방법 논문

인간의 흉선에서 골수 수지상 세포와 상피 세포의 분리

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DOI:

10.3791/50951

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2013년 9월 19일

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1Department of General Neurology, Hertie Institute for Clinical Brain Research, 2Institute of Pharmacology, University of Bern, 3Department of Immunology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 4Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, University Clinic Tuebingen, 5Department of Neurology, University Hospital Erlangen

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 항원 밀도 단일 세포 현탁액을 원심 분리하고 그 세포 집단의 마지막 자석 및 / 또는 FACS 정렬 뒤에 조직의 소화 효소의 여러 단계를 통해 인간 흉선에서 제시 세포 분리하는 방법을 자세히 설명.

초록

이 프로토콜에서 우리는 인간 흉선에서 수지상 세포 (DC) 및 상피 세포 (TEC)를 분리하는 방법을 제공한다. DC와 TEC의 주요 항원 제시 세포 정상 흉선에있는 (APC) 타입이며, 그것은 그들이 잘 흉선 선택시 뚜렷한 역할을한다는 것을 설정됩니다. 이 세포는 흉선에서 별개의 미세 환경에서 지역화 된 각 APC 유형은 세포의 단지 작은 인구를 구성하고 있습니다. 추가로 이들 세포 유형의 생물학을 이해하기 위해, 이러한 세포 집단의 특성은 매우 바람직하지만 인해 낮은 주파수로, 이러한 세포 유형의 임의의 분리는 효율적이고 재생 가능한 절차를 필요로한다. 이 프로토콜은 다양한 휴대 속성의 특성에 적합한 세포를 얻을 수있는 방법을 자세히 설명합니다. 흉선 조직을 기계적으로 파괴되어 소화 효소의 상이한 단계 후에, 생성 된 세포 현탁액을 퍼콜 밀도 원심 분리 단계를 사용하여 농축한다. 골수 DC (의 CD11c의 격리를위한 <SUP> +), 저밀도 분획 (LDF)의 세포가 자기 세포 분류하여 immunoselected됩니다. TEC 인구 (MTEC, CTEC)의 보충은 특정 세포 마커를 사용하여 (FACS)를 정렬 형광 활성화 된 셀을 통해 그 이후의 분리를 허용하는 저밀도 퍼콜 세포 분획에서 조혈 (CD45 안녕하세요) 세포의 파괴에 의해 달성된다. 고립 셀은 다른 다운 스트림 애플리케이션에 사용될 수있다.

서론

흉선은 T 세포의 발달이 발생하는 기관이다. 흉선은 여전히​​ 이전 시대에 감지 할 수 있지만이 연속적으로 지방으로 대체되는 경우를 상대적 절대적 크기는 나이와 함께 감소한다. 면역 반응에 대한 중요성은 1960 년대 초 1에서 증명되었다.

T 세포 레퍼토리는 기능적 큰폭 자기 관용 T 세포 레퍼토리이 결과, T 세포의 개발에 생존 또는 사망 큐를 선택해 흉선 APC 다른 종류의 펩티드-MHC 복합체와 T 세포 수용체의 상호 작용을 통해 형성된다.

인간 흉선 세포의 약 98 %는 흉선 세포라고도 T 세포를 개발하고있다. 나머지 2 %는 TEC의 다양한 (대뇌 피질, 수질, 낭하), 골수 및 plasmacytoid DC (MDC, PDC), 대식 세포, B 세포, 성숙 재 순환 T 세포, 과립구 등 다양한 종류의 세포들로 구성 에프식 표현형 ibroblasts, 내피 세포와 매우 드문 상피 세포는 근육, 신경, 호흡기 상피 세포와 같은 다른 조직 (그림 1)에서 세포의 닮은. 이들 중, TEC와 DC는 정상 흉선에있는 주요 APC 유형입니다. 최근 몇 년 동안, 문화 및 분자 프로파일 링이 APC 유형의 정화는 점점 더 많은 관심을 얻고있다. 으로 인해 낮은 주파수로, 자세한 분석을 위해 이러한 종류의 세포 중 어느 격리, 효율적인 재현하고 비용 효율적인 절차가 필요합니다. 여기에 제시된 방법은 이전에 발표 된 연구 3,4에서 수정합니다.

다른 조직과 같이, 흉선 세포로부터 추출 효소 단일 세포 현탁액을 얻기 위하여, 세포 - 세포 및 세포 - 매트릭스 상호 작용 네트워크를 disaggregating함으로써 달성 될 수있다. 좋은 분리 효율, 세포 수율, 세포 생존과 세포의의 유지와 같은 특정 매개 변수가 있습니다결정적이며 urface 마커 이러한 희귀 세포 집단의 성공적인 분리를 위해 최적화 될 필요가있다.

