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DOI:

10.3791/50964

⸱

2013년 11월 22일

 ,  ,  , 
1Center for Molecular Bacteriology and Infection, Imperial College London

이 논문에서

요약

왁스 나방 갤러리아 mellonella의 유충은 최근 레지오넬라 뉴모 감염을 연구하는 생체 내 모델로 설립되었습니다. 여기, 우리는 예방 접종, 세균 독성 및 복제의 측정뿐만 아니라 감염된 혈구 세포의 추출 및 분석을 포함하여 유충에서 레지오넬라 균의 발병을 특징 짓는 기본적인 기술을 보여줍니다.

초록

레지오넬라 뉴모 필라는 레지오넬라 병이라는 중증 폐렴의 원인이되는 에이전트는 감염과 폐포 대 식세포 내 복제 중요한 인간 병원체입니다. 그 독성은 공포 (LCV)를 포함하는 레지오넬라 균으로 알려진 복제 허용하는 공포를 구축하는 것이 필수적입니다 점 / ICM 타입 IV 분비 시스템 (T4SS)에 따라 달라집니다. L.을 뉴모 감염 그러나 대부분의 마우스 종자가 새로운 감염 모델에 대한 검색에 이르는, 관대하지 않은 생쥐에서 모델링 할 수 있습니다. 우리는 최근에 왁스 나방 갤러리아 mellonella의 애벌레는 L.의 조사에 적합한 것으로 나타났습니다 뉴모 감염. G. mellonella 점점 인간의 병원체에 대한 감염의 모델로 사용하고 좋은 상관 관계는 곤충과 포유 동물 모델에서 여러 세균 종의 독성 사이에 존재한다. 애벌레의 면역 방어의 핵심 구성 요소는 혈구 세포, 직업입니다침략자를지고 파괴 알 식세포. L. 뉴모는 감염 LCV를 형성하고 이들 세포 내에서 복제 할 수있다. 여기에서 우리는 L. 분석을위한 프로토콜을 보여 G.에서 뉴모 독성 전염성 L.에게 성장하는 방법을 포함 mellonella 모델, 뉴모는 억제제 유충을 전처리 유충 감염 및 정량화 및 면역 형광 현미경에 감염된 세포를 추출하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 또한 경쟁 분석에 박테리아 복제 및 체력을 정량화하는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 접근법은 L. 중요한 요소를 결정하는 돌연변이의 신속한 선별을 허용 이 복잡한 병원체에 대한 우리의 이해를 돕기 위해 새로운 도구를 설명 뉴모 독성.

서론

감염 동물 모델은 박테리아 독성 요인의 판정에 귀중한 입증되었다. 그러나, 무척추 동물 모델은 감염의 기존의 포유 동물 모델에 대한 실행 가능한 대안으로 증가 된 관심을 얻고있다. 왁스 나방의 유충은, 갤러리아 mellonella 점점 1 그람 양성과 그람 음성 세균 2,3 여러 병원성 곰팡이 4,5 등의 중요한 인간 병원균의 숫자를 연구하는 데 사용하고있다. 곤충 모델을 사용 무척추, G. 등, 기존의 포유 동물 모델에 비해 많은 장점을 가지고 mellonella 포유 동물 모델의 윤리적 제한이 적용되지 않습니다. 또한, 유충은 쉽게 유지 될 수 마취없이 주사로 감염, 화학 억제제 6 전처리를 거쳐 37 ° C에서 7시에 배양을 유지. 흥미롭게도, G. 여러 미생물의 병원성 사이의 상관 관계 멜lonella 감염의 포유 동물 모델 2.8을 설립되었습니다. G.의 면역계의 증가 이해 mellonella는이 모델 생물의 특성에 도움을주었습니다. 포유 동물에서 볼 수있는 곤충 적응 면역 체계를 가지고 있지 않지만, 그들은 항균 펩티드 (9)의 생산을 포함하여 정교한 세포 및 상완골 방어를하지 않아도됩니다. 혈구 세포는 세포 방어의 주요 매개체하고 있습니다 G.의 체액 (혈액)에서 발견 된 가장 많은 세포 유형 mellonella 10,이 세포는 전문 식세포하고 모두가 복용하고 phago - 리소좀 구획 10, 11에서 박테리아를 분해하고 박테리아 침입 주위에 결절을 형성, 물리적으로 박테리아 복제 (12)를 제한함으로써 인간 대 식세포 및 호중구 유사한 기능을 수행합니다.

