우리는 우리가 살아있는 세포의 공 촛점 이미징에 의해 소포체 (ER)에 거주 형질 전환 형광 단백질의 분포와 이동을 조사하는 데 사용하는 이미징 방법을 설명합니다. 우리는 또한 ultrastructurally이 세포 내 구획의 구조에 대한 자신의 표현의 효과를 분석 할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
이러한 강렬한 interorganelle 분자 트래픽에도 불구하고 자신의 독특한 구성과 기능을 유지하지만 진핵 세포의 지질과 단백질은 지속적으로, 세포 구획 사이에 교환됩니다. 이 문서에 설명 된 기술은 생체 내에서 자신의 생리적 환경에서 단백질과 지질의 이동성과 인신 매매를 공부하는 강력한 수단입니다. (FLIP)을 photobleaching에에 (FRAP) 및 형광 손실을 photobleaching에 후 형광 복구 널리 엑소-세포 내 이입 통로, 세포 기관 또는 subcompartments 사이의 연속성, 단백질 복합체의 형성, 단백질 지역화보기를 통해 세포 내 인신 매매를 공부 라이브 세포 이미징 기술을 사용하는 지질 마이크로 도메인에서 모두의 생리적 및 병리 적 조건에서 관찰 될 수있다. 이러한 방법의 한계로 인해 형광 융합 단백질의 용도에 주로, 그들의 잠재적 인 단점 과발현 인공적 포함세포에서 이온과 태그 및 기본 단백질의 접힘 및 현지화의 차이의 가능성. 마지막으로, 광학 현미경 (약 200nm)의 해상도의 한계로 스트레스 세포에서 유래 할 수있는 ER 또는 특정 subcompartments의 미세 구조의 조사를 허용하지 않는 (즉, 저산소증, 약물 투여, 횡단의 과발현 ER 상주 단백질) 또는 병적 인 조건에서, 우리는 미세 배양 형질 세포의 라이브 세포 이미징을 결합하여 투과 전자 현미경을 기준으로 분석한다.
서론
녹색 형광 단백질 (GFP) 및 스펙트럼 변형, 형광 현미경의 평행 개발의 발견은 세포에있는 단백질 행동의 조사를 위해 완전히 새로운 길을 열었습니다. 때문에 강렬한 조명 아래에서 자신의 형광을 소화하는 형광 물질의 고유 용량이 가능하다 (FLIP)을 photobleaching에에 (FRAP) 및 형광 손실을 photobleaching에 후 같은 형광 복구와 같은 기술은, 공 초점 라이브 세포 이미징을 기반으로하고의 사용은 형질 형광 융합 단백질 1-3. 그들은 널리 자신의 기능 4와 관련된 중요한 단서를 공개 할 수있는 단백질의 현지화뿐만 아니라, 자신의 이동성과 기공을 갖는 전송뿐만 아니라,을 평가하는 데 사용됩니다.
진핵 세포의 고유 기능은 특정 지질과 단백질 성분이 세포 내 구획의 존재입니다. 세포 소기관은 물리적으로 isolat와 있지만ED는 그들이 서로 통신 및 셀룰러 항상성을 유지하기 위해 분자 구성 요소를 공유 할 필요가있다. 분비 경로는 ER에서 합성 단백질과 지질이 그들의 기능을 발휘하는 정확한 최종 목적지에 도달 할 수 있음을 보장합니다. 세포 내 소기관 또한 분자 (지질)에 직접 구획 사이에서 교환 될 수 있도록 동적 접촉 위치에 의해 접속 될 수있다. 또한, 많은 단백질에 큰 ....
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프로토콜
1. ER 형광 단백질 플라스미드, 세포 배양 및 형질
- 본 연구에서 사용 된 플라스미드는 쥐 시토크롬 B의 ER 이소 형의 꼬리 영역과의 C-말단에 융합 된 GFP의 향상된 버전으로 구성 (5) 링커 서열을 통해 (B 등 (5) 여기 기함). 꼬리 영역 (5), 업스트림 및 다운 스트림 극성 시퀀스에 의해 측면에 17 잔류 TMD (횡단 도메인), (UPS 및 DPS) 등의 기본 B의 트립신 절단 후 관련 막 남아있는 전체 시퀀스 (Pro94-Asp134)를 포함 . 링커 [(의 Gly) 4 빼앗아] 3이어서 MYC 에피토프로 구성하고, 전체 cDNA를 포유 동물 발현 벡터의 Hind3 된 pcDNA3-Xba1 사이트에 삽입된다. 이 플라스미드의 구성 정보가 GFP ER-16로 언급되는 이전의 간행물에 기재되어있다.
