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방법 논문

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

13.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/50985

⸱

2014년 2월 18일

 ,  ,  , 
1Fondazione Filarete, 2Department of Biotechnology and Translational Medicine, University of Milan, 3Neuroscience Institute, National Research Council (CNR), 4Department of Health Science, "Magna Graecia" University of Catanzaro

이 논문에서

요약

우리는 우리가 살아있는 세포의 공 촛점 이미징에 의해 소포체 (ER)에 거주 형질 전환 형광 단백질의 분포와 이동을 조사하는 데 사용하는 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 또한 ultrastructurally이 세포 내 구획의 구조에 대한 자신의 표현의 효과를 분석 할 수 있습니다.

초록

이러한 강렬한 interorganelle 분자 트래픽에도 불구하고 자신의 독특한 구성과 기능을 유지하지만 진핵 세포의 지질과 단백질은 지속적으로, 세포 구획 사이에 교환됩니다. 이 문서에 설명 된 기술은 생체 내에서 자신의 생리적 환경에서 단백질과 지질의 이동성과 인신 매매를 공부하는 강력한 수단입니다. (FLIP)을 photobleaching에에 (FRAP) 및 형광 손실을 photobleaching에 후 형광 복구 널리 엑소-세포 내 이입 통로, 세포 기관 또는 subcompartments 사이의 연속성, 단백질 복합체의 형성, 단백질 지역화보기를 통해 세포 내 인신 매매를 공부 라이브 세포 이미징 기술을 사용하는 지질 마이크로 도메인에서 모두의 생리적 및 병리 적 조건에서 관찰 될 수있다. 이러한 방법의 한계로 인해 형광 융합 단백질의 용도에 주로, 그들의 잠재적 인 단점 과발현 인공적 포함세포에서 이온과 태그 및 기본 단백질의 접힘 및 현지화의 차이의 가능성. 마지막으로, 광학 현미경 (약 200nm)의 해상도의 한계로 스트레스 세포에서 유래 할 수있는 ER 또는 특정 subcompartments의 미세 구조의 조사를 허용하지 않는 (즉, 저산소증, 약물 투여, 횡단의 과발현 ER 상주 단백질) 또는 병적 인 조건에서, 우리는 미세 배양 형질 세포의 라이브 세포 이미징을 결합하여 투과 전자 현미경을 기준으로 분석한다.

서론

녹색 형광 단백질 (GFP) 및 스펙트럼 변형, 형광 현미경의 평행 개발의 발견은 세포에있는 단백질 행동의 조사를 위해 완전히 새로운 길을 열었습니다. 때문에 강렬한 조명 아래에서 자신의 형광을 소화하는 형광 물질의 고유 용량이 가능하다 (FLIP)을 photobleaching에에 (FRAP) 및 형광 손실을 photobleaching에 후 같은 형광 복구와 같은 기술은, 공 초점 라이브 세포 이미징을 기반으로하고의 사용은 형질 형광 융합 단백질 1-3. 그들은 널리 자신의 기능 4와 관련된 중요한 단서를 공개 할 수있는 단백질의 현지화뿐만 아니라, 자신의 이동성과 기공을 갖는 전송뿐만 아니라,을 평가하는 데 사용됩니다.

진핵 세포의 고유 기능은 특정 지질과 단백질 성분이 세포 내 구획의 존재입니다. 세포 소기관은 물리적으로 isolat와 있지만ED는 그들이 서로 통신 및 셀룰러 항상성을 유지하기 위해 분자 구성 요소를 공유 할 필요가있다. 분비 경로는 ER에서 합성 단백질과 지질이 그들의 기능을 발휘하는 정확한 최종 목적지에 도달 할 수 있음을 보장합니다. 세포 내 소기관 또한 분자 (지질)에 직접 구획 사이에서 교환 될 수 있도록 동적 접촉 위치에 의해 접속 될 수있다. 또한, 많은 단백질에 큰 이종 체 단지에서 조립 또는 기능적으로 활성화 될 수 또는 최종 목적지로 이송하기 위해 특정 지질 종 (지질 뗏목 / 마이크로 도메인)와 관련있다. 이러한 생물학적 측면 모두는 크게 단백질의 역학적 특성에 영향을 미치는, 따라서 적절하게 아래에 설명 된 기술에 의해 조사 할 수있다.