레지오넬라 뉴모 필라 심각한 pneumoni을 일으키는 호흡기 병원체이러한 노인 또는 13 면역 등 취약 인구 (레지오넬라 병). 레지오넬라 균이 신선 물 아메바 (14, 15)의 다양한 종의 병원체 환경과 인공 모두 수원에서 보편적으로 발견된다. 레지오넬라 균이 살아남아 숙주 세포 16-20으로 275 이상의 이펙터 단백질을 이동시키다하는 4 분비 시스템 (T4SS)를 입력 도트 / ICM (세포 기관의 매매에 결함 / 세포 증식)로 알려진 다중 단백질 복합체를 이용하여 이러한 전문 식세포 내에서 복제합니다. 이 단백질은 공포 (LCV)를 포함하는 레지오넬라 균의 생성에 이르는, 정상적인 숙주 세포의 식세포 경로를 파괴하는 역할을한다. LCV는 리소좀과 융합을 방지하고 대신 소포체을 모집 (ER) 거친 ER 21, 22과 유사한 전문 구획의 결과로, 소포를 파생. L.는 뉴모은 우발적 인 인간의 경로로 간주됩니다ogen 그것은 아메바에서 복제 할 수 같은 전략은 또한 인간의 폐포 대 식세포 (23)의 복제를 할 수 있습니다.

포유류의 호스트는 마우스와 기니아 피그 (24, 25)을 포함하여 인간의 레지오넬라 균 감염에 대한 모델로 특성화되었다. 그러나, 마우스 균주의 대부분은 가벼운 자기 - 제한적 감염 24 개발 근친 변종 A / J 마우스를 제외 레지오넬라 감염 (26)에 저항한다. 기니 피그 모델은 더 밀접하게 인간의 질병 (25), 돌연변이의 부족을 닮아 비용 증가는 사용을 권장하지 않지만 27. 또한, 여러 무척추 동물 모델 Caenorhabditis의 28 엘레 간스 등의 레지오넬라 뉴모 필라 감염 개발 된 초파리는 29 melanogaster의 여러 종 아메바 30-32의. 그러나 이러한 모델은 C. 약점, 독성이 엘레 시스템은이 모델의 유용성을 제한, 28 점 / ICM에 의존하지 않습니다. 초파리 모델은 세균의 독성이 29 요소와 그러나 유망한 것으로 나타납니다 조사에 효과가 입증되었다,이 모델은 완전히 특징되지 않았습니다. 단세포 아메바는 L.의 환경 호스트입니다 뉴모 및 분자 수준에서 33 독성 인자의 작용을 조사하기에 이상적이다 그러나 같은 카스파 제 (34)와 같은 감염 포유 동물 숙주 세포 반응의 몇몇 중요한 매개체 부족하다. 포유 동물 실험에 관련된 높은 비용과 윤리적 인 문제와 함께 기존 모델의 약점은 다른 적절한 모델 생물 29,35에 대한 검색되었다.

우리는 최근에 보여준 그 G. mellonella는 L.에 적합한 모델입니다 뉴모는 (36, 37)를 발병. 이 프로토콜은 감염에 사용되는 실험 기술의 자세한 사항G.를 보내고 mellonella의 유충, 애벌레 도덕성을 분석 계산과 면역을위한 혈구 세포를 추출 가능한 CFU로 복제를 결정하는 감염된 유충에서 계산합니다.

프로토콜

1. L.의 준비 감염에 대한 뉴모

  1. 숯 효모 추출물 (CYE) 플레이트 (2 G / L 활성탄, 10g / L의 효모 추출물, 13g / L의 한천, 10g / L N-(2 - 아세트 아미도) -2 - aminothanesulfonic 산 (ACES)을 준비 1 G / L의 α-케토 글루 타르 산, 0.4 g / L의 L-시스테인 염산 0.25 g / L에 피로 인산 제이철, 산도 6.9).
    참고 : 필요한 경우, 접시를 CYE (6 ㎍ / ㎖) 카나마이신을 추가 (25 ㎍ / ㎖) 및 / 또는 클로람페니콜.
    1. 모든 L.을 수행 바이오 안전성 봉쇄 레벨 2에서 뉴모 일 (BSL-2) 현지 법률을 준수 미생물 안전 캐비닛 (MSC)에서.
  2. 행진 L. CYE 판에 -80 ° C 글리세롤 주식에서 뉴모
  3. 37 ℃에서 4 일 동안 접시를 품어
    참고 : 4 일 동안 접시의 배양이 크게 L.의 독성을 증가 G.에서 뉴모 3 일간 배양에 mellonella.
  4. 감염 전 어느 날, 한 루프 쿵푸를 재현 탁데워진 1 ㎖에있는 박테리아의 LL (여러 식민지를 포함) (37 ° C)는 효모 추출물 (AYE) 국물 에이스와 분광 광도계를 사용하여 600 nm의 (OD 600)에서 흡광도를 측정한다.
  5. 최종 OD 0.1의 600 (필요한 경우 항생제로) 새로운 3 ㎖의 AYE 문화를 접종한다.
    1. 매체를 포함하는데, 이는 미디어의 불임을 보장하기 위해 제어합니다.
  6. 21 시간 동안 200 rpm에서 진탕 배양기에서 37 ° C에서 알을 품다.
    참고 : 박테리아 감염 38 후 지수 단계로 성장해야한다. 21 시간 동안 성장하는 것은 실험을 표준화 할 수 있습니다.
    참고 : 단백질의 유도를 위해 필요한 경우, 하룻밤 이소 프로필 0.5 mM의 β-D-1-티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 추가합니다.
  7. 600 (박테리아 후 기하 급수적 인 성장 단계, OD 600 2.5-3에 있어야합니다) OD를 측정한다.
  8. 멸균 둘 베코 인산염 완충 생리 식염수 (D-PBS)에 1 × 109 CFU / ㎖을주는 박테리아 문화를 희석.
    주의: 이전의 결과를 바탕으로, OD 1 600 그러나이 다른 L.에 대해 확인해야한다, 1 × 109 CFU / ㎖에 해당 뉴모 변종.
    참고 : 플라스미드로부터 단백질의 유도가 요구되는 경우, 접종에 1mM의 IPTG를 추가한다.
  9. 예상 CFU가 접종에 존재하는 보장하기 위해 대조군으로 9 절에 설명 된대로 접종 플레이트.

