복굴절(Birefringence) 및 촉각-유발 탈출 반응 분석(Touch-evoke Escape Response Assay)에 의한 유충 제브라피시의 골격근 결손 분석

요약

제브라피시는 이제 근이영양증, 선천성 근병증 및 관련 신경근 질환을 모델링하기 위한 확립되고 강력한 도구입니다. 복굴절(Birefringence)과 촉각(touch-hoked) 탈출 행동은 초기 발달 과정에서 제브라피시 배아의 근육 무질서 및 기관차 손상 정도를 결정하는 데 사용되는 두 가지 일반적인 비침습적 분석법입니다.

초록

제브라피시(Danio rerio)는 포유류의 높은 유전체 및 구조적 보존으로 인해 근이영양증^1-3, 선천성 근병증^4,5, 육종 조립^{파괴 6,7} 등 골격근에 영향을 미치는 인간 질병을 모델링하는 데 특히 효과적인 도구가 되었습니다⁸. 근육 무질서와 기관차 손상은 수정 후 처음 며칠 동안 제브라피시에서 빠르게 평가할 수 있습니다. 제브라피시의 골격근 결함을 특성화하는 데 도움이 되는 두 가지 분석법은 복굴절(구조적)과 촉각 유발 탈출 반응(행동)입니다.

복굴절(Birefringence)은 빛이 근육 육종(muscle sarcomeres)의 의사 결정 배열(pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres)⁹과 같은 질서 있는 물질을 통과할 때 회전하는 물리적 특성이다. 이는 발달 초기에 반투명 제브라피시 유충의 근육 무결성을 평가하기 위한 간단하고 비침습적인 접근 방식입니다. 고도로 조직화된 골격근을 가진 야생형 제브라피시는 두 개의 편광 필터 사이에서 시각화할 때 어두운 배경 속에서 매우 밝게 보이는 반면, 근육 돌연변이는 모델링하는 원발성 근육 장애에 특이적인 복굴절 패턴을 가지고 있습니다. 근이영양증을 모델링한 제브라피시는 근섬유 퇴행 후 반복적인 재생이 반복되는 질병으로, 편광을 받으면 골격근에 퇴행성 어두운 반점이 나타납니다. 비영양성 근병증은 괴사나 재생 변화와 관련이 없지만 무질서한 근섬유와 골격근 약화를 초래합니다. Myopathic zebrafish는 일반적으로 육종의 무질서를 반영하여 복굴절의 전반적인 감소를 보여줍니다.

촉각 유발 탈출 분석은 촉각 자극^10-12에 대한 배아의 수영 행동을 관찰하는 것을 포함합니다. 야생형 유충과 비교했을 때, 돌연변이 유충은 종종 약한 탈출 수축을 보이며, 느린 수영 또는 단거리 이상 유충을 추진하지 못하는 다른 유형의 운동 장애가 뒤따른다¹². 이러한 분석의 장점은 동일한 어류 유형에서 며칠 동안 생체 내에서 질병 진행을 모니터링할 수 있고 고등 척추 동물에 비해 많은 수의 어류를 짧은 시간에 분석할 수 있다는 것입니다.