우리 그룹은 ER의 아키텍처와 다른 서브를 연구하기 위해 널리 FRAP를 사용하고 전자 현미경과 결합 플립도메인. ER은 분비 경로의 제 1 국이고, 단백질과 지질 5 선별에 중요한 역할을한다. 그것은 누구의 고유 한 하위 도메인의 여러 가지 기능 (예 : 단백질과 지질의 생합성 및 인신 매매, 단백질 폴딩, 칼슘 2 + 저장 및 해제, 및 생체 이물 대사)를 반영하는 매우 역동적 인 세포 기관이다. 그들이 공간적, 형태 학적, 그리고 기능적으로 구별 그러나, 비록 이러한 도메인은 서로 연속하고, 그들의 상대적인 풍부함 생리 및 병리 적 조건하에 세포에서 변형 될 수있다. 가장 잘 알려진 및 ER의 보통 공간적으로 분리 된 도메인들은 핵막 및 매끄럽고 거친 ER이며 그러나 다른 사람은 ER 구조는 다양한 종류의 세포에서보다 정교한 구조 및 3 차원 조직이 있다는 것을 증명하고있다 또한 저산소증, 약물과 같은 스트레스 자극에 의​​해 유도 될 수있는 생리 학적 조건 하에서 조직관리, 또는 ER 상주 횡단 단백질 2,6의 과발현 (및 참조 안에).

우리는 또한 최근에 인간의 질병 1,7의 세포 모델에서 이러한 구조의 존재를 증명하고있다. 부드러운 ER의 누적 cisternae에서 발생 그들은 또한 그들의 아키텍처에 기초 karmellae, 얇은 판자, 및 결정상 ER로 알려져 있지만, 그들은 2003 년 6 조직 부드러운 소포체 (OSER)의 집단 이름이 부여 된, 같은 자신 크기는 다를 수 있습니다. 세포는 꼬리 고정 (TA) ER 상주 단백질 (D의 EGFP-ER), 트랜스에서 GFP의 약한 이합체 경향이 극적으로 ER의 조직과 구조를 변경의 세포질 영역에 융합 GFP 형질 전환 된 후. FRAP 및 플립 실험은 D EGFP-ER은 OSERs 내에서 확산 자유롭게 것으로 나타났다하고 OSER에 망상 ER에서 이동하고 그 반대의 경우도 마찬가지 <사실/ 엠> 집계 주변의 망상 ER 연속 있음을 나타냅니다. 미세 분석은 우리가 나노 수준에서 OSER 아키텍처와 조직에 대한 자세한 설명과 함께 형광 데이터의 상관 관계를 할 수있다 : OSERs은 항상 부드러운 ER의 쌍 cisternae의 스택으로 구성되어 있지만, 이러한 정기적 사인 배치로 공간 조직의 다양한 형태를 가질 수 배열이나 윤 생체, 또는 육각형의 "결정체"관의 배열. 이러한 재 배열들은 생리적 조건 9 저산소증 10, 약물 치료 11 암 9로 다음과 같은 스트레스에 따라 세포에서 발견 된 것처럼, 미세 마커 상당한 잠재력을 가지고있다, 입방 형태학 8로 이어집니다.

GFP 융합 단백질을 사용하여이 제 데모 후에, 우리는 약물 치료 12 ASSE에 응답하여 ER 도메인의 증식을 분석하기 위해 이미징 실험을 사용SS 세포 13 oligomerise하고, 그 병원성 1,8 관련된 수도 ER 계 세포 응집체의 형성에 돌연변이, ALS TA-결합 단백질의 역할을 조사하기 위해 형광 단백질의 경향. 그것은 (많은 신경 변성 질환 (14)에서 발생하는) 세포 응집체의 형성이 독성 돌연변이 단백질 및 주변 셀 요소 (15) 사이의 상호 작용을 방지하기위한 보호 메커니즘이 될 수 있다는 것을 제안하고있다.