- 10 % 죽은 태아의 보충 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM)의 COS-7 세포를 성장L 소 혈청, 2 밀리미터 L-글루타민, 37 ° C에서 인큐베이터에서 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 및 10 % CO 2.
- 형질. 제조자에 의해 설명 된대로 판 3 × 10 5 6 - 웰 플레이트에 둥근 유리 커버 슬립에 세포와 다....
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결과
그림 2는 단백질 이동의 예 FRAP 연구 결과를 보여줍니다. D EGFP-ER 단백질의 이동성은 표백 OSERs에 photobleaching에 후 빠른 형광 복구에 의해 증명된다. 정량 분석을 위해, 하프 타임 및 모바일 분획은 다음 방정식 단지 수 피팅에 의해 실험적으로 측정 된 데이터로부터 유도 하였다 :
F (t) = F 포스트 + (F의 REC-F의 게시물) (1-e-t / τ)
F 포스트 photobleaching에 후 형광 신호이고, F의 REC 등록시 t, 표백 후의 도달 시간 상수 τ되는 형광 극대 복구 값이다.
형광 복구를 변경하고, 결과적으로, .......
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토론
이 문서에 설명 된 프로토콜 및 이미징 방법은 살아있는 세포의 ER에 거주 형질 TA 형광 단백질의 분포와 이동을 조사하는 데 사용되었다. 우리는 또한 미세 구조 분석에 의해이 세포 내 구획의 구조에서 이러한 단백질의 과발현의 효과를 분석 하였다.
살아있는 세포 공 촛점 이미징 및 전자 현미경의 조합이 단백질의 동적 특성을 조사의 매우 강력한 수단이다 나타내고, 단백질 기능에 관한 중요한 정보를 제공 할 수있다. 한 방법은 시간 (일반적으로 일 사흘)을 소비하지 않고, 이미지 수집 및 분석을위한 많은 사용자 친화적 인 소프트웨어 응용 프로그램의 개발이 photobleaching에 기반, 라이브 세포 이미징 비교적 간단합니다.
이러한 기술의 주요 제한은 형광 융합 단백질의 사용이다 때문에형광 태그는 그 단백질의 적절한 폴딩 및 / 또는 어셈블리에 영향을 미칠 수있다. 또, 과다 발현은 형질 감염, 형광 태그로 단백질의 동작을 .......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
저자는이 문서의 게시에있는 그것의 도움과 지원을위한 폰다 치오 Filarete에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 TECNAI G2 투과 전자 현미경의 사용 센트로 피오 디 Nanomedicina에게 감사의 말씀을 전합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 둘베코' s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 41966029 | |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium(DMEM) w/o 페놀 레드 | Invitrogen | 31053028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 10270106 | |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-Glutamine 200 mM 용액 | Invitrogen | 25030-024 | |
| jetPEI | Polyplus Transfection | PP10110 | |
| OxyFluor | Oxyrase 주식회사 | OF-0005 | |
| 글루타르알데히드 등급 I | 시그마 알드리치 | G5882 | |
| 카코딜산나트륨 트리하이드레이트 | 시그마 알드리치 | C0250 | |
| 오스뮴 테트록사이드 4% 용액 | 전자 현미경 과학 | 19150 | |
| 우라닐 아세테이트 이수화물 | 시그마 알드리치 | 73943 | 경미한 |
| 방사성 프로필렌 옥사이드 | 시그마-알드리치 | 82320 | |
| EPON 임베딩 미디엄 키트 | Sigma-Aldrich | 45359-1EA-F | |
| Lead Citrate | Electron Microscopy Science | 17800 | |
| 벤치탑 원심분리기 | Eppendorf | 5415 D | |
| Spectral Confocal Microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| CO2 현미경 케이지 인큐베이션 시스템 | OkoLab | ||
| 초박극자 | Leica Microsystems | UC6 | |
| 다이아몬드 나이프 | Diatome | Ultra 45 ° | |
| 투과 전자 현미경 | FEI | Tecnai G2 | |
| GraphPad 프리즘 소프트웨어 | GraphPad Software, Inc | ||
| 24mm 커버슬립용 강철 배양 세포 챔버 | 생명과학 도구 | CSC-25 | |
| 전자 현미경 그리드 | 전자 현미경 과학 | G300Cu |
참고문헌
- Fasana, E., et al. A VAPB mutant linked to amyotrophic lateral sclerosis generates a novel form of organized smooth endoplasmic reticulum. FASEB J. 24, 1419-1430 (2010).
- Borgese, N., Francolini, M., Snapp, E. Endoplasmic reticulum....
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