프로토콜

1. 복굴절에 의한 골격근 구조의 생체 내 분석

1. 먹이를 먹은 후 오후 늦게 원하는 제브라피시 라인의 암컷과 수컷을 분리하는 짝짓기 케이지를 준비합니다.
   1. 암컷은 더 큰 아랫배와 약간의 파란색/흰색으로, 수컷은 가느다란 체형과 분홍색/노란색 색조로 구별합니다.
   2. 쌍별 교배(수컷 1마리와 암컷 1마리)의 성공률은 약 50%에 불과할 수 있습니다. 더 높은 성공률을 위해 한 마리의 수컷과 2-3마리의 암컷을 짝짓기하십시오.
2. 다음날 아침 해가 진 직후 케이지 칸막이를 제거하고 물고기가 방해받지 않고 산란할 수 있도록 합니다.
3. 탱크 바닥에 충분한 수의 수정란이 낳을 때 여과기를 사용하여 난자를 수집합니다.
4. 거름망을 물고기 물로 헹구어 배아를 깊은 페트리 접시에 옮기고 부모 물고기를 수조로 되돌립니다. 배아 접시를 28.5°C의 인큐베이터에 넣습니다.
5. 그날 늦게 또는 다음 날 아침에 생존할 수 없는 난자와 잔해를 청소하고 추가 성장을 위해 배아를 인큐베이터로 되돌립니다.
6. 배아/유충은 수정 후 3-7일(dpf)에 복굴절을 관찰할 수 있는 적절한 연령에 도달하며, 3dpf 이전의 결과는 잠재적으로 제한된 대비를 겪을 수....

결과

복굴절은 살아있는 제브라피시 배아의 근원섬유 조직 상태를 밝히는 효율적이고 비침습적인 분석법으로 사용될 수 있습니다. 야생형 제브라피시뿐만 아니라 골격근 발달 및 기능에 중요한 유전자의 발현이 감소한 제브라피시의 사례가 제시되어 있습니다. 5 dpf의 야생형 제브라피시는 근필라멘트의 규칙적인 배열로 인해 편광 하에서 매우 높은 복굴절을 보이는 골격근을 나타냅니다(그림 2A-B). 이와 대조적으로, 디스트로그리칸 유전자(dag1)에 병원성 돌연변이가 동형 접합으로 나타난 동일 연령의 배아는 근육 퇴행 부위를 나타내는 불균일한 복굴절을 보입니다(그림 2C-D)². 이러한 패치 형태의 패턴과 초기 발달 단계 전반에 걸친 급격한 근육 퇴행 진행은 다른 근이영양성 어류 모델과 일치합니다^1,3. 5 dpf 근이영양성 dag1 돌연변이체의 복굴절을 정량화한 결과, 야생형 형제 zebrafish에서 관찰되는 최대.......

토론

원발성 신경근 장애는 전통적으로 이영양증 또는 비이영양증 과정으로 분류됩니다. 근이영양증은 근섬유 변성 후 반복적인 재생을 특징으로 하며, 이는 궁극적으로 섬유증으로 대표되는 말기 과정과 지방 조직으로 대체됩니다¹⁴. 대조적으로, 비이영양성 근병증은 괴사나 재생 변화와 관련이 없지만 무질서한 근섬유와 전반적인 골격근 약화를 초래합니다.

제브라피쉬 모델은 최근 몇 년 동안 다양한 신경근 질환의 분자 경로와 병인을 더 잘 이해하는 데 매우 귀중한 자원으로 등장했습니다. 빠른 자궁 외 발달, 반투명 배아, 높은 생식 능력 및 인간과 밀접한 관련이 있는 게놈을 포함하여 이 모델 시스템의 일반적인 장점 외에도 제브라피쉬 질병 모델은 종종 인간 질병을 밀접하게 모방합니다. 골격근 결함이 있는 많은 제브라피쉬는 형태학적 이상을 가지고 있지만 일부 돌연변이 표현형은 심하게 정상이며 더 미세한 특성화가 필요합니다. 이러한 경우와 모든 경우, 복굴절 및 접촉 유.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Tricaine	Sigma	A5040
페트리 접시	Fischer Scientific	0875711Z
집게	Fischer Scientific	100189-588
곤충 핀	Fischer Scientific	S67375
편광 렌즈	Ritz Camera	Quantaray Tristar Optics C-PL 72mm
인큐베이터	Fischer 과학적인	Isotemp 인큐베이터 모델 630D
현미경	Nikon Instruments Inc.	SMZ 1500
카메라	진단 기기 Inc.	SPOT RT3
이미징 소프트웨어	Diagnostic Instruments Inc.	SPOT 5.1 고급