이전에 SDS-PAGE에 자주 사용되는 프리캐스트 젤
Simply BlueLife Technologies#LC6060단백질 겔 염색
포유류 용해 버퍼PromegaG9381대체 상용 용해 버퍼
Anti-V5 아가로스SigmaA7345면역침전법
ECLMilliporeWBKL S0 050
PVDF 멤브레인MilliporeIPVH00010
BIS-TRIS 겔Life TechnologiesNP0321BOX
항-myc 항체Covancemms-150R
2차 항체Abcamab97040염소 pAb-마우스 IgG (HRP)
BG1805

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  13. Elmore, Z. C., Donaher, M., Matson, B. C., Murphy, H., Westerbeck, J. W., Kerscher, O. Sumo-dependent substrate targeting of the SUMO protease Ulp1. BMC Biol. 9, 74(2011).
  14. Xie, Y., Kerscher, O., Kroetz, M. B., McConchie, H. F., Sung, P., Hochstrasser, M. The yeast Hex3.Slx8 heterodimer is a ubiquitin ligase stimulated by substrate sumoylation. J. Biol. Chem. 282 (47), 34176-34184 (2007).

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