2. 애벌레의 준비

  1. 충분한 G.에게 구입 mellonella 상용 공급 업체에서 애벌레. 유충은 5 번째 나 6 번째 령 단계 (길이 약 사이 2-3센티미터)에 제공되며 바로 사용하기에 적합합니다.
    참고 : 유충 이전 39 설명 된 방법에 뒤 설명하는 방법을.
    참고 : 유충은 최대 두 주 동안 실온에서 저장 될 수 있고 음식을 필요로하지 않는다. 즉시 용화의 조짐을 보이고있는 유충을 버린다.
  2. PLAC하여 유충의 용기를 준비합니다10cm 배양 접시의 바닥에 10cm 여과지의 원을 주입.
  3. 무딘 핀셋을 사용하여 배양 접시에 거의 같은 크기 10 건강한 애벌레를 놓습니다.
    참고 : 건강에 해로운 찾고 색 갈색 얼룩 투성이의 곤충을 폐기하십시오. 건강한 애벌레 균일 크림 어두운 변색없는 지역으로 착색 및 인계하면 신속하게 스스로를 잘 할 수 있습니다.

3. G.의 감염 mellonella 애벌레

  1. 표면에 종이 필터의 원을 테이핑하여 주입 플랫폼을 준비합니다.
  2. 안전 주입 플랫폼을 만들기 위해 필터 종이에 가로 P1000 팁을 테이프. 이 멸균 할 필요가 없습니다.
  3. 70 % 에탄올을 흡입하고 적어도 10 분 동안 배양하여 20 ㎕의 마이크로 타이 주사기 멸균.
    1. 주입하는 동안 펑크 방지 장갑을 착용,
  4. 여러 번 흡입 및 멸균 물을 추방하여 잔류 에탄올을 제거합니다.
  5. USIL.의 주사기 흡인 액 10 μl를 겨 뉴모 1 × 109 CFU / ㎖ 현탁액.
  6. 한 유충을 가지고 조심스럽게 단단히 다시 켜, P1000 팁 구부러진.
  7. 유충의 전면 오른쪽 proleg에 주사기의 끝을 놓으십시오.
  8. 온화는 유충 내에 있는지 확인한 proleg에 바늘 끝을 삽입하고 매끄럽게 주사기의 모든 내용을 주입.
    참고 : 주사기가 올바르게 삽입되어있는 경우,이 챔버에 배치하기 만 주사기를 사용하여 유충을 선택 할 수 있어야한다.
    1. 주입 후 몇 초 동안 유충을 관찰합니다. 유충은 몇 초 후 크롤링을 시작하지만 액체를 배설하지 않아야합니다.
  9. 10 7 CFU L. 감염, 간단히 몇 시간이 게시물 감염 유충을 관찰 뉴모 130B는 제 5-8 시간 파이 내에서 어떤 증상을 일으키지 않습니다 따라서 유충 블랙 / 회색이 시점 이전에, t 회전하는 경우그는 실험을 중단해야한다.
    주 : 1 mM의 IPTG와 애벌레의 접종 실험의 과정을 통해 유충의 생존에 영향을주지 않습니다.
  10. 동일하게, 애벌레의 사망률을 분석하는 제어 역할을하는 D-PBS로 주사 열 애벌레 등 조건 당 10 유생의 다운로드를 주입​​.
  11. 테이프 배양 접시 폐쇄 및 보조 봉쇄의 장소.
  12. 실험 기간 동안, 37 ° C에서 표준 세균 배양기에서 배양한다.