다음은 그의 C-말단 소수성 도메인은 ER의 세포막 내로 삽입되고, 자신의 동적 거동의 분석 및 ER 도메인에서 자신의 과발현의 효과 구조를 조사하는 광학 및 전자 현미경 방법의 조합에 대하여 설명한다 배양 된 세포의 구조 (실험 프로토콜의 흐름도는 그림 1 참조).

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프로토콜

1. ER 형광 단백질 플라스미드, 세포 배양 및 형질

  1. 본 연구에서 사용 된 플라스미드는 쥐 시토크롬 B의 ER 이소 형의 꼬리 영역과의 C-말단에 융합 된 GFP의 향상된 버전으로 구성 (5) 링커 서열을 통해 (B 등 (5) 여기 기함). 꼬리 영역 (5), 업스트림 및 다운 스트림 극성 시퀀스에 의해 측면에 17 잔류 TMD (횡단 도메인), (UPS 및 DPS) 등의 기본 B의 트립신 절단 후 관련 막 남아있는 전체 시퀀스 (Pro94-Asp134)를 포함 . 링커 [(의 Gly) 4 빼앗아] 3이어서 MYC 에피토프로 구성하고, 전체 cDNA를 포유 동물 발현 벡터의 Hind3 된 pcDNA3-Xba1 사이트에 삽입된다. 이 플라스미드의 구성 정보가 GFP ER-16로 언급되는 이전의 간행물에 기재되어있다.
  2. 10 % 죽은 태아의 보충 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM)의 COS-7 세포를 성장L 소 혈청, 2 밀리미터 L-글루타민, 37 ° C에서 인큐베이터에서 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 10 % CO 2.
  3. 형질. 제조자에 의해 설명 된대로 판 3 × 10 5 6 - 웰 플레이트에 둥근 유리 커버 슬립에 세포와 다음 날에, JetPEI 시스템으로 형질. 최적 JetPEI / DNA 비율은 사용 된 플라스미드 및 세포주에 따라 최대 형질 감염 효율을 확립하기 위해 시험되었다 유의 : 우리의 경우, JetPEI는 2:1의 DNA 비율 70-80 % 년 형질 감염 효율에 이르게한다.

