제브라피시는 이제 근이영양증, 선천성 근병증 및 관련 신경근 질환을 모델링하기 위한 확립되고 강력한 도구입니다. 복굴절(Birefringence)과 촉각(touch-hoked) 탈출 행동은 초기 발달 과정에서 제브라피시 배아의 근육 무질서 및 기관차 손상 정도를 결정하는 데 사용되는 두 가지 일반적인 비침습적 분석법입니다.
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방법 논문
복굴절(Birefringence) 및 촉각-유발 탈출 반응 분석(Touch-evoke Escape Response Assay)에 의한 유충 제브라피시의 골격근 결손 분석
이 논문에서
요약
초록
제브라피시(Danio rerio)는 포유류의 높은 유전체 및 구조적 보존으로 인해 근이영양증1-3, 선천성 근병증4,5, 육종 조립파괴 6,7 등 골격근에 영향을 미치는 인간 질병을 모델링하는 데 특히 효과적인 도구가 되었습니다8. 근육 무질서와 기관차 손상은 수정 후 처음 며칠 동안 제브라피시에서 빠르게 평가할 수 있습니다. 제브라피시의 골격근 결함을 특성화하는 데 도움이 되는 두 가지 분석법은 복굴절(구조적)과 촉각 유발 탈출 반응(행동)입니다.
복굴절(Birefringence)은 빛이 근육 육종(muscle sarcomeres)의 의사 결정 배열(pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres)9과 같은 질서 있는 물질을 통과할 때 회전하는 물리적 특성이다. 이는 발달 초기에 반투명 제브라피시 유충의 근육 무결성을 평가하기 위한 간단하고 비침습적인 접근 방식입니다. 고도로 조직화된 골격근을 가진 야생형 제브라피시는 두 개의 편광 필터 사이에서 시각화할 때 어두운 배경 속에서 매우 밝게 보이는 반면, 근육 돌연변이는 모델링하는 원발성 근육 장애에 특이적인 복굴절 패턴을 가지고 있습니다. 근이영양증을 모델링한 제브라피시는 근섬유 퇴행 후 반복적인 재생이 반복되는 질병으로, 편광을 받으면 골격근에 퇴행성 어두운 반점이 나타납니다. 비영양성 근병증은 괴사나 재생 변화와 관련이 없지만 무질서한 근섬유와 골격근 약화를 초래합니다. Myopathic zebrafish는 일반적으로 육종의 무질서를 반영하여 복굴절의 전반적인 감소를 보여줍니다.
촉각 유발 탈출 분석은 촉각 자극10-12에 대한 배아의 수영 행동을 관찰하는 것을 포함합니다. 야생형 유충과 비교했을 때, 돌연변이 유충은 종종 약한 탈출 수축을 보이며, 느린 수영 또는 단거리 이상 유충을 추진하지 못하는 다른 유형의 운동 장애가 뒤따른다12. 이러한 분석의 장점은 동일한 어류 유형에서 며칠 동안 생체 내에서 질병 진행을 모니터링할 수 있고 고등 척추 동물에 비해 많은 수의 어류를 짧은 시간에 분석할 수 있다는 것입니다.
프로토콜
1. 복굴절에 의한 골격근 구조의 생체 내 분석
- 먹이를 먹은 후 오후 늦게 원하는 제브라피시 라인의 암컷과 수컷을 분리하는 짝짓기 케이지를 준비합니다.
- 암컷은 더 큰 아랫배와 약간의 파란색/흰색으로, 수컷은 가느다란 체형과 분홍색/노란색 색조로 구별합니다.
- 쌍별 교배(수컷 1마리와 암컷 1마리)의 성공률은 약 50%에 불과할 수 있습니다. 더 높은 성공률을 위해 한 마리의 수컷과 2-3마리의 암컷을 짝짓기하십시오.
- 다음날 아침 해가 진 직후 케이지 칸막이를 제거하고 물고기가 방해받지 않고 산란할 수 있도록 합니다.
- 탱크 바닥에 충분한 수의 수정란이 낳을 때 여과기를 사용하여 난자를 수집합니다.
- 거름망을 물고기 물로 헹구어 배아를 깊은 페트리 접시에 옮기고 부모 물고기를 수조로 되돌립니다. 배아 접시를 28.5°C의 인큐베이터에 넣습니다.
- 그날 늦게 또는 다음 날 아침에 생존할 수 없는 난자와 잔해를 청소하고 추가 성장을 위해 배아를 인큐베이터로 되돌립니다.
- 배아/유충은 수정 후 3-7일(dpf)에 복굴절을 관찰할 수 있는 적절한 연령에 도달하며, 3dpf 이전의 결과는 잠재적으로 제한된 대비를 겪을 수 있습니다. 야생형 배아는 수정 후 48-60시간(hpf) 사이에 맥락막에서 부화한 후 신체 축이 곧게 펴집니다. 늦게 부화하는 야생형 또는 돌연변이 배아는 수동 dechorionation이 필요할 수 있습니다.