4. 화학 억제제와 유충의 전처리

  1. 섹션 3.1-3.6에 설명 된대로 이전에 감염, 주사 유충을 준비합니다.
  2. 전면에 사이토 D의 100 μM 용액 10 μL을 주입, (10) 애벌레의 proleg을 떠났다.
    참고 : 억제제가 애벌레 부상을 줄이기 위해 세균 현탁액에서 다른 proleg에 주입된다.
  3. 컨트롤로 10 유충에 DMSO의 10 μl를 주입한다.
  4. 에서 애벌레를 품어4 시간, 37 ° C에서.
  5. 전면에 3 절에 설명 된대로 우측 1 × 10 7 하나와 proleg, 전처리 유충을 주입 WT L.의 CFU 뉴모 또는 PBS 제어 할 수 있습니다.

5. 애벌레 사망률 분석

  1. 18 시간 게시물 감염 (PI)에서 사망률에 대한 모든 감염된 유충을 검사합니다.
  2. , 사망을 확인 애벌레를 뒤집어 다리의 움직임을 찾기 위해 끝이 무딘 핀셋을 사용하려면, 건강한 애벌레를 신속하게 스스로를 잘해야합니다. 색소 침착은 감염에 대한 강력한 면역 반응을 나타냅니다. 어떤 움직임이있는 경우에, 살아있는 센다.
  3. 죽은 살아있는 애벌레의 레코드 번호.
  4. 선택한 다른 모든 시점에서이 과정을 반복합니다.
    주의 : 항온 처리는 3 일 이상 동안 지속되는 경우 번데기를 볼 수있다. 어떤 번데기를 제거하고에 동결 안락사 - 20 ° C 변형이 발생하기 전에.

6. 체액의 추출

  1. 무작위로 선택한 세애벌레 등 5과 18 시간의 PI 선정 시점에서 14 ML 튜브에 배치,
  2. 애벌레의 다리가 움직이 관찰 될 때까지 5 ~ 10 분 동안 얼음이 튜브를 놓습니다.
  3. 유생의 꼬리 부근의 두 세그먼트 사이의 절개를, 메스를 사용하여 배양 접시와,에 마취 애벌레를 놓습니다.
  4. 체액을 수집하는 멸균 1.5 ML의 원심 분리기 튜브에 유충을 짜내.
    1. 적어도 세 개인 풀의 체액. 한 유충은 크기에 따라 체액의 15 ~ 50 ㎕의 사이에 있습니다.
      주 : 체액 추출하는 동안은 샘플의 오염 가능성의 결과로, 창자를 중단하는 것은 매우 쉽습니다. 박테리아를 도금 그러나, 항생제 선택은 항상 필요합니다 (떨어져 창자에서) 꼬리 근처에 애벌레를 절단하여 오염을 줄일 수 있습니다.
      참고 : 컬렉션 이후로 10 분 안에 갈색과 응고 프로세스에게 체액을 회전에서 체액을 방지하기 위해.
  5. 에서 새로운 14 ML 팔콘 튜브, 인감과 장소에 애벌레 몸을 버리 - 20 ° C 하룻밤 애벌레가 죽었 확인합니다.
  6. 죽은 애벌레를 압력솥 지역 규정에 따라 폐기하십시오.

7. 혈구 생존의 결정

  1. 상술 한 바와 같이 체액의 압축을 풉니 다.
  2. 0.02 %의 20 μl를 96 웰 플레이트 잘 하나에서 PBS에 (V / V) 트리 판 블루로 추출 체액의 20 μl를 섞는다.
  3. RT에서 5 분 알을 품다.
  4. 혈구 상에 실행 가능한 (파란색 없습니다) 세포를 계산 부하 체액의 10 μl를.
  5. 오류를 줄이기 위해 세중의 각 샘플을 계산합니다.