이 프로토콜에서, DC 및 TEC의 부분 집합의 분리는 기계적 장애 및 소화 효소에 의해 조직의 단일 세포 현탁액을 만들기에 의해 수행된다. 우리는 조직을 함께 보유하고있는 고유 콜라겐을 분해하는 다른 효소 활성의 균형 잡힌 비율이 클로스 트리 디움 histolyticum에서 콜라게나 제를 사용합니다. DNA 분해 효소 I은 (흉선 세포는 매우 민감하다.) 우리는 또한 티슈 dissociator 의해 보조 기계 및 효소 조직 치료를 포함하는 전형적인 효소 조직 소화에 대안을 제공 인해 사균없는 DNA로 세포 응집을 감소시키기 위하여 효소 용액에 포함된다. 단일 세포 현탁액을 세포의 저밀도 분획 (LDF)의 농축을위한 단일 퍼콜 밀도 원심 분리된다. 세포의이 부분에서, DC는 F를 염색하여 분리 할 수​​있다또는 DC-표면 마커 (즉,의 CD11c의 +) 및 자기 분리 또는 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)를 사용하여. 흉선 세포의 대부분을 구성하는 림프 세포와는 달리, TEC는 높은 수준의 CD45을 표현하지만, 상피 세포 접착 분자 EpCAM에 대한 긍정적하지 않습니다. CTEC는 CDR-2 (대뇌 피질 돌기 망상-2) 항체 4,5 다소 낮은 EpCAM 식으로 인식이 아직 정의되지 않은 항원의 발현에 의해 수질 TEC 구별 될 수있다. 차동 EpCAM 및 CDR2의 공동 발현은 고속 셀을 통해 이러한 TEC 서브 세트들의 효율적인 분리가 6을 정렬한다.

여기에 제시된 프로토콜은 인간의 흉선 조직에 최적화되어 있습니다. FACS 정렬이 사용되는 경우에 절차의 지속 기간은, 조직의 양과 실험자의 능력뿐만 아니라, 셀 소터의 속도에 따라 달라진다. 일반적으로 DC의 분리를위한 프로토콜은 5 이내에 완료 할 수 있습니다-6의 시간과 8 ~ 10 시간에 TEC의 격리를위한. 흉선 조직에서 DC와 TEC의 부분 집합의 격리는 시간에 민감한입니다. 빠른 분리 절차, 세포의 상태 나은. 마지막으로, 절연 세포 mRNA의 비교 연구 및 단백질 발현, PCR 실험, 단백질 분리, 분자량 프로파일 (즉 transcriptomics, 마이크로 RNA 분석)뿐만 아니라 세포 배양 6 같은 추가 조사를 위해 사용될 수있다.

윤리 정책

인간의 흉선 조직에서 작동 할 수 있도록하기 위해 연구원 조직은 일반적으로 미성년자에서 얻을 수 있기 때문에 로컬 윤리위원회 또는 담당 기관뿐만 아니라 기증자의 정보를 서면 동의 (또는 일반적으로 자신의 부모로부터 승인을 받아야합니다 어린이). 또한, 인간의 모든 조직은 잠재적으로 감염성 및 적절한 조치는 등, 장갑, 작업로,주의해야 것으로 취급되어야한다.

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프로토콜

1. 도구, 효소 솔루션 및 버퍼의 준비

전에 프로토콜을 시작으로 다음과 같은 예비 단계를 수행하십시오.

  1. 도구
    깨끗하고 건조하며,하면 다음과 같은 도구를 압력솥 사용까지 무균 포장에 보관하십시오.
    1. 흉선 조직을 절단 곡선 또는 직선 하나 팁을 작은 날카로운 가위. 조직을 처리하기위한 톱니 모양의 팁을 작은 곡선 집게.
    2. 퍼콜 밀도 원심 분리 단계 50 ㎖ 오크 리지 원심 분리기 튜브, PC,.
  2. 효소액
    나는 다음과 같이 (2 MG 콜라게나 / ㎖와 0.1 mg의 DNA 분해 효소 I / ㎖) 혼합 효소 콜라게나 / DNA 분해 효소를 준비
    1. 2 ㎎ / ㎖의 콜라게나 제 용액을 얻었다 RPMI 1640 무지 (아니오 FCS) 250 ㎖의 동결 건조 된 콜라게나 제 A (로슈) 500mg을 녹여. 콜라게나 용해하는 것은 매우 어렵습니다, 그래서 실온에서 롤러 통에 약간의 시간을두고하는 것이 좋습니다.
    2. 100 밀리그램의 DNA 분해 효소 I (로슈)에 녹여멸균 증류수 10 ㎖. 2.5 ㎖의 분취 량은 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다 2 MG 콜라게나 제 용액 10 ㎎ DNA 분해 효소의 I 솔루션의 2.5 ML을 추가합니다.
    3. 살균 필터 Stericup 필터 유닛 (0.22 μm의)를 사용하여 콜라게나 / DNA 분해 효소의 혼합. -20 ° C에서 사용할 때까지 10 ~ 20 ㎖를 분취에 보관할 것.
  3. 버퍼 및 솔루션
    1. 1.5 M 염화나트륨 원액 : RT에서 0.22 μm의 필터와 매장을 통해 솔루션을 필터 1.5 M.의 최종 농도로 증류수 멸균 물에 염화나트륨을 용해.
    2. 배 MACS 버퍼 : 1X PBS (칼슘 2 + / 마그네슘 2 + 무료) 5 % BSA, 20 mM의 EDTA를 포함. 살균 필터 4 ° C에서 0.22 μm의 필터와 매장과 솔루션 이전 차가운 멸균 1X PBS에 배일 배 주식을 희석 1X 용액을 제조 사용합니다.
    3. FACS 버퍼 : 1X PBS (칼슘 2 + / 마그네슘 2 + 무료) 1 % BSA와 0.02 % NaN의 3을 포함.
    4. FACS 버퍼 셀 정렬 용 : 1X PBS (칼슘 2 + / 밀리그램 2 + 무료) 2 % BSA를 포함. 0.22 μm의 주사기 필터를 사용하여 살균 및 4 ℃에서 보관