- 날카로운 집게로 융모막을 부드럽게 찢고 배아가 떨어지도록 거꾸로 뒤집습니다.
- 분석을 시작하기 전에 탈각된 배아가 곧게 펴지도록 합니다.
- 배아에 트리카인(물고기 물 중 0.04%)을 마취하여 올바른 위치를 유지하는 데 도움을 줍니다.
- 편광의 각도를 조정하기 위해 회전할 수 있는 편광 렌즈가 있는 해부 현미경을 장착합니다(그림 1A).
- 건조되고 마취된 배아를 신체의 측면 축을 따라 두 번째 편광 렌즈 바로 위에 놓습니다. 두 번째 렌즈는 현미경 스테이지의 상단 렌즈 아래에 위치해야 합니다(그림 1B). 플라스틱은 굴절된 빛의 투과에 적합한 매체가 아니므로 복굴절 분석 중 어느 시점에서도 플라스틱 페트리 접시를 사용하지 마십시오.
- 두 렌즈의 편광 축이 서로 90° 방향을 향하고 배경이 완전히 어두워질 때까지 관심 배아가 보이는 상단 렌즈를 회전합니다.
- 분석의 최적 출력은 두 개의 편광 렌즈 사이의 물고기 방향에 따라 달라집니다. 물고기를 이리저리 움직여 가능한 한 평평하게 눕도록 합니다.
- 물고기가 구부러져 있으면 이 평평한 방향을 가진 세그먼트만 편광을 통과하고 복굴절을 나타냅니다. 이러한 경우, 평평한 영역에서 복굴절을 측정하고 야생형 어류에서 해당 영역의 복굴절을 기록합니다(예: 야생형 어류와 돌연변이 어류 모두에서 somites 1-10).
- 물고기의 복굴절 표현형을 관찰하십시오.
- 고도로 조직화된 골격근을 가진 야생형 물고기는 밝은 복굴절을 보이는데, 이는 근필라멘트와 평행한 빛의 굴절률이 이러한 구조에 수직인 편광보다 높기 때문입니다.
- 비퇴행성 근병증 또는 발달 결함을 암시하는 무질서한 골격근을 가진 물고기는 일반적으로 복굴절의 전반적인 감소를 보입니다.
- 근이영양증의 특징인 무질서한 골격근을 가진 물고기는 일반적으로 패치와 같은 복굴절 패턴을 나타내며, 정상적인 근육 구조의 밝은 영역 중에서 어두운 영역은 근육 퇴화를 나타냅니다.
- 동일한 노출 설정 및 배율로 편광 아래에서 야생형 및 돌연변이 물고기의 이미지를 촬영하여 복굴절을 정량화합니다. 이미지를 .tiff 파일로 저장합니다.
- ImageJ 소프트웨어에서 복굴절 이미지를 엽니다(http://rsbweb.nih.gov/ij/).
- 각 이미지에 대해 도구 모음의 "Polygon Selections" 옵션을 사용하여 몸 주위에 선을 그려 제브라피시 근육 영역을 선택합니다.
- "Analyze(분석)" 드롭다운 메뉴에서 "Set Measurements(측정 설정)"를 사용하여 이미지에 필요한 통계를 선택합니다.
- 최소 선택을 위해서는 "Area(영역)", "Mean gray value(평균 회색 값)" 및 "Min & max gray value(최소 및 최대 회색 값)"에 대한 상자가 선택되어 있어야 합니다.
- 최대 회색 값 >255는 픽셀 채도를 나타냅니다. 따라서 최대 회색 값이 255보다 작은 이미지를 사용하십시오.
- 선택한 영역으로 평균 강도를 정규화하고 각 복굴절 이미지에 대해 동일한 정량화 절차를 반복합니다.
2. 터치 유발 탈출 행동 분석
- 적절한 제브라피시 계통의 짝짓기 쌍을 설정하고 위의 1.1-1.5단계에서 설명한 대로 배아를 수집합니다.
- 수정 후 2-7일째에 분리된 배아/유충을 깊은 페트리 접시 또는 멀티웰 플레이트의 챔버에 개별적으로 넣습니다.
- 한 번에 하나의 배아만 사용하여 SPOT RT3 디지털 카메라 시스템 또는 이와 유사한 시스템을 사용하여 Nikon SMZ1500 실체 현미경의 시야에 배아를 중앙에 배치하고 순차적 이미징을 시작합니다.
- 야생형 어류와 돌연변이 어류 모두에 대해 동일한 빈도의 이미징을 사용해야 합니다. 프레임 속도>30Hz가 권장되는데, 일반적으로 느린 속도로는 야생형 물고기의 빠른 수영을 포착하기에 충분하지 않으므로 속도가 느려집니다.
- 곤충 핀으로 꼬리를 만져 배아에 기계감각 자극을 전달합니다.
- 배아가 수영을 멈추거나 시야 밖으로 헤엄쳐 나갔을 때 이미징을 중지합니다.
