방법 논문

인간 혈청에있는 N-메틸-D-아스파 라진 산염 수용체 또는 도파민 2 수용체에 대한 항체를 검출하는 높은 처리량 유동 세포 계측법 세포 기반 분석

DOI:

10.3791/50935

⸱

2013년 11월 23일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Neuroscience and Muscle Research, The Kids Research Institute at the Children's Hospital at Westmead, The University of Sydney, 2Flow Cytometry Centre, Westmead Millennium Institute for Medical Research

이 논문에서

요약

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최근 몇 년 동안, 살아있는 세포 기반 분석은 표면과 형태 적 항원에 대한 항체를 검출하기 위해 성공적으로 사용되어왔다. 여기서, 우리는 많은 환자 코호트의 분석을 가능 계측법 높은 처리량의 흐름을 사용하는 방법을 설명한다. 새로운 항체의 검출은 면역 매개 질환의 진단과 치료를 향상시킬 것입니다.

초록

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최근 몇 년 동안, 표면 및 신경 전달에 관여 구조적 단백질에 대한 항체는 어린이와 성인자가 면역 CNS 질환에서 검출되었다. 이 항체는 진단과 치료를 안내하는 데 사용되었습니다. 세포 기반 분석은 환자의 혈청에서 항체의 검출을 개선했습니다. 그들은 다음 형광 색소 - 복합 이차 항체 다음에 희석 한 환자의 혈청으로 배양하는 진핵 세포에서 뇌 항원의 표면 발현을 기반으로합니다. 세탁 후, 바인딩 차 항체는 다음 유동 세포 계측법에 의해 분석된다. 우리 그룹은 안정적으로 특정 신경 전달 물질 수용체에 대한 항체를 검출하는 살아있는 세포 기반 분석 세포 계측법 높은 처리량의 흐름을 개발했다. 이 유동 세포 계측법 방법 곧장 앞으로, 양적, 효율적이며, 많은 환자 코호트 쉽게 짧은 시간으로 측정 될 수 있도록 높은 처리량 샘플러 시스템의 사용을 허용한다. 또한,이 같은 셀 기반말할 간단 중추​​ 신경계 및 말초 신경계 모두에서 많은 다른 항원 표적으로하는 항체를 검출하도록 구성 될 수있다. 추가로 새로운 항체 바이오 마커를 발견하는 것은 신속하고 정확한 진단을 가능하게하고 면역 매개 질환의 치료를 향상시킬 것입니다.

서론

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최근 몇 년 동안, 중추 신경계 (CNS) 질병의 면역 형태가 확인되었다. 이들 질환과 연관된자가 항체의 존재에 의해 정의되는 것으로 밝혀졌다. 이 항체는 신경 세포의 수용체 나 신경 전달의 1,2에 관련된 시냅스 단백질에 결합한다. 다른 항원은 N-메틸-D-아스파 테이트 수용체 (NMDAR) 3-5, γ-아미노 낙산의 B 수용체 (GABA의 B) 수용체 6, α-아미노 -3 - 히드 록시 -5 - 메틸 -4 -로서, 탐지 된 isoxazolepropionic 산 (AMPA) 수용체 7, 전압 - 문이 칼륨 채널 (VGKC) 관련 단백질 : 류신이 풍부한 신경 교종 활성 단백질 1 (LGL-1) contactin 관련 단백질 2 (capsr2) 8,9, 글루타민산 염 수용체 5,10 , 그리고 도파민 2 수용체 (D2R) 11. 과거에는 (주로 뇌염이라는) 이러한자가 면역 CNS 장애는 종종 진단되지 및 치료했다. 이 소설 항체 바이오 마커, 예를 들어,NMDAR의 항체 또는 D2R 항체는 실질적으로 진단과 인식을 개선하고, 환자에 대한 치료 옵션을 열었습니다. 사실, 면역 요법과 조기 치료가 개선 된 결과 (....

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프로토콜

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1. 전략 pIRES2-EGFP 벡터 인코딩 D2R 또는 NMDAR을 구성하는 서브 클로닝

  1. 인간 D2R 또는 NMDAR의 서브 유닛 1 (NR1)의 전체 길이의 cDNA 클론을 구하십시오.
  2. 등의 동시 발현되는 항원 및 GFP를 모두 가능하게하는 강화 된 녹색 형광 단백질 내부 ribosome 항목 사이트 (IRES)의 통제하에 (GFP) 기자와 횡단 단백질의 발현에 적합한 pIRES2-EGFP와 같은 발현 벡터를 선택 별도 세포.
  3. pIRES2-EGFP 벡터 내에서 인간의 cDNA를 서브 클론.
    1. cDNA를 서브 클로닝 적절한 제한 효소를 사용하려면 (인간 D2R cDNA를 예를 들어 NHEI 및 XhoI에 대한).
    2. 결찰 컷 cDNA를 제한 pIRES2-EGFP 벡터 내에 삽입합니다.
    3. 순서는 벡터가 올바른 순서로 포함되어 있는지 여부를 확인하기 위해 pIRES2-EGFP D2R 또는 NMDAR 벡터를 결찰.
    4. 정화 및 형질에 나중에 사용하기 위해 pIRES2-EGFP의 D2R 또는 NMDAR 벡터를 증폭.
itle "> 2. 신경 세포 항원의 발현에 대한 HEK293 세포 형질