2. 조직의 준비

조직의 처리는 층류 캐비닛 시약 및 멸균 작업을 사용하여 수행되어야한다. 절차를 시작하기 전에 다음과 같은 시약 및 장비를 준비한다 :

    1. RT에 다음을 따뜻하게 : RPMI 1640 완전 배지 (RPMI 1640, 10 % 소 태아 혈청, 1 % 펜 / 연쇄상 구균), RPMI 1640 일반, 칼슘 2 + / 마그네슘 2 +없는 PBS와 2 배 콜라게나 / DNA 분해 효소 효소 솔루션입니다.
    2. 37 ° C에 회전 장치와 4 ℃로 냉각 고정 각 회 전자 원심 분리기 따뜻한 열 인큐베이터
    3. 얼음 상자를 준비합니다.

참고 :이 단계의 기간은 조직의 상태와 크기에 따라 달라집니다. 약 20 ~ 30 분은 TI의 중간 크기의 조각을 위해 적절한 시간이 필요합니다좋은 상태 ssue (~ 5 ㎝ 폭).

  1. 멸균 PBS를 포함하는 페트리 접시에 조직을두고 잔여 혈액을 씻어 낸다.
    1. 건조 및 집게와 가위 혈전, 결합 및 지방 조직과 건강한 보이지 않는 부분에서 조직을 청소를 사용하여 조직을 방지하기 위해 신선한 PBS를 추가합니다.
    2. 파편의 양을 증가 괴사 조직을 제거하기 위해주의하십시오.
    3. 청소 한 후, 참조 용으로 조직의 무게.
    4. 약 1cm 3 개 조각 / 블록 단위로 조직을 잘라. 조직을 충당하기 위해 충분한 PBS를 추가합니다.

참고 : 결과의 재현성을 위해, 조직이 균일 한 크기의 조각으로 절단한다.

  1. 멸균 주사기 (20 ㎖)의 뒷면을 사용하여 흉선 조직의 조각에 압력 (너무 격렬하게 또는 장기간되지 않음)을 적용한다. 이 절차는, 따라서 나중에 소화 될 조직 부피를 줄이고, 흉선 세포의 대부분을 제거 할 것이다. 얼음이 단계를 수행하고 빠르게 작동합니다.
  2. 흉선 세포가 릴리스 될 때 해결책은 눈에 띄게 흐린 될 것입니다. 5 ㎖ 피펫의 도움이나 유리 흡인기 실수로 조직의 조각을 흡인되지 않도록주의 흉선 세포를 포함하는 상층 액을 제거 부드럽게 한 다음 요리를 저어.

팁 : 무균 세포 배양 긁는 후 요리 (45 ° 각도)를 기울이고 뜨는을 대기음 요리의 한면에 모든 조직의 조각을 집중하는 데 사용할 수 있습니다. 신선한 PBS로 교체하고, 상층 액이 상대적으로 투명하게 될 때까지이 절차를 반복합니다. RPMI 평야와 마지막 세척을 수행합니다.

  1. 날카로운 가위를 사용하여 조직의 조각을 말하다 (미세 가능한 한, 조각은 적어도 2-4mm해야한다). 조각은 5 ML 피펫을 입력 충분히 작아야한다.

3. 흉선 조직에서 단일 세포 현탁액의 준비

여기에,이 단계에 대한 두 가지 다른 방식의 접근이 설명되어 있습니다. 두 번째는 조직 dissociator (3.2)의 도움으로 기계 및 효소 조직의 치료를 포함하는 동안 첫 번째 방법은 일반적인 효소 조직 소화 (3.1)에 대해 설명합니다.

이 프로토콜은 5g 계량 조직 샘플의 처리를 위해 최적화된다. 크거나 작은 조직 샘플의 경우, 그에 따라 효소의 볼륨을 조정합니다.

단일 세포 현탁액을 얻었다 3.1 전형적인 효소 조직 소화

  1. 조직 5g 당 10 ㎖의 콜라게나 / DNA 분해 효소 용액을 50 ㎖ 튜브에 으깬 조직을 놓습니다. 20 ㎖의 총 부피를 제공하기 위해 RPMI 평야를 추가합니다.

참고 : 50 ㎖ 튜브에 조직의 10g까지 소화. 따라서 효소의 볼륨을 조정합니다.

  1. 열 인큐베이터에서 천천히 회전에서 37 ° C에서 40 분 동안 조직 현탁액을 품어.

참고 : 배양 단계는 회전 장치와 열 인큐베이터에서, 또는 쉐이커 37 ° C 세균 배양기에서 하나 수행 할 수 있습니다.