- SPOT 5.1 Advanced 소프트웨어를 사용하여 순차적인 이미지를 비디오 파일로 변환하거나 타임랩스 이미지의 개별 프레임을 오프라인으로 분석할 수 있습니다. 유사한 소프트웨어 패키지에는 Open Lab, NIS Elements 또는 무료로 사용할 수 있는 ImageJ(http://rsbweb.nih.gov/ij/)가 포함됩니다.
- 여러 배아에서 촉각 유발 반응을 수행하여 수영 행동을 정량화합니다.
- 이것은 소프트웨어 또는 미터법 자를 사용하여 배아가 수영할 수 있는 거리를 평균화하여 수영 시합의 시작 지점과 끝 지점을 표시함으로써 달성할 수 있습니다.
- 시간이 지남에 따라 배아가 접촉 자극에 익숙해지는 것을 방지하기 위해 각 실험 반복에 대해 새로운 배아로 분석을 수행합니다. 야생형 및 신뢰할 수 있는 돌연변이 모델의 행동은 재현성이 높은 경향이 있습니다.
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결과
복굴절은 살아있는 제브라피시 배아의 근원섬유 조직 상태를 밝히는 효율적이고 비침습적인 분석법으로 사용될 수 있습니다. 야생형 제브라피시뿐만 아니라 골격근 발달 및 기능에 중요한 유전자의 발현이 감소한 제브라피시의 사례가 제시되어 있습니다. 5 dpf의 야생형 제브라피시는 근필라멘트의 규칙적인 배열로 인해 편광 하에서 매우 높은 복굴절을 보이는 골격근을 나타냅니다(그림 2A-B). 이와 대조적으로, 디스트로그리칸 유전자(dag1)에 병원성 돌연변이가 동형 접합으로 나타난 동일 연령의 배아는 근육 퇴행 부위를 나타내는 불균일한 복굴절을 보입니다(그림 2C-D)2. 이러한 패치 형태의 패턴과 초기 발달 단계 전반에 걸친 급격한 근육 퇴행 진행은 다른 근이영양성 어류 모델과 일치합니다1,3. 5 dpf 근이영양성 dag1 돌연변이체의 복굴절을 정량화한 결과, 야생형 형제 zebrafish에서 관찰되는 최대...
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토론
원발성 신경근 장애는 전통적으로 이영양증 또는 비이영양증 과정으로 분류됩니다. 근이영양증은 근섬유 변성 후 반복적인 재생을 특징으로 하며, 이는 궁극적으로 섬유증으로 대표되는 말기 과정과 지방 조직으로 대체됩니다14. 대조적으로, 비이영양성 근병증은 괴사나 재생 변화와 관련이 없지만 무질서한 근섬유와 전반적인 골격근 약화를 초래합니다.
제브라피쉬 모델은 최근 몇 년 동안 다양한 신경근 질환의 분자 경로와 병인을 더 잘 이해하는 데 매우 귀중한 자원으로 등장했습니다. 빠른 자궁 외 발달, 반투명 배아, 높은 생식 능력 및 인간과 밀접한 관련이 있는 게놈을 포함하여 이 모델 시스템의 일반적인 장점 외에도 제브라피쉬 질병 모델은 종종 인간 질병을 밀접하게 모방합니다. 골격근 결함이 있는 많은 제브라피쉬는 형태학적 이상을 가지고 있지만 일부 돌연변이 표현형은 심하게 정상이며 더 미세한 특성화가 필요합니다. 이러한 경우와 모든 경우, 복굴절 및 접촉 유...
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공개 사항
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
감사의 글
복굴절 이미지의 정량화에 도움을 주신 Behzad Moghadaszadeh에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 근이영양증 협회(Muscular Dystrophy Association USA, MDA201302)와 국립 관절염 및 근골격 및 피부 질환 연구소(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, R01 AR044345)의 자금 지원을 받았으며, A Foundation Building Strength, Cure CMD 및 AUism Charitable Foundation의 아낌없는 지원을 받았습니다. VAG는 국립 관절염 및 근골격계 및 피부 질환 연구소(National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)의 K01 AR062601 지원되며, LLS는 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소(National Institute of Neurological Disorders and Stroke)의 F31 NS081928 지원됩니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Tricaine | Sigma | A5040 | |
| 페트리 접시 | Fischer Scientific | 0875711Z | |
| 집게 | Fischer Scientific | 100189-588 | |
| 곤충 핀 | Fischer Scientific | S67375 | |
| 편광 렌즈 | Ritz Camera | Quantaray Tristar Optics C-PL 72mm | |
| 인큐베이터 | Fischer 과학적인 | Isotemp 인큐베이터 모델 630D | |
| 현미경 | Nikon Instruments Inc. | SMZ 1500 | |
| 카메라 | 진단 기기 Inc. | SPOT RT3 | |
| 이미징 소프트웨어 | Diagnostic Instruments Inc. | SPOT 5.1 고급 |
참고문헌
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재인쇄 및 허가