8. 면역 형광 현미경에 대한 추출 된 혈구 세포의 처리

  1. 24 웰 플레이트에 10 ~ 15 밀리미터 유리 커버 슬립 상에 적어도 세 유충과 피펫에서 추출 된 풀링 된 체액을 혼합.
    참고 : 혈구 세포가 유리에 부착 수 Coverslips는 치료를 필요로하지 않습니다.
  2. D-0.5 ㎖를 추가PBS와 아래로 pipetting과 잘 섞는다.
  3. 에어로졸 기밀 원심 판 홀더를 사용하여 실온 (RT)에서 500 XG에서 10 분 동안 플레이트를 원심 분리기.
  4. 혈구 세포가 부착했는지 확인하려면 거꾸로 현미경을 사용하여 각 우물을 검사합니다.
  5. 뜨는을 제거하고주의 깊게 판 2 배를 흔들 피펫 D-PBS를 제거, 우물의 벽에 0.5 ㎖ D-PBS를 추가하여 세포를 세 번 씻는다.
  6. 4 % PBS에서 (V / V) 파라 포름 알데히드 (PFA) 0.5 ㎖를 첨가하여 세포를 고정합니다.
  7. 실온에서 20 ~ 30 분 사이의 세포를 품어.
  8. 이전과 같이, D-PBS로 세포를 세 번 씻으십시오.
  9. 추가 0.5 ML 잔류 PFA를 해소하고 실온에서 15 분 동안 부화 PBS에서 15 mM의 NH 4 망할 CIA.
  10. D-PBS로 세포를 세 번 씻으십시오.
    참고 :이 단계에서, 커버 슬립은 4 ℃에서 하룻밤 동안 저장 될 수있다
  11. PBS에 0.​​5 ㎖의 0.1 % 트리톤 X-100를 추가하고 세포를 투과하는 RT에서 5 분 동안 품어.
  12. 차단 솔루션 (2 % (PBS에 W / V) BSA)과 함께 1 시간 동안 차단합니다.
  13. 제조업체가 지정한 희석에 차단 솔루션에 희석 차 항체와 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
  14. PBS로 3 회 세척한다.
  15. 상기와 같이 박테리아의 시각화를위한 차 항체와 DAPI와 1 시간 동안 배양한다.
  16. PBS로 3 회 세척한다.
  17. 유리 슬라이드에 장착 시약 한 방울을 사용하여 커버 슬립을 장착합니다.
  18. 완전히 장착 솔루션을 건조 RT에서 어둠 속에서 밤새 품어.
  19. 이미지는 형광 현미경에 슬라이드.

9. 세균 CFU의 정량화

  1. 창자 식물에 의한 오염을 방지하기 위해 판을 CYE 100 ㎍ / ㎖의 스펙 티노 마이신을 추가합니다. L. 뉴모 변형 130B (40) 스펙 티노 마이신에 자연적으로 저항한다.
  2. 체액 추출하기 전에, 1.5 ㎖의 원심 분리기 튜브의 무게.
  3. 6 절에 설명 된대로 체액을 추출하고 무게 t에 배치ubes, 5 ㎎ / ㎖ 디기 토닌의 1 μl를 추가 잘 섞어과 혈구 세포를 용해하는 RT에서 5 분 동안 품어.
  4. 체액과 튜브를 닫고 다시 무게를 측정하고 추출 된 체액의 무게를 결정합니다.
  5. 멸균 AYE 미디어에서 체액 10 배 시리얼 희석을 수행합니다.
  6. 펜을 사용하여, 여섯 동일 부문과 라벨에 CYE 판의 기반을 나눕니다.
  7. 각 희석의 25 μL의 플레이트 세 방울 플레이트의 각 섹션에서 (가장 묽은부터 시작).
  8. 37 ℃에서 하룻밤 최상의 뚜껑과 접시를 품어
  9. 방울 완전히 건조되면, 적어도 더 이틀 동안 37 ° C에서 이상 접시를 돌려 품어.
  10. 각 희석에서 콜로니를 계수하여 추출한 박테리아 정량화 추출 체액의 중량에 정상화.

10. 경쟁 지수의 결정 (CI)

  1. 두 균주 배양액과 CYE 한천 플레이트의 프리 오에 동일하게 잘 성장하는지 확인경쟁력있는 인덱스를 시도하는 연구.
  2. 섹션 1과 WT 또는 카나마이신 내성 돌연변이 세균 현탁액을 준비하고 1:1의 비율로 혼합한다.
    1. CYE의 스펙 티노 마이신 상에 접종 (100 ㎍ / ㎖) CYE의 스펙 티노 마이신 / 카나마이신 판 시리얼 희석
  3. 상술 한 바와 같이 적절한 시점에 유충 추출물의 체액을 감염.
  4. 체액을 추출하고 CYE의 스펙 티노 마이신과 CYE의 스펙 티노 마이신 / 카나마이신에 시리얼 희석 도금하여 가능한 수를 결정합니다.
  5. CI = (돌연변이 출력 / WT 출력) / (돌연변이 접종 / WT 접종)을 다음과 같이 경쟁력 지수 (CI)을 계산합니다.

결과

여기가 입증되는 G. mellonella는 L.을 연구하는 사용하기 쉽고, 적절한 모델입니다 뉴모 감염. 이전에는 보여왔다 그 L. 대식 세포, 아메바와 포유 동물 모델에서 뉴모 독성이 점 / ICM 분비 시스템 41-43. G.의 존재에 따라 달라집니다 mellonella 애벌레는 상기 한 바와 같이 감염 야생형 (WT)과 점 / ICM 결핍 균주의 독성을 비교 하였다. L. 10 7 CFU 감염 뉴모 변형 130B는 24 시간 후 감염 (PI) 내에 100 % 사망의 결과. 그러나, L. 기능적인 점 / ICM T4SS 분비 시스템이없는 뉴모 Δ DOTA 변형은 (그림 1)이 분석에서 무독성했다. 이 보여주는 L. G.에서 뉴모 독성 mellonella 특성화의이 모델이 적합하다 점 / ICM 이펙터의 전위에 따라 달라집니다이들 단백질의 기능.