  1. 세포가 그것으로 릴리스 될 때 효소 솔루션은 흐린 될 것입니다. 조직 단편을 침강 2 분 동안 110 XG에 소화, 원심 관의 끝에.
  2. 이 소화 라운드에서 상층 액을 수집합니다. 400 X g에서 10 분 동안 세포 현탁액 펠렛. 세포 펠렛의 크기에 따라 RPMI의 전체의 10 ~ 50 ml 중 대기음 뜨는에 resuspend 세포.
  3. 느슨한 모자와 37 ° C의 배양기에서 세포 현탁액을 유지합니다.
  4. 큰 셀 번호가 요구된다면, 소화 단계는 나머지 조직 절편을 반복하고 제 1 및 제 2 다이제스트 풀링 될 수있다. TEC는 격리해야하는 경우 또한, digestions 두 차례 수행해야합니다.
  5. 트리 판 블루 (1:10-1:100)에 세포 현탁액의 나누어지는을 희석하고 혈구를 사용하여 가능한 세포를 계산합니다.
  6. 퍼콜 밀도 원심 분리 (4 절)로 진행 할 준비가 될 때까지 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포를 유지합니다. DC의 서브 세트 (5 장)의 후속 격리는 이러한 세포에서 수행됩니다.

참고 : 흉선 조직을 단일 세포 현탁액의 소화 효율 및 생성에 영향을주는, 특히 연령, 그들의 조성에 변화 할 수있다.

  1. 흉선 상피 세포 (TEC)의 연속적인 분리를위한 소화 효소의 세 번째 라운드가 필요합니다. 10 신선한 콜라게나 / DNA 분해 효소 솔루션의 ML 플러스 10 ㎖ RPMI의 일반과의 재현 탁 조직 나머지는 솔루션에 트립신 / EDTA (1시 50분 2.5 %의 주식을)를 추가합니다.
  2. 부드러운 회전과 40 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 지난 10 동안 - 배양의 15 분 트립신의 활동을 무력화하기 위해 FCS (1:5)를 추가합니다.
  3. 조직 조각을 침전하는 RT에서 2 분 110 XG에 원심 분리기.

참고 : 조직이 완전히 digestions의이 3 라운드 후 소화되지 않을 수 있습니다. 연령과 조직의 전반적인 상태가 흉선 조직의 분리 효율에 영향이 파라미터이다.

  1. 세포 상층 액을 수집하고 침전 된 조직 조각을 폐기합니다.
  2. 10 분 동안 400 XG에서 세포 상등액을 원심 분리기. RPMI의 완료에 기음 뜨는을 Resuspend 세포 펠렛.

팁 : 세포 펠렛은 매우 느슨한, 그래서 상층 액을 흡입 / 폐기 할 때는주의하십시오.

  1. 혈구를 사용하여 가능한 세포를 계산합니다. 분리 (섹션 4) 퍼콜로 진행 될 때까지 37 ° C 배양기에서 세포를 놓습니다. CD45 안녕 세포의 파괴에 의해 TEC 세포의 후속 사전 농축이 세포 (6 장)에서 수행됩니다.

조직 dissociator의 도움으로 3.2 기계 및 효소 조직 처리

. 다음 프로토콜은 TEC 7,8의 분리를위한 마우스 흉선 조직을 떼어 놓다하는 데 사용의 수정 된 버전입니다.

  1. 콜라게나 제 / DNA 분해 효소 용액 10 ㎖를 함유하는 C 튜브로 전송 다진 조직 조각 (단계 2.5)의 5g.
  2. 조직 dissociator 및 실행 프로그램 m_spleen_02 (10 초)에 C 관을 적응. 이 프로그램을 4 배 (40 ~ 50 초)을 반복합니다.
  3. 37 ℃에서 20 분 동안 부드러운 회전을 품다
  4. RT에서 2 분 110 XG에 원심 분리기.
  5. 상층 액을 수집 단계 3.1.4과 같이 진행합니다. 신선한 콜라게나 / DNA 분해 효소 용액 10 ㎖를 추가합니다.
  6. 조직 dissociator 및 실행 프로그램 m_spleen_01 (56 초)에 C 관을 적응.
  7. 부드러운 회전과 20 분 동안 37 ° C에서 알을 품다.
  8. RT에서 2 분 110 XG에 원심 분리기.
  9. 컬렉터 엔진t 세포 상등액 400 X g에서 10 분 동안 세포 현탁액 펠렛. 단계 3.1.4과 같이 진행합니다.
  10. 3.1.9에 설명 된 바와 같이 소화 번째 라운드는 흉선 상피 세포 (TEC)의 후속 분리를 위해 필요하다. 이를 위해, 10 신선한 콜라게나 / DNA 분해 효소 솔루션의 ML 플러스 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에 재현 탁 조직의 잔해 (주식 1시 50분 희석 2.5 %)
  11. 부드러운 회전과 20 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. FCS (1:5)를 추가하고 추가로 10 분 동안 품어.

주 :이 방법을 사용하여,이 최신 소화 조직 통상 완전히 해리되어 제공된 소화되지 않은 조직 단편이 관찰되지 공정 후에.

  1. 단계로 진행 3.1.11-3.1.14.

4. 퍼콜 밀도 분리를 사용하여 세포의 LDF의 농축

조직의 효소 소화 후 전체 흉선 단일 세포 현탁액은 단일 퍼콜 밀도 centrifugat을 실시LDF 전지용 풍요롭게 이온 단계. 세포의 LDF는 매우 APC에 충실. DC 및 TEC은 모두 세포의이 부분에서 발견된다.