2. 라이브 형광 스캐닝 공 초점 현미경

  1. 라이브 세포 이미징. 형질 세포가 W / 10 % FBS, 2 밀리미터 L-글루타민, 1 % 펜 / 연쇄상 구균, 25 mM의 HEPES와 보충 페놀 레드, O를 DMEM 가득 24mm 커버 슬립의 강 문화 전지 실에 파종 된에 커버 슬립을 넣어 , photobleaching에에서 샘플을 방지하기 위해 50 ㎍ / ㎖의 사이클로 헥시 미드 1:100 OxyFluor. SP5 공 초점 microscopD의 GFP-ER은 488 nm의 레이저와 50분의 525 대역 통과 방출 필터를 사용하여 시각화되고으로 온도가 조절 CO 2 배양기 (37 ° C, 5 % CO 2)를 탑재 전자는 라이브 셀 이미징 실험에 사용됩니다.
  2. FRAP (을) photobleaching에 후 형광 복구. OSER 구조에 대응하는, 또한 (ROI)의 영역을 그리고 그것을 (샘플에서 5.5-6 μW에 대응하는, 30 mW의 아르곤 레이저의 100 %) 20 반복 및 488 nm의 조합을 사용하여, 405 nm의 표백 우리의 경험에서, 효율적이고 신속한 광표백에 이르게, (샘플에서 11.6 μW에 해당하는 30 mW의 다이오드 레이저 (405)의 60 %,) 레이저.
  3. 10 분 (픽셀 시간 = 1.61 마이크로 초 / PX)에 대해 하나의 프레임마다 10 초를 복용하여 표백의 ROI에 형광의 회복을 기록합니다.
  4. (FLIP)을 photobleaching에 형광 손실. OSER 구조에 따른 투자 수익 (ROI), 전술 한 바와 같이 표백제를 그립니다. 표백은 매 30 초를 반복,사후 표백 이미지는 30 분 (픽셀 시간 = 1.61 마이크로 초 / PX)마다 10 초를 기록한다.
  5. FRAP 및 플립 분석. 모든 이미지는 ImageJ에 소프트웨어 (사용하여 분석 http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html을 ). FRAP 실험에서, 표백 투자 수익 (ROI)의 형광 복구는 시간과 항상 시간에 일정하게 체크 표백 셀의 총 형광, 정규화를 통해 측정된다.
  6. FLIP 실험의 경우, 표백 OSER 및 전체 세포를 덮고 외부의 투자 수익 (ROI)을 그립니다. 시간이 지남에 따라 그 형광 강도를 측정하고 영상 자체에 기인 한 형광의 어떤 저하를 보정하기 위해 표백 셀에 그려진 ROI의 형광 수준으로 정상화.
  7. 모든 실험에서의 ROI의 형광 강도로부터 (세포 외부의 영역에서 결정) 배경 신호를 감산. 마지막으로, 할머니를 사용하여 결과를 플롯aphPad 프리즘 소프트웨어.

3. 투과 전자 현미경에 의한 미세 구조 분석

시약의 많은 독성을 감안할 때, 모든 절차는 적절한 실험실 입고 수행되어야한다. 흄 후드 코트와 장갑.

  1. 페트리 접시에서 커버 슬립을 제거한 후, 실온에서 10 분 동안 0.1 M cacodylate 완충액, pH 7.4의 여과 2 % 글루 타르 알데히드를 사용하는 단일 층으로서 접시의 바닥에 성장 남은 세포를 고정한다.
  2. 테플론 스크레이퍼를 사용하여 세포를 긁고 1.5 ㎖의 에펜 도르프 튜브에 전송할 수 있습니다. 10 분간 9,000 g에서 원심 분리에 의해 세포 펠렛. , 뜨는을 제거 신선한 정착액을 추가하고, 4 ℃에서 하룻밤 남겨
  3. 버퍼와 펠렛을 씻으, 실온에서 1 시간 동안 cacodylate 버퍼에 1 % 오스뮴의 용액으로 후 고정합니다.
  4. 를 MilliQ의 물로 씻어하고있는 블록 얼룩 엔20 ~ 60 사이의 분 동안 증류수에 1 % 우라 닐 아세테이트.
  5. 에탄올 시리즈 (70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 10 분마다 100 %) 증가에 샘플을 탈수하고, (각 15 분) 프로필렌 옥사이드에 짧게 두번 세척 하였다.
  6. (2 시간 내지 하룻밤) 프로필렌 옥 시드 +의 Epon (1:1)의 혼합물에 샘플을 침투.
  7. 최소 24 시간 동안 60 ° C에서 경화의 EPON 에폭시 수지에 포함.
  8. 제 60 ~ 70 ㎚의 두께를 갖는 섹션을 구하는 45 ° 다이아몬드 나이프 탑재 인해 Ultramicrotome LEICA UC6를 사용하여 수동으로 트리밍 수지 진영. 300 메쉬 구리 그리드에 대한 부분을 수집합니다.
  9. 우라 닐 아세테이트 (20 분)의 포화 용액으로 그리드 섹션을 얼룩과 구연산 (7 분)를 이끌어, 철저하게 이중 증류수 여과 물을 침지하여 그리드를 세척하고 실온에서 건조 할 수 있습니다.
  10. 더러워 그리드는 TECNAI G2 투과형 전자 현미경을 사용하여 관찰되고, 이미지는 BOTT를 사용하여 캡처되는(일반적으로 6,000-39,000 X에 이르기까지) 다른 최종 배율에서 OM-마운트 CCD 카메라.

