이 프로토콜은 항원 밀도 단일 세포 현탁액을 원심 분리하고 그 세포 집단의 마지막 자석 및 / 또는 FACS 정렬 뒤에 조직의 소화 효소의 여러 단계를 통해 인간 흉선에서 제시 세포 분리하는 방법을 자세히 설명.
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이 논문에서
요약
초록
이 프로토콜에서 우리는 인간 흉선에서 수지상 세포 (DC) 및 상피 세포 (TEC)를 분리하는 방법을 제공한다. DC와 TEC의 주요 항원 제시 세포 정상 흉선에있는 (APC) 타입이며, 그것은 그들이 잘 흉선 선택시 뚜렷한 역할을한다는 것을 설정됩니다. 이 세포는 흉선에서 별개의 미세 환경에서 지역화 된 각 APC 유형은 세포의 단지 작은 인구를 구성하고 있습니다. 추가로 이들 세포 유형의 생물학을 이해하기 위해, 이러한 세포 집단의 특성은 매우 바람직하지만 인해 낮은 주파수로, 이러한 세포 유형의 임의의 분리는 효율적이고 재생 가능한 절차를 필요로한다. 이 프로토콜은 다양한 휴대 속성의 특성에 적합한 세포를 얻을 수있는 방법을 자세히 설명합니다. 흉선 조직을 기계적으로 파괴되어 소화 효소의 상이한 단계 후에, 생성 된 세포 현탁액을 퍼콜 밀도 원심 분리 단계를 사용하여 농축한다. 골수 DC (의 CD11c의 격리를위한 <SUP> +), 저밀도 분획 (LDF)의 세포가 자기 세포 분류하여 immunoselected됩니다. TEC 인구 (MTEC, CTEC)의 보충은 특정 세포 마커를 사용하여 (FACS)를 정렬 형광 활성화 된 셀을 통해 그 이후의 분리를 허용하는 저밀도 퍼콜 세포 분획에서 조혈 (CD45 안녕하세요) 세포의 파괴에 의해 달성된다. 고립 셀은 다른 다운 스트림 애플리케이션에 사용될 수있다.
서론
흉선은 T 세포의 발달이 발생하는 기관이다. 흉선은 여전히 이전 시대에 감지 할 수 있지만이 연속적으로 지방으로 대체되는 경우를 상대적 절대적 크기는 나이와 함께 감소한다. 면역 반응에 대한 중요성은 1960 년대 초 1에서 증명되었다.
T 세포 레퍼토리는 기능적 큰폭 자기 관용 T 세포 레퍼토리이 결과, T 세포의 개발에 생존 또는 사망 큐를 선택해 흉선 APC 다른 종류의 펩티드-MHC 복합체와 T 세포 수용체의 상호 작용을 통해 형성된다.
인간 흉선 세포의 약 98 %는 흉선 세포라고도 T 세포를 개발하고있다. 나머지 2 %는 TEC의 다양한 (대뇌 피질, 수질, 낭하), 골수 및 plasmacytoid DC (MDC, PDC), 대식 세포, B 세포, 성숙 재 순환 T 세포, 과립구 등 다양한 종류의 세포들로 구성 에프식 표현형 ibroblasts, 내피 세포와 매우 드문 상피 세포는 근육, 신경, 호흡기 상피 세포와 같은 다른 조직 (그림 1)에서 세포의 닮은. 이들 중, TEC와 DC는 정상 흉선에있는 주요 APC 유형입니다. 최근 몇 년 동안, 문화 및 분자 프로파일 링이 APC 유형의 정화는 점점 더 ....
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프로토콜
1. 도구, 효소 솔루션 및 버퍼의 준비
전에 프로토콜을 시작으로 다음과 같은 예비 단계를 수행하십시오.
- 도구
깨끗하고 건조하며,하면 다음과 같은 도구를 압력솥 사용까지 무균 포장에 보관하십시오.- 흉선 조직을 절단 곡선 또는 직선 하나 팁을 작은 날카로운 가위. 조직을 처리하기위한 톱니 모양의 팁을 작은 곡선 집게.
- 퍼콜 밀도 원심 분리 단계 50 ㎖ 오크 리지 원심 분리기 튜브, PC,.
- 효소액
나는 다음과 같이 (2 MG 콜라게나 / ㎖와 0.1 mg의 DNA 분해 효소 I / ㎖) 혼합 효소 콜라게나 / DNA 분해 효소를 준비- 2 ㎎ / ㎖의 콜라게나 제 용액을 얻었다 RPMI 1640 무지 (아니오 FCS) 250 ㎖의 동결 건조 된 콜라게나 제 A (로슈) 500mg을 녹여. 콜라게나 용해하는 것은 매우 어렵습니다, 그래서 실온에서 롤러 통에 약간의 시간을두고하는 것이 좋습니다.
- 100 밀리그램의 DNA 분해 효소 I (로슈)에 녹여멸균 증류수 10 ㎖. 2.5 ㎖의 분취 량은 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다 2 MG 콜라게나 제 용액 10 ㎎ DNA 분해 효소의 I 솔루션의 ....