  1. (TEC 분리의 경우) 또는 3 차 다이제스트 (3.1.14) (단계 3.1.8을 참조 풀링 세포) MDC의 격리를 소화 차 1 차 및 2에서 얻은 단일 세포 현탁액을 사용합니다. 10 분 400 XG에 각 소화 단계에서 얻은 원심 분리기 단일 세포 현탁액.
  2. 이 세척 단계 (아래 표에 예 참조) 중에 1.07 g / ㎖의 최종 농도로 퍼콜 용액을 준비한다.
    1.07의 최종 밀도 퍼콜 용액의 조제 g / ㎖ (ρ = 1.07)
    튜브 번호 1 2 3 4
    원액 퍼콜 (ρ = 1.130) (ML) 2.96 5.92 8.88 11.84
    1.5 M의 NaCl (ML) 0.6 1.20 1.8 2.4
    증류수 H 2 O (ML) 2.44 4.88 7.32 9.76
    최종 작업 희석의 볼륨 6 ML 12 ML 18 ML 24 ML
  3. 퍼콜 튜브의 개수는 단계 3.1.8 및 / 또는 3.1.14에서 결정된 세포 수에 의존한다. 멸균 솔루션을 결합하고 철저하게 섞는다. 최적의 분리를 위해, 0.6-1 × 109 세포는 퍼콜의 튜브마다로드 할 수 있습니다. 멸균 솔루션을 결합하고 철저하게 섞는다.

팁 : 퍼콜가 빛에 민감하고뿐만 아니라 추운 보관해야합니다. 먼저 염화나트륨 및 H 2 O (RT)를 포함하는 혼합물을 준비하고 그냥 퍼콜 용액에 세포를 재현 탁하기 전에, 마지막으로 희석 퍼콜을 추가합니다.

십t "> 참고 : 퍼콜 밀도가 서로 다른 공급 업체와 일괄 처리 사이에 다를 수 있습니다 원액 퍼콜 용액의 밀도는 1.130 같지 않으면 ㎍ / ㎖, 퍼콜와 H 2의 정확한 금액을 계산하기 위해 제조업체에서 제공하는 지침을 사용 O 1.07 g / ㎖의 최종 농도를 얻기 위해 필요한.

  1. , 준비 퍼콜 용액 (ρ = 1.07)의 6 ㎖에 1 × 10 9 셀을 재현 탁 균일 한 현탁액을 얻기 위해 충분히 혼합하고, 50 ㎖ 오크 리지 폴리 카보네이트 (polycarbonate) 스크류 캡 원심 분리기 튜브로 전송.
  2. 조심스럽게 퍼콜 솔루션 / 세포 현탁액의 상단에 피펫 튜브 당 전체 RPMI 30 ㎖ 레이어. 이 서스펜션의 상단에 남아 레이어를 방해하지 않도록주의 있도록 천천히 매체를 넣습니다.
  3. 그들은 원심 분리하는 동안 균형있게 같지 무게를 가지고 있는지 확인하기 위해 튜브의 무게를 측정. 그렇지 않은 경우,주의 깊게 성에서 (가벼운 튜브에 더 많은 매체를 추가erile 조건).
  4. 조심스럽게 브레이크 오프와 4 ° C에서 35 분 동안 3,500 XG에 고정 각 회 전자, 스핀과 미리 냉각 원심 분리기 튜브를 전송합니다. 있는지 확인하지 이상 4 ℃에서 원심 분리기의 온도
  5. 원심 분리기에서 튜브를 제거하고 신중하게 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 각 튜브에서 퍼콜 중간 (저밀도 부분) 사이의 계면에서 발견 된 풍부한 APC를 수집합니다. 차가운 RPMI의 완료를 포함하는 50 ㎖ 튜브에 세포를 전송. 나머지 퍼콜을 희석하기 위해 튜브를 입력합니다.
  6. 4 ° C에서 300 XG에 10 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리기 상층 액을 반복 세척을 폐기하십시오.
  7. 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁하고 (트리 판 블루 및 혈구를 사용하여) 셀의 개수를 결정한다. 우리의 경험에서, LDF 세포의 백분율은 효소 분해 후에 얻어진 전체 단일 세포 현탁액의 약 20 % 적습니다. 전형적인 Y저밀도 농축 세포의 ield (젊은 흉선에서, 범위 1 하루 2 년) 총 단일 세포 현탁액 세포의 10 %를 차지, X 10 9 1 당 1 × 8 셀입니다.

참고 :이 단계에서는 세포 (특히 세 연령의 어린이에서 샘플) 정지 집계 것을 관찰 할 수 있습니다. 세포 덩어리가 함께 세포를 찌를 수있다 죽어가는 세포에서 DNA의 출시에서 세포 죽음 및 결과의 표시입니다. 이러한 경우에, 샘플 (50 ㎍ / ㎖)로 DNA 분해 효소 I을 추가하고 자유 DNA 분자를 소화 RT (부드럽게 매 5 분을 반전)에서 최대 20 분 정도 배양한다.

5. 흉선 MDC의 분리

(퍼콜 분리를 통해) APC 농축 후, MDC 효율적 효소 digestions의 제 1 및 제 2 라운드 다음 LDF로부터 분리 될 수있다. 다음 프로토콜은 MDC (의 CD11c의 분리를위한 자기 세포 분리의 수정 된 버전입니다 +).