최근에는 사이토 처리에 의한 식균 작용의 억제는 효모 칸디다 알비 칸스 (6)에 의해 감염에 애벌레의 민감하게 증가 것으로 나타났다. L.로 뉴모 박테리아의 이해가이 모델의 발병 기전에 중요한 경우가 확인하기로 결정하고, 세포 내 병원균이다. 애벌레는 37 ° C에서 4 시간 동안 100 μM 사이토 D (시드)의 10 μL로 전처리 한 후, WT L.의 10 7 CFU에 감염 혼자 억제제와 24 시간 파이 치료에 감시 뉴모 130B 및 사망률은 유충의 생존에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 전처리, 감염된 유충은 DMSO 처리, 감염된 곤충 (그림 2)에 비해 유의하게 생존율 (P = 0.0066, 짝 T-테스트)을 표시. 시드 처리의 효과는 48 시간의 PI (결과 미도시)에 의해 폐지되었다; 이는 G.있는 약물의 반감기 수도mellonella. 이 L.의 이해를 보여줍니다 G.에 뉴모 mellonella의 혈구 세포가 세균의 독성의 중요한 측면이다.

발현을 확인하고 G.에서 이펙터 단백질의 세포 내 현지화를 결정하기 위해 mellonella, 혈구 세포를 추출 및 면역 형광 현미경에 대한 처리되었습니다. 애벌레는 WT와 Δ DOTA L. 4 N-말단 HA 태그에 융합 잘 정의 된 T4SS 이펙터, SIDC 41-918, 조각을 표현 뉴모 (130B)에 감염되었다. 이 이펙터는 phosphoinositide-4 - 인산 결합 도메인 (44)를 통해 LCV를 바인딩 증명되었다. 항-HA (적색) 및 안티 레지오넬라 (녹색) 항체, 4HA - SIDC 41-918 감염된 혈구 세포에서 LCV로 지역화 (그림 3)를 사용하여. 이 현지화 이전 아메바 Dictyostelium의의의 discoideum와 C를 확인 포유류 식세포 44, 45에 표시 한이 모델의 omparability.

병원성에 대한 단백질의 중요성은 일반적 야생형 및 돌연변이 박테리아의 성장 동역학을 비교함으로써 결정된다. 감염의 과정을 통해 세균 복제 속도론을 수행하기 위해서는 세 개의 유충은 체액 수집 및 풀링 (0, 5, 18, 및 24 시간 PI)는 각 시점에서 희생시키고, 추출 된 체액의 CFU/0.1g 결정. 5 시간 파이, WT 박테리아의 CFU에서 초기 딥 그러나 24 시간 PI까지 증가 후, Δ DOTA 변형은 복제를 겪게하지 않고 18 시간 파이 (그림 4)에서 삭제됩니다.

L.의 능력 T4SS 의존적으로 대식 세포의 용해의 원인이 뉴모 긴하지만 더 유사한 연구는 생체 내에서 수행되지 않았습니다, 46에 설명되어 있습니다. 순환 혈구 세포의 농도는 5, 18로 결정하고, 24 시간의 PI는 애벌레가 감염된 WT 또는 Δ DOTA L.의 뉴모 130B, 트리 판 블루 배제 방법을 사용하여 계산에 감염된 곤충과 생존 세포에서 추출 된 혈구 세포. 5 시간 파이의 변종 사이의 혈구 계수의 차이는 (그림 5)을 볼 수 없었다. 그러나, 18 시간 파이에 Δ DOTA, 감염된 유충은 없습니다 WT의 혈구 농도에 상당한 하락했지만. 이 차이는 면역에 의해 보이는 것과 같이 세포 내 박테리아의 존재와 함께 혈구 수의 하락, 제안 24 시간 PI에서 유지 된 L. 뉴모는 박테리아가 복제의 여러 라운드를받을 수 있도록, 그들을 lyses 혈구 세포 내에서 복제합니다.

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그림 1. L. 감염 뉴모는 유도 도트 / ICM 의존 유충의 사망률. 10 유충은 PBS 혼자 또는 10에 감염된 DOTA L.의 뉴모 130B의 업> 7 CFU. WT에 감염된 모든 애벌레는 24 시간 후 감염 (PI) 내 감염에 굴복, 그러나 더 사망률은 혼자 PBS 또는 Δ DOTA 균주를 접종 유충에 보이지 않았다. 결과는 세 개의 실험 ± 표준 편차의 평균이다.

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그림 2. 사망률은 세균의 국제화에 따라 달라집니다. 10 L.에게 뉴모 유생 (P = 0.0066, 짝 T-테스트) 감소 크게 보여 다음 10 7 WT와 24 시간 파이 전처리 된 유충에서 모니터 사망과 감염 37 ° C에서 4 시간 동안 100 μM 사이토 D (시드)의 10 μL로 전처리 하였다 사망. 결과는 내 잘못을 나타냅니다조건 당 10 애벌레와 표준 편차 ± 4 개의 독립적 인 실험에서 북쪽으로.