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결과

그림 2는 단백질 이동의 예 FRAP 연구 결과를 보여줍니다. D EGFP-ER 단백질의 이동성은 표백 OSERs에 photobleaching에 후 빠른 형광 복구에 의해 증명된다. 정량 분석​​을 위해, 하프 타임 및 모바일 분획은 다음 방정식 단지 수 피팅에 의해 실험적으로 측정 된 데이터로부터 유도 하였다 :

F (t) = F 포스트 + (F의 REC-F의 게시물) (1-e-t / τ)

F 포스트 photobleaching에 후 형광 신호이고, F의 REC 등록시 t, 표백 후의 도달 시간 상수 τ되는 형광 극대 복구 값이다.

형광 복구를 변경하고, 결과적으로, ...

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토론

이 문서에 설명 된 프로토콜 및 이미징 방법은 살아있는 세포의 ER에 거주 형질 TA 형광 단백질의 분포와 이동을 조사하는 데 사용되었다. 우리는 또한 미세 구조 분석에 의해이 세포 내 구획의 구조에서 이러한 단백질의 과발현의 효과를 분석 하였다.

살아있는 세포 공 촛점 이미징 및 전자 현미경의 조합이 단백질의 동적 특성을 조사의 매우 강력한 수단이다 나타내고, 단백질 기능에 관한 중요한 정보를 제공 할 수있다. 한 방법은 시간 (일반적으로 일 사흘)을 소비하지 않고, 이미지 수집 및 분석을위한 많은 사용자 친화적 인 소프트웨어 응용 프로그램의 개발이 photobleaching에 기반, 라이브 세포 이미징 비교적 간단합니다.

이러한 기술의 주요 제한은 형광 융합 단백질의 사용이다 때문에형광 태그는 그 단백질의 적절한 폴딩 및 / 또는 어셈블리에 영향을 미칠 수있다. 또, 과다 발현은 형질 감염, 형광 태그로 단백질의 동작을 ...

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공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

저자는이 문서의 게시에있는 그것의 도움과 지원을위한 폰다 치오 Filarete에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 TECNAI G2 투과 전자 현미경의 사용 센트로 피오 디 Nanomedicina에게 감사의 말씀을 전합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
둘베코' s Modified Eagle Medium (DMEM)Invitrogen41966029
Dulbecco' s Modified Eagle Medium(DMEM) w/o 페놀 레드Invitrogen31053028
Fetal Bovine Serum (FBS)Invitrogen10270106
Pen/StrepInvitrogen15140-122
L-Glutamine 200 mM 용액Invitrogen25030-024
jetPEIPolyplus TransfectionPP10110
OxyFluorOxyrase 주식회사OF-0005
글루타르알데히드 등급 I시그마 알드리치G5882
카코딜산나트륨 트리하이드레이트시그마 알드리치C0250
오스뮴 테트록사이드 4% 용액전자 현미경 과학19150
우라닐 아세테이트 이수화물시그마 알드리치73943경미한
방사성 프로필렌 옥사이드시그마-알드리치82320
EPON 임베딩 미디엄 키트Sigma-Aldrich45359-1EA-F
Lead Citrate Electron Microscopy Science17800
벤치탑 원심분리기Eppendorf5415 D
Spectral Confocal Microscope Leica MicrosystemsTCS SP5
CO2 현미경 케이지 인큐베이션 시스템 OkoLab
초박극자 Leica MicrosystemsUC6
다이아몬드 나이프 DiatomeUltra 45 °
투과 전자 현미경 FEITecnai G2
GraphPad 프리즘 소프트웨어GraphPad Software, Inc
24mm 커버슬립용 강철 배양 세포 챔버생명과학 도구CSC-25
전자 현미경 그리드전자 현미경 과학G300Cu

참고문헌

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