  1. 원심 분리기 APC 10 7 세포 당 100 μL의 MACS 버퍼에 10 4 ° C에서 최소 및에 resuspend 세포 펠릿 300 XG에 풀링 제 1 및 제 2 소화 효소에서 얻은 단일 세포 현탁액에서 분리 된 세포를 농축.
  2. 10 7 세포마다의 CD11c-PE 항체의 5 μl를 추가합니다.

참고 : 적정 실험이 최적의 결과를 권장합니다.

  1. 잘 혼합하고 빛으로부터 보호 4 ° C에서 15 분, 알을 품다.
  2. 10 분 300 XG에 10 7 세포와 원심 분리기 당 MACS 버퍼의 1-2 ML을 추가하여 세포를 씻으십시오.
  3. 대기음 상층 액을 완전히 MACS 버퍼 80 μL에 10 7 셀을 재현 탁.
  4. 10 7 세포 당 20 ㎕를 방지 PE 마이크로 비드를 추가합니다.
  5. 잘 혼합 (안 소용돌이를 수행)와 빛으로부터 보호 4 ° C에서 15 분 동안 품어.
  6. 단계 5.4에서와 같이 반복합니다.
  7. 버퍼 500 μL에 10 8 셀을 재현 탁.
  8. 필요한 경우, 열 흐름을 방해 할 수 파편 및 세포 응집체를 제거하기 위해 40 μm의 세포 고사를 사용한 필터 세포 현탁액.
  9. 흉선 세포 현탁액은 LS 열을 통해 더 나은 흐름 이후 LS 열을 사용합니다. 제조업체의 지침에 따라 LS 열을 준비합니다. 천천히 생성 거품을 피하고 열 피펫 세포 현탁액. 모든 1 × 10 8 세포에 대해 하나의 열을 사용합니다.
  10. 제조업체의 지침에 따라 열을 씻으십시오. 자석에서 열을 제거하고 둥근 멸균 12 ML 바닥 폴리 프로필렌 튜브에 넣습니다. 3 ㎖의 맥 칼럼에 버퍼를 추가하고 삽입하고 단단히 열에 플런저를 밀어 자기 표지 된 세포를 수집합니다.
  11. 6 분 400 XG에의 CD11c + MDC와 원심 분리기를 나타내는 용출 분수를 수집합니다.
  12. 세포의 수를 결정하고 선택한 셀 populati의 순도를 확인유세포 분석에 의한에. 추천 마커 CD45, CD11c 양성 및 HLA-DR (가) 있습니다.

참고 :의 CD11c + MDC는 또한 FACS 분류기를 사용하여 격리 할 수있다.

6. TEC의 셀 정렬에 대한 CD45 LO / NEG 세포의 농축

TEC의 분리를 위해, 세포는 세포의 선별을 통해 분리를 가속화하기 위하여, CD45 마이크로 비드를 사용하여 CD45 하이 세포의 고갈에 의해 미리 농축 될 수있다.

3 차 소화 단계 (3.1.14)에서 얻은 이후에 퍼콜 원심 분리하여 분리 된 단일 세포 현탁액을 사용합니다.

  1. 300 4 ° C에서 10 분 동안 XG 80 μL 맥에서에 resuspend 세포 펠렛을 원심 분리기 세포 현탁액은 10 7 세포 당 버퍼.
  2. 10 7 세포 당 권장 금액 (6.7 μL)의 1 / 3에서 CD45 마이크로 비드를 사용합니다.

참고 : 하부 양을 사용함으로써마이크로 비즈의 우리는 CD45 이오와 CD45의 NEG 세포 모두 세포를 미리 풍요롭게. 적정은 최적의 결과를 권장합니다.

  1. 부드럽게 튜브 (하지 소용돌이)를 가볍게 치기, 4 ℃에서 15 분 동안 배양하여 잘 섞는다
  2. 4 ° C에서 300 XG에 10 분 동안 MACS 버퍼와 원심 분리기 10 ㎖를 추가하여 세척 언 바운드 마이크로 비즈 대기음이 완전히 뜨는.
  3. 버퍼 500 μL에 10 8 셀을 재현 탁.
  4. 필요한 경우, 열 흐름을 방해 할 수 파편 및 세포 응집체를 제거하기 위해 70 μm의 세포 고사를 사용한 필터 세포 현탁액.
  5. 흉선 세포 현탁액은 LS 열을 통해 더 나은 흐름 이후 LS 열을 사용합니다. 제조업체의 지침에 따라 LS 열을 준비합니다. 천천히 생성 거품을 피하고 열 피펫 세포 현탁액. 모든 10 8 셀에 하나의 열을 사용합니다.
  6. 포함 된 레이블이없는 세포 (흐름을 통해 및 세척)를 수집CD45 LO / NEG의 세포 분획 및 제조 업체의 지침에 따라 열을 씻어.
  7. 10 4 ° C에서 최소 및 세포 수를 확인하고 세포 정렬을 위해 염색을 진행하기 위해 멸균 FACS 버퍼에 resuspend 세포 펠렛 300 XG에 원심 분리기.