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그림 3. 추출 된 혈구 세포의 이펙터 단백질의 면역 형광 이미징. 혈구 세포는 L.에 감염된 유충에서 추출 5 시간 파이 셀에 4HA - SIDC 41-918을 표현 뉴모 130B WT 또는 Δ DOTA는 핵을 시각화하기 위해 항-HA (적색) 및 안티 레지오넬라 (녹색) 항체 및 DAPI DNA의 얼룩 (파란색)를 사용하여 염색 하였다. 4HA-SIDC 41-918은 주변 WT 관찰 아니지만 Δ DOTA, 박테리아 하였다. 스케일 바 5 μm의.

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그림 4. L. 뉴모는 G. 내에서 복제 멜로넬라는 점 / ICM 의존적으로. 유충은 WT 또는 Δ DOTA L. pneumophila에 함께 0, 5, 18에 감염, 24 시간 파이 풀링 세 감염된 곤충의 체액, CYE 판에 도금 CFU 결정 하였다 접종을 추출 체액의 무게에 정상화. WT L. Δ DOTA 변형이 18 시간 파이 결과에서 삭제하는 동안 실험의 과정을 통해 복제 뉴모 표준 편차 ± 별도의 세 가지 실험의 평균이다.

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그림 5. WT L. 감염 중요한 혈구 파괴 뉴모 결과. 혈구 세포는 5, 18에서 추출하고, 유충에서 24 시간 PI는 WT 또는 Δ DOTA L. 뉴모 및 혈구를 사용하여 계산 가능한 세포에 감염되었다. 에 차이가 없습니다세포의 수는 단 18 시간 파이에서 혈구 세포의 단지 약 15 %가 Δ DOTA 균주에 비해 WT 균주에 감염된 유충에 남아있는 긴장과 5 시간의 파이를 보였다. 결과는 세 개의 실험 ± 표준 편차의 평균이다.

토론

레지오넬라 뉴모 감염 갤러리아 mellonella 애벌레 모델은 발병의 생체 연구를위한 유용한 도구입니다. 여기로는 대식구 감염 양태의 수가 G.에 효과적으로 요약 될 수 있음을 나타낸다 독성 박테리아 복제의 점 / ICM T4BSS의 역할과 점 / ICM 이펙터 SIDC의 지역화를 포함 mellonella 모델. 또한, 우리는 액틴의 중합 반응의 화학 억제제는 크게 macophages 47에서 얻어진 결과를 흉내 낸 박테리아의 내면화가 유충의 사망률을 일으킬 필요가 있다는 증거를 지원하고, 유충의 사망률을 감소 시킨다는 것을 보여줍니다. 이전에는 입증 된 그 L. 사이에 독성의 변화 다른 감염 모델에서 볼 뉴모 균주 G.에서 확인 할 수있다 mellonella 및 사후 기하 급수적 인 성장 단계에서 독성 인자의 유도가 세균의 독성이 필요합니다 (36), 그 G. mellonella는 L.에 적합한 모델입니다 뉴모 감염.

L.의 CFU 결정 애벌레에서 뉴모은 단독 또는 혼합 감염에 크게 모델의 유틸리티가 증가 감염. 이전에는 여러 가지 요인이 감염 29,48-51의 하나 또는 그 이상의 모델에서 박테리아 복제에 미묘한 영향을 미칠 것을 발견되었다. 애벌레는 적응성 면역계를 가지고 있지 않지만, 선천성 면역 반응의 존재는 미묘한 표현형을 증폭하는 역할을 할 수있는 단독 식세포에 비해 강한 선택을 제공한다. 따라서 이러한 변종이 아마 상당히 유충의 사망률에 영향을 미치지 않습니다 동안, 그들은 G. 세균 복제의 적합성을 감소 입증 할 수 있습니다, 가능성이있다 mellonella 모델. 뿐만 아니라 L.의 복제 애벌레에서 뉴모 필라, 우리는 늦게 감염에 중요한 혈구의 고갈을 보여 주었다. L.로뉴모 또한 세균성 복제의 간접적 인 측정으로서 기능 할 수있다 혈구 고갈을 측정, 그 복제주기의 끝에서 숙주 세포를 용해 할 것으로 예상된다. 최근 결과이 사진은 처음 37을 믿었보다 더 복잡한 것을 제안하지만, 혈구 고갈 이전에 감염 3,52 곤충 사망률과 상관 관계가있다. 최근에는 애벌레의 기아는 면역 반응 (53)의 억제를 통해 감염에 대한 감수성을 증가에 이르게 것으로 나타났습니다. 여기에 설명 된 분석에서, 유충은 연구 기간 동안 공급되지 않았다 그것은 공급 애벌레 L.에 어떻게 반응 할 것인지를 잘 알 수 없습니다 뉴모 감염.