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결과
이 프로토콜에서 출발 물질로서 우리는 동의 한 후, 제도적 지침에 따라 얻어진 교정 심장 혈관 수술 (학과 흉부 외과, 대학 병원 튀빙겐의)를받은 아이들에서 제거 흉선 조직을 사용합니다. 이 폐기 물질은 2-30 g 이상에서 크기가 크게 다를 수 있습니다. 수득되는 MDC의 개수와 TEC 서브셋 (CTEC 및 MTEC)은 크기뿐 아니라 분리에 사용 흉선 조직 샘플의 나이에 따라 달라진다.
그림 2는 (~ 9cm) 여섯 살짜리 아이로부터 얻은 조직의 다소 큰 부분을 보여줍니다. 이 프로토콜에서 중요한 첫 번째 예비 단계 (흰색 화살표로 표시) 바람직하지 않은 부분에서 조직의 청소입니다.
단일 퍼콜 밀도 원심 분리를 해제하여 분리 된 단일 세포 현탁액을 구하는 2 항과 프로토콜의 3.1에 기술 된 흉선 조직을 처리 하였다단일 세포 현탁액을 HLA-DR + 세포의 약 3 % (도 3.......
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토론
여기에 설명 된 프로토콜은 Gotter 등 4 발행 프로토콜의 변형이다. 프로토콜의 중요한 단계는 상태와 조직의 초기 제제뿐만 아니라 퍼콜 밀도 분리이다. 우리는 최대한 빨리 수집 한 후 조직을 처리하는 것이 좋습니다. 그것은 청소 및 조직을 절단 할 때 빠르지 만 철저하게 작동하는 것이 중요합니다. 단계 2.3에 기재된 흉선 세포 세척 동안, 간질 세포를 손상시킬 수있는 너무 격렬하고 장기간 압력이 조직 조각에 주사기 플런저의 뒷면에 힘을인가 할 때 균형을 찾기 위해 매우 중요하다. 교란을 유발하지 않고 퍼콜 솔루션 / 세포 현탁액의 상단에있는 매체를 레이어링도 연습이 필요할 수 있습니다. 원심 분리 후, 가능한 한 빨리 퍼콜 용액 최소량 퍼콜 층으로부터 모든 저밀도 분획의 세포를 수집하는 것이 중요하다.
전체 세포 수율 및 상대 APC 번호는 (표 1 참조) 매우 가변적 (특히 연령에 대한) 기증자와 실험의 .......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 CDR2 항체를 제공하는 흉선 샘플 및 브루노 Kyewski (DKFZ, 하이델베르크, 독일)과 함께 우리를 제공하기위한 흉부 외과 부, 대학 병원 튀빙겐의 외과 의사에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 선별 시설 (튀빙겐 대학)에서 한스 - 요 르그 Bühring 사브리나 GRIMM에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 SFB 685과 Hertie 재단에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 및 재료 | |||
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| Dulbecco의 PBS | PAA | H15-002 | |
| 소 태아 혈청-골드 | PAA | A15-151 | |
| 소 혈청 알부민 | PAA | K41-001 | |
| 콜라겐 분해 효소 A | Roche | 10 103 586 001 | |
| DNase I, 등급 II 소 췌장 | Roche | 10 104 159 001 | |
| Trypsin-EDTA 10x in PBS | PAA | L11-001 | 재고 conc. 20 mg/ml |
| Alexa Fluor 488 단백질 라벨링 키트 | 분자 프로브 | A-10235 | |
| 반인간 CDR2 (정제) | Bruno Kyewski, DKFZ- 하이델베르크, 독일 | Alexa Fluor 488 | |
| 반인간 CD45 (Pacific Blue) | Biolegend | 304022 | |
| 안티 휴먼 EpCAM (APC) | Miltenyi Biotec | 130-091-254 | |
| 반-휴먼 CD11c (PE) | Miltenyi Biotec | 130-092-411 | |
| 안티-PE 마이크로비즈 | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| 안티-CD45 마이크로비즈, 인간 | Miltenyi Biotec | 130-045-801 | |
| LS 칼럼 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| 조직 해리기용 | gentleMACS C 튜브 | Miltenyi Biotec | 130-093-237 |
| Percoll (밀도 1.130 g/ml) | GE Healthcare, Life Sciences | 17-0891-01 | |
| 멸균 증류수 (DNAse/ RNAse free) | GIBCO | 10977-035 | |
| Gamunex 10% | Tajecris-Biotherapeutics | G120052 | 1:10 사전 희석, 20 &mu 사용; L/1 x 106cells |
| 0.22 μ m 필터 | Millex GS | SLGS033SS | 주사기 구동 |
| Stericup 필터 유닛 | Millipore | SCGPU05RE | 펌프 구동 |
| 50 ml PC 오크 릿지 원심분리기 튜브 | Nalgene | 3118-0050 | 50 ml |
| 50 ml PP 원추형 튜브 | Becton Dickinson | 352070 | |
| 12 mm x 75 mm 5 ml 시험관 | Becton Dickinson | 352058 | FACS 염색 |
| 세포 여과기 70 μ m | 벡턴 디킨슨 | 352350 | |
| INSTRUMENTS | |||
| Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu) | Becton Dickinson | ||
| Sorvall Evolution R6 (로터) | Kendro | ||
| 로테이터 REAX 2 | Heidolph | ||
| gentleMACS 해리기 | Miltenyi Biotec | 130-093 235 | 조직 해리기 |
참고문헌
- Miller, J. F. A. P. The discovery of thymus function and of thymus-derived lymphocytes. Immunological Reviews. 185, 7-14 (2002).
- Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and c....
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재인쇄 및 허가