7. 형광 활성화 된 셀 정렬에 대한 얼룩 세포

  1. 의 FcR는 비특이적 결합 항체를 줄이기 위해, 종래 세포 얼룩 블로킹 수행한다. 실온에서 15 분 동안 풀링 인간 면역 글로불린 용액으로 세포 현탁액을 품어. 이 시약은 (즉, Gammunex 10 % 용액) 상업적으로 사용할 수 있습니다.
  2. 저온 살균 FACS 버퍼를 추가하여 세포를 씻으십시오. 4 ℃에서 6 분 400 XG에 원심 분리기
  3. 저온 살균 FACS 버퍼에 뜨는에 resuspend 세포를 폐기하십시오. 다음의 예에 따라 5 샘플을 준비 :
    견본 샘플 유형 항체 핸드폰 번호 총 양
    1. 흠없는 제어 1 × 10 6 50 μL
    2.scc * - 퍼시픽 블루 제어 CD45 - 퍼시픽 블루 1 × 10 6 50 μL
    3. SCC-APC 제어 CD3-APC 1 × 10 6 50 μL
    4.scc - 알렉사 488 제어 CD8 - 알렉사 488 1 × 10 6 50 μL
    5. 셀 정렬 분석 CD45 - 퍼시픽 블루
    EpCAM-APC
    CDR2 - 알렉사 488     		10 × 10 6-50 × 10 6 500 μL
    10 X 10 6 cells/100의 μL

    * SCC, 단일 색상 제어

  4. 어둠 속에서 얼음에 30 분간 항체와 세포를 품어.
  5. 4 ℃에서 10 분 동안 400 XG에서 세포를 원심 분리하여 FACS 버퍼로 두 번 세척
  6. (NaN의 3없이 즉) 정렬 멸균 FACS 세포에 대한 버퍼를 사용하여 (셀 정렬 기능에 의해 권장 또는 농도) 1 배 7 세포 / ml로 정렬 할 시료의 세포 농도를 조정합니다.
  7. 정렬하는 동안 세포 계측기를 방해 할 수있는 세포 덩어리를 제거하기 위해 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 샘플을 전달합니다.
  8. 버퍼의 200 ~ 400 μL에 제어 샘플을 Resuspend. 얼음에 튜브를 유지하고 빛으로부터 보호.
  9. 매체 수집 튜브를 준비합니다.

주의 사항 :

  • 최적의 염색에 대한 항체의 적정을 수행합니다.
  • 정렬에 대해 하나의 샘플에서 최대 50 × 10 6 세포의 총 반응 부피에 얼룩이 질 수있다500 μL.
  • 5 ML 팔콘 폴리스티렌 원형 바닥 튜브에 정렬 할 수있는 샘플의 오염을 수행합니다. 단일 색상 컨트롤은 96 - 웰 플레이트의 별도의 우물에 얼룩이 질 수있다.
  • TEC의 부분 집합이 드문 인구 때문에, 그것은 적절한 FACS 설정의 결정을 용이하게하고, 형광 색소의 선택이 보상을 요구하는 경우는 적절한 보상이 있는지 확인하기 위해 각각의 형광 색소를 위해 (고주파) 다른 양의 마커를 사용하는 것이 좋습니다. CD45 + 분획의 세포는 CD45, CD3 또는 다른 형광 색소에 대한 CD8 등의 마커로 염색 할 수 있으며 염색 후에 흠 CD45 + 세포 샘플에 첨가 될 수있다.

8. 형광 활성화 된 셀 정렬하여 TEC의 분리

(MTEC) 또는 EpCAM 싸다 CDR2 + (CTEC) - TEC 부분 집합은 EpCAM 안녕하세요 CDR2과 CD45 LO / NEG 분획에서 정렬 할 수 있습니다.

  1. 샘플 재치를 실행H 흠없는 세포와 규모에 대한 관심의 인구를 배치하기 위해 전방 및 측면 산란을 조정합니다. 세포가 볼 수 있지만 히스토그램의 맨 왼쪽 손 부분에 위치하도록 각 검출기의 전압을 조정합니다.
  2. 각 단일 스테인드 샘플을 실행하고 각 색상 보정을 조정합니다.
  3. 흠과 하나의 스테인드 컨트롤 전압과 보상을 조정 한 후 샘플을 정렬 할 실행하고 관심의 인구를 정​​의하는 데 사용하는 게이팅 도구. 세포 파편을 제외하면서, 모든 기질 세포 크기의 포함을 보장하기 위해 다양한 전방 및 측면 산란 게이트를 사용합니다.
  4. CD45 낮은 CD45 NEG 세포에 앞으로 분산 형 게이트 대 CD45 - 퍼시픽 블루와 도트 플롯.
  5. CDR2 점 플롯 대 EpCAM이 게이트를 적용하고 정렬 할 수있는 인구를 게이팅에 의해 결정합니다.
  6. 게이트가 결정되고 나면, 그 인구를 포함하는 문을 선택하고 정렬을 시작합니다.
    7. 일단 분류 세포는 원심 분리기 세포 현탁액, 수집 된, 선택의 매체 또는 버퍼에 resuspend 세포는 의도 된 다운 스트림 응용 프로그램을 따라.

주 : 포집 관의 측면에 붙어있는 세포를 방지하기 위해 정렬하는 동안 튜브를 PBS 50 % FCS로 메워 미리 코팅 될 수 있고, 30 분 동안 RT에서 배양한다. 미디어 컬렉션에 추가하기 전에 코팅 용액을 버린다.