G. 하나의 장점 모델 생물로 mellonella 감염 유충에서 혈구 세포의 추출 및 정량의 용이성이다. 이전 동영상 그러나 만난 곤충 (54, 55)에서 추출하는 혈구 세포에 대한 다양한 방법을 보여 주었다HOD 여기에 제시된 즉각적인 처리를위한 간단하고 적당하다. 일단 추출, 혈구 세포는 쉽게 정량화 면역 형광, 투과 전자 현미경 (36)에 사용하거나 (56) 또는 배양 세포 계측법 흐름 및 감염 세포의 반응은 구체적으로 조사 될 수 있도록 생체 3에 감염 될 수있다. 이것은 상당히 모델의 유연성을 증가시킨다. G.에서 면역에 한 가지주의 할 점 mellonella는 G.에 대해 유효성을 검사 항체의 공급이 제한됩니다 mellonella 단백질. 그러나, 연구는 애벌레 단백질 57, 인간의 면역 관련 단백질에 대한 항체에 대한 항체의 생성을 증명하고있다는 G.를 인식하는 것으로 확인되었다 11 G. 면역 형광에 대한 가능성을 입증 mellonella 단백질 mellonella의 혈구 세포.

G.의 용이성 mellonella 감염은 할 수 빠르고, 중간 처리량 화면을 허용다양한 레지오넬라 종 및 균주의 병원성을 비교하는 데 사용될 더욱 그러한 부착 분자 (58) 또는 다른 모델에서 병독성에 필요한 유형이 분비 시스템 (59)과 같은 이전에 확인 된 독성 요인을 분석하는데 사용될 수있다. 또,이 모델의 사용은 분비 옭 효과기 단백질을 포함한 신규 한 독성 인자의 동정 및 특성화를 더욱 허용 할 것이다. 최근에는 L.의 포스 포 리파제 C 활동을 보여왔다 뉴모는 G.의 역할을 mellonella 독성 60, 즉 점 / ICM 이펙터 단백질 SdhA은 독성 (37)가 필요합니다. 또, 최근 G. 관찰 표현형 사이의 상관 관계가 있다는 것을 보여 주었다 mellonella 및 A / J 마우스 변형 37.

이 환경 원생 동물 및 단세포 호스트와 무리를 보완하기 위해이 도구의 가치를 강조NE 감염 모델. G. 애벌레 게놈 시퀀스는 사용할 수 많은 유전 적 도구가 설립되면 mellonella 모델은 미래에 더 많은 가치가 될 것입니다. 이 방향의 단계는 면역 관련 전 사체 (61)과 나비목 종 (62)에 유전자 침묵을 사전에 계획의 형성을 상세히 최근 게시 있습니다.

G.를 사용함으로써 mellonella 유충 제외한 L.의 발병 기전을 조사하기 위해 사용될 수있다 병원성 세균의 간단한 신속한 판독의 개수를 가지고 뉴모. 이러한 분석과 L.의 넓은 검사 설립 뉴모 긴장과 혈청군이 새로운 도구의 유틸리티를 증가하고 L.에 대한 우리의 이해에 기여할 것 뉴모 병인.

공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

CR 하딩은 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust) 학생이기의 WT086724에 의해 지원되었다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
<강한>재료/ 장비
ACES 효모 추출물 (AYE) 육수4 g ACES, 4 g 효모 추출물, 0.4 g α-케토글루타레이트, pH 6.9, 400 ml H2O, 오토클레이브, 4 ml 철 용액*, 4 ml 시스테인 용액*
*고압멸균 후 멸균 성분 추가
숯 완충 효모 추출물 (CYE) 플레이트위와 같이 0.6g 활성탄과 6g 한천
멸균 철 용액(피로인산철)SigmaP65260.6mM 용액을 첨가하여 멸균 여과
된 멸균 시스테인 용액SigmaC78803.3mM 용액, 멸균 여과
G. mellonella (waxworms)Livefood UKW250
Anti-HA-Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate( TRITC)SigmaH9037
항레지오넬라균 LPSCambridge BiosciencesPA1-7227
Anti-Rabbit IgG Alexa488Jackson Immunoreach711-485-152
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)SigmaI6758
Dulbeccos phosphate buffered saline (D-PBS)SigmaD8662
파라포름알데히드한천Scientific R1026
염화암모늄(NH4Cl)시그마A9434
트리판 블루 솔루션시그마T8154
디지토닌시그마D141
사이토칼라신 DBiomol InternationalBML-T109-0001
[헤더]
Material
Microtiter SyringeSigma24544
세포 계수기, 이중, 개선된 Neubauer VWR631-0926
원심분리기원심분리판용
형광 현미경형광단
도립 현미경생존 가능한 세포 계수를 위해
펑크 방지 장갑터틀스킨
필요한 에 적합한 필터가 있는 모든 현미경

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