강력한, 미세 유체 세포 내 전달 플랫폼으로 휴대 뒤쪽에서

Summary

세포의 빠른 기계적인 변형은 고분자 나노 물질의 세포 내 전달을위한 약속, 벡터없는 방법으로 떠오르고있다. 이 프로토콜은 다양한 애플리케이션을 위해 시스템을 사용하는 방법에 대한 자세한 정보를 제공.

Abstract

세포의 빠른 기계적인 변형은 고분자 나노 물질의 세포 내 전달을위한 약속, 벡터없는 방법으로 떠오르고있다. 이 기술은 이전에 도전 응용 프로그램을 해결 잠재적 보여 주었다,, 등의 기본 면역 세포, 세포 리 프로그래밍, 탄소 나노 튜브, 양자 도트 배달에 납품 할 수있다. 이 벡터없는 미세 유체 플랫폼은 타겟 재료의 세포질 전달을 용이하게 세포막의 기계적 파괴에 의존한다. 여기서, 우리는 장치의 조립, 세포 준비 및 시스템 운영을 포함하여 이러한 마이크로 유체 장치의 사용의 상세한 방법을 설명합니다. 이 전달 방식은 디바이스 타입 및 이전에보고되지 않은 애플리케이션을위한 작동 조건의 간단한 최적화를 필요로한다. 이 시스템은 전문 버퍼 또는 화학적 변형 / 활용의 단계를 필요로하지 않기 때문에 제공된 지침은 대부분의 세포 유형과 전달 물질에 일반화되어 있습니다. 이 작품은 또한 제공의 장치 성능을 개선하고 막힘, 낮은 전달 효율 및 세포 생존과 관련된 잠재적 인 문제를 문제 촬영하는 방법에 대한 평가.

Introduction

세포의 세포질에 고분자의 배달 치료 및 연구 응용 프로그램에서 중요한 단계입니다. 단백질 전달 임상 ³ 및 실험실 모두 ⁴ 설정에서 세포 기능에 영향을 미치는 유망한 수단 동안 나노 입자 매개 배달, 예를 들어, 유전자 치료 ^1,2 잠재적 보이고있다. 이러한 작은 분자 약물, 양자 도트 또는 금 나노 입자와 같은 다른 재료는, ^5,6 암 치료제 ^{9 추적} 세포 내 라벨 ^7,8, 단일 분자에 이르기까지 다양한 응용 프로그램에 관심이 있습니다.

세포막은 거대 분자에 크게 불 투과성이다. 많은 기존의 기술은 막 중단 또는 세포 내로 전달을 용이하게하는 고분자 나노 입자 ^{10, 11,} 리포좀 ^(12), 또는 화학 물질 수정 ^(13)를 사용합니다. 이러한 방법에서, 전달 효율 및 세포 생존율 번째의 구조에 종종 의존전자 표적 분자 및 세포 유형. 이러한 방법은 핵산과 같은 구조적으로 균일 한 물질의 전달에 효율적이 될 수 있지만, 종종 단백질 ^{(14, 15)} 및 나노 물질 ^7과 같은 더 구조적으로 다양한 물질의 전달을 위해 아픈 적합합니....

Protocol

1. 저장

1. 70 % 에탄올에 저수지, 홀더, O-링과 미세 유체 장치를 저장합니다. 먼지 나 외부 입자에 의해 증발 및 오염을 방지하기 위해 뚜껑이있는 용기 (예를 들어, JAR 또는 비커)를 사용합니다. 셋째로 한 용기 (1), 저수지와 O-링 제 2 용기 (2)의 한 홀더에 장치를 위 (3).

주 : 스토리지 70 % 에탄올의 사용은 불임을 유지하는 것이다. 용액의 성분 만이 에탄올 및 물 (즉 명 변성 에이전트)되는 경우에, 모든 시스템 구성 요소가 완전하게 호환되어야하고 시간이 지남에 따라 열화하지 않을 것이다.

2. 용기 (2)의 에탄올 용액을 변경하고 (3) 실험을 통해 교차 오염을 방지하고 막힘의 원인이 원하지 않는 입자의 존재를 최소화하기 위해 각 사용하기 전에.

2. 실험 준비

1. 이쪽 용기 (2) 및 (3) 초음파 배스 FO각 사용하기 전에 R 5​​ ~ 10 분. 이것은 이전의 실험에서 어떤 오염 입자를 제거하는 데 도움이됩니다.
2. 70 % 에탄올 용액으로 바이오 안전성 캐비닛 청소 작업 공간.
3. 생물 안전 캐비닛....

Results

그림 1은 마이크로 유체 전달 시스템의 개략적 인 설명이 포함되어 있습니다. 2A-B 피규어 찬란 복합 3 kDa의 덱스 트란 ^(20)의 존재에서 다른 장치의 디자인으로 HeLa 세포 치료의 일반적인 결과를 보여줍니다. 절차가 올바르게 수행 될 경우, 시스템 성능은 디바이스의 종류와 작동 속도에 민감 할 것입니다. 따라서, 하나는 좀 더 복잡한 실험을 진행하기 전에 주어진 애플리케이션에 대한 이러한 조건을 최적화한다. 도면에 도시 된 작동 조건의 범위에서, 세포 생존하지만, 하나는 30 % 생존 정도 아래에 이어질 수 있다고 차선 대금 파라미터 (예를 들어 내용에 대해 칩 분류)을주지해야하며, 80 % 이상 남아있다. 따라서 생존 능력 및 전달 효율은 이전에보고되지 않은 세포 유형 동시에 최적화해야합니다. 장치 설계 대상 세포 유형에 부적절한 경우, 하나없이 배달에서 높은 C까지의 결과를 볼 것이다엘 죽음 (예를 들어,

Discussion

설명 된 실험 절차 (칩 설계 및 동작 속도 이외 즉 인자)의 특정 양상은 시스템에 적용되는 세포 유형 및 전달 재료에 따라 최적화 될 필요가있다. 주소에게 실험을 설계 할 때 고려해야 할 가장 일반적인 요소 중 일부를 다음과 토론.

형광 표지 화합물의 배달 신호를 개선하기 위해, 하나는 배경 형광의 원인을 해결하기 위해 필요합니다. 표면 바인딩 및 엔도 시토 시스, 예를 들면, 문화 또는 추가 처리를하기 전에 여분의 물질을 제거하는 출산 후 세포에게 5 ~ 10 분 세척에 의해 해결 될 수있다. 세척 단계를 포기하도록 선출하면, 주위 용액 중에 표적 물질의 농도를 낮추기 위하여 원하는 매체의 5 배에 의해 처리 된 세포를 희석하고 따라서 세포 내로 요금을 줄이기 위해 유용한 것이다. 어떤 경우에는, 예를 들어 단백질 전달을 위해, 하나는 필요한 능동적 셀 하던가을 차단하는 찾을 수도세륨 (예, 표지되지 않은 소 혈청 알부민을 사용) 전달 물질.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
장치 홀더 & 플라스틱 저장소	SQZ Biotechnologies	Holder
LSRFortessa 분석기	Becton Dickinson	N / A	Koch Institute에서 사용되는 유세포 분석 기계 핵심 시설
미세유체 장치	SQZ Biotechnologies	세포 압착
O-링	McMaster	9452K311
장치 작동을 위한 압력 시스템	SQZ Biotechnologies	압력 시스템
핀셋
초음파 수조