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결과

이 프로토콜에서 출발 물질로서 우리는 동의 한 후, 제도적 지침에 따라 얻어진 교정 심장 혈관 수술 (학과 흉부 외과, 대학 병원 튀빙겐의)를받은 아이들에서 제거 흉선 조직을 사용합니다. 이 폐기 물질은 2-30 g 이상에서 크기가 크게 다를 수 있습니다. 수득되는 MDC의 개수와 TEC 서브셋 (CTEC 및 MTEC)은 크기뿐 아니라 분리에 사용 흉선 조직 샘플의 나이에 따라 달라진다.

그림 2는 (~ 9cm) 여섯 살짜리 아이로부터 얻은 조직의 다소 큰 부분을 보여줍니다. 이 프로토콜에서 중요한 첫 번째 예비 단계 (흰색 화살표로 표시) 바람직하지 않은 부분에서 조직의 청소입니다.

단일 퍼콜 밀도 원심 분리를 해제하여 분리 된 단일 세포 현탁액을 구하는 2 항과 프로토콜의 3.1에 ​​기술 된 흉선 조직을 처리 하였다단일 세포 현탁액을 HLA-DR + 세포의 약 3 % (도 3...

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토론

여기에 설명 된 프로토콜은 Gotter 등 4 발행 프로토콜의 변형이다. 프로토콜의 중요한 단계는 상태와 조직의 초기 제제뿐만 아니라 퍼콜 밀도 분리이다. 우리는 최대한 빨리 수집 한 후 조직을 처리하는 것이 좋습니다. 그것은 청소 및 조직을 절단 할 때 빠르지 만 철저하게 작동하는 것이 중요합니다. 단계 2.3에 기재된 흉선 세포 세척 동안, 간질 세포를 손상시킬 수있는 너무 격렬하고 장기간 압력이 조직 조각에 주사기 플런저의 뒷면에 힘을인가 할 때 균형을 찾기 위해 매우 중요하다. 교란을 유발하지 않고 퍼콜 솔루션 / 세포 현탁액의 상단에있는 매체를 레이어링도 연습이 필요할 수 있습니다. 원심 분리 후, 가능한 한 빨리 퍼콜 용액 최소량 퍼콜 층으로부터 모든 저밀도 분획의 세포를 수집하는 것이 중요하다.

전체 세포 수율 및 상대 APC 번호는 (표 1 참조) 매우 가변적 (특히 연령에 대한) 기증자와 실험의 ...

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공개 사항

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

우리는 CDR2 항체를 제공하는 흉선 샘플 및 브루노 Kyewski (DKFZ, 하이델베르크, 독일)과 함께 우리를 제공하기위한 흉부 외과 부, 대학 병원 튀빙겐의 외과 의사에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 선별 시설 (튀빙겐 대학)에서 한스 - 요 르그 Bühring 사브리나 GRIMM에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 SFB 685과 Hertie 재단에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약 및 재료
RPMI 1640PAAE15-842 
Dulbecco의 PBSPAAH15-002 
소 태아 혈청-골드PAAA15-151 
소 혈청 알부민PAAK41-001 
콜라겐 분해 효소 ARoche10 103 586 001 
DNase I, 등급 II 소 췌장Roche10 104 159 001 
Trypsin-EDTA 10x in PBSPAAL11-001재고 conc. 20 mg/ml
Alexa Fluor 488 단백질 라벨링 키트분자 프로브A-10235 
반인간 CDR2 (정제)Bruno Kyewski, DKFZ- 하이델베르크, 독일Alexa Fluor 488
반인간 CD45 (Pacific Blue)Biolegend304022 
안티 휴먼 EpCAM (APC)Miltenyi Biotec130-091-254 
반-휴먼 CD11c (PE)Miltenyi Biotec130-092-411 
안티-PE 마이크로비즈Miltenyi Biotec130-048-801 
안티-CD45 마이크로비즈, 인간Miltenyi Biotec130-045-801 
LS 칼럼Miltenyi Biotec130-042-401 
조직 해리기용gentleMACS C 튜브Miltenyi Biotec130-093-237
Percoll (밀도 1.130 g/ml)GE Healthcare, Life Sciences17-0891-01 
멸균 증류수 (DNAse/ RNAse free)GIBCO10977-035 
Gamunex 10%Tajecris-BiotherapeuticsG1200521:10 사전 희석, 20 &mu 사용; L/1 x 106cells
0.22 μ m 필터Millex GSSLGS033SS주사기 구동
Stericup 필터 유닛MilliporeSCGPU05RE펌프 구동
50 ml PC 오크 릿지 원심분리기 튜브Nalgene3118-005050 ml
50 ml PP 원추형 튜브Becton Dickinson352070 
12 mm x 75 mm 5 ml 시험관Becton Dickinson352058FACS 염색
세포 여과기 70 μ m벡턴 디킨슨352350 
INSTRUMENTS
Flow Cytometer-Sorter (BD FACSAriaTMIIu)Becton Dickinson 
Sorvall Evolution R6 (로터)Kendro 
로테이터 REAX 2Heidolph 
gentleMACS 해리기Miltenyi Biotec130-093 235조직 해리기

참고문헌

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