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결과

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라이브 HEK293 D2R + CTL 및 HEK293 세포는 높은 처리량 샘플러를 사용하여 유동 세포 계측기로 획득 하였다. 분석하는 동안, 세포는 앞으로 분산 형 (크기)와 사이드 분산 형 (단위) 매개 변수 (그림 1A와 1D)를 기반으로 문이되었다. 형질 감염된 HEK293 세포는 세포질에서 리포터 분자, GFP를 발현하고, 형질 감염되지 않은 세포를 분석 (도 1B 및 1E)에서 제외 하였다. GFP + 게이트 내에서 AF647-복합 항 - 인간 IgG 이차 항체 결합과 관련된 MFI는 (그림 1C 및 1 층)을 측정 하였다. 인간 혈청을 분석 할 때 배경 형광을 해소하기 위해, ΔMFI는 HEK293 D2R + 세포의 MFI (도 1G)까지 HEK293 CTL 세포의

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토론

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본 논문은 높은 처리량 샘플러를 사용하여 특정 세포 표면의 연결 단백질을 표적으로하는 항체를 검출하는 살아있는 세포 기반 분석 유동 세포 계측법의 새로운 응용 프로그램을 설명합니다. 이 기술을 사용하여, 우리는 면역 CNS 질환으로 영향을 환자의 서브 그룹 NMDAR으로 표면 또는 표면 D2R하는 혈청 항체를 가지고 있음을보고한다.

살아있는 세포 기반 분석법 계측법이 높은 처리량의 흐름을 이용하여 최적의 항체 검출을위한 필수 단계는 건강한 형질 감염된 세포의 높은 수율을 얻는) 1 마련되어, 또한 항원이) 검증 높은 세포 표면 발현, 3) 항체의 임계치를 설정하는 양성 컨트롤의 코호트를 사용하여, 4)와 데이터의 재현성을 확인하기.

건강한 세포의 배양이 기술의 성공에 필수적입니다. HEK293 세포 배양, 높은 형질 효율성 및 신경원의 표현의 부족의 용이성을 위해 잘 알려진단백질, 이는 그들이 일반적으로 특정 신경 세포의 항.......

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공개 사항

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관심의 충돌 : 특허는자가 항체에 대한 대상으로 D2R을 주장 FB와 RCD (시드니 대학)에 의해 제기되었다.

감사의 글

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이 작품은 호주 국립 보건 의학 연구위원회, 성 과학 재단 (호주), 뚜렛 증후군 협회 (USA)에 의해 지원되었다, 트리샤 다중 경화증 연구 재단 및 다발성 경화증 연구 호주, 페 트레 재단 (호주), 레베카 L. 장수 의료 연구 재단 (호주). 우리는 모든 환자와 연구에 대한 샘플을 제공하는 가족 구성원을 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
pIRES2-EGFP 벡터클론텍6029-1
인간 HA-도파민-2 수용체(D2R) cDNA미주리 S& T cDNA 리소스 센터DRD020TN00
NMDAR (NR1) cDNAA. Vincent 교수의 선물  (영국 옥스포드)
단클론 정제 마우스 항 인간 NR1 항체 (클론 : 54.1)BD Pharmingen556308
마우스 정제 단일 클론 항 DRD2 IgG (클론 : 1B11)시그마 알드리치WH0001813M1-50UG
알렉사 플루어 647 당나귀 안티 마우스 IgG (H + L)인비트A31571
알렉사 플루어 647 염소 안티 인간 IgG (H + L)인vitrogenA21445
둘베코' s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine 및 110 mg/L sodium pyruvateInvitrogen11995-065
Foetal bovine serumInvitrogen10099-141
GentamicinInvitrogen15710-072
GlutaMAXInvitrogen35050-061
Penicillin-streptomycinInvitrogen15140-122
GeneticinInvitrogen10131-035
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+)Invitrogen14190-144
TrypLE Express (1x) with Phenol RedInvitrogen12605-028
0.9% 염화나트륨BaxterAHF7975
PolyethyleniminePolysciences Inc9002-98-6
VerseneInvitrogen15040-066
XhoIRoche10899194001
NheIRoche10885843001
PureLink PCR 정제 키트InvitrogenK3100-01
JetQuick 젤 추출 스핀 키트Genomed420050
T4 DNA LigaseRoche
플라스미드  플러스  Maxi KitQiagen12963
장비/소프트웨어 이름회사카탈로그 번호모델/버전
고처리량 샘플러 시스템이 있는 유세포 분석기BD BiosciencesBDLSRII with HTS
Inverted microscopeOlympusCKX41 (수은 램프 및 U-RFLT50 전원 공급 장치 포함)
전동 멀티채널 피펫(15-300 μ l)Eppendorf613-2240P12채널 Xplorer Plus
ExcelMicrosoft2010
PrismGraphPad Software, Inc.v4
FlowJoTreestarv7.5
50ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브BD Biosciences352070
6웰 플레이트BD Biosciences353046
조직 배양 플라스크 (T75)BD Biosciences353136
ParafilmPechiney 플라스틱 포장PM-992
V-bottom 96-well 플레이트코닝651180

의 인간 서브유닛 1 10481220001

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins. Neurol. 77, 179-189 (2011).
  2. Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. Autoantibodies associated with diseases of the CNS:....

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재인쇄 및 허가

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태그

HEK 293GFP2

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