방법 논문

이미징 및 면역 조직 화학에 대한 망막 Wholemount 준비를 위해 최적화 된 프로토콜

DOI:

10.3791/51018

⸱

2013년 12월 13일

 ,  ,  , 
1Ophthalmology, Weill Medical College of Cornell University

이 논문에서

요약

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여기에 설명된 프로토콜은 전체산 망막 제제의 구조적 평가를 위한 것입니다. 여기에는 조직 해부에 대한 설명, 친수성 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 멤브레인 삽입물에 장착, 형광 마커를 사용한 볼루스 로딩, 세포 및 시냅스 구성 요소의 면역조직화학 분석을 위한 카르보디이미드 및 파라포름알데히드와의 고정 비교가 포함됩니다.

초록

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면역 조직 화학적 평가를 수행 할 때 섬세한 조직으로 작업하는 것은 복잡한 요소가 될 수 있습니다. 여기서, 우리는 달리 조직의 손상을 야기 다양한 프로토콜의 사용을 허용 면역 처리 중에 거실 고정 조직 모두에 구조적지지를 제공하는 링 - 지원 수화 PTFE 멤브레인을 이용하는 방법을 제시한다. 첫째, 이것은 망막 조직 생활에 형광 마커의 알약로드와 함께 보여줍니다. 멤브레인 지원을 주입하는 동안 조직의 무결성을 유지하고 추가 영상 또는 처리를위한 준비를 쉽게 전송을 허용하는 동안이 방법은, 대상 구조를 신속하게 시각화 할 수 있습니다.

둘째, 카르 보디이 미드로 고정 조직에서의 항체 염색을위한 절차를 설명한다. 파라 포름 알데히드 고정이 일반적이지만, 카르 보디이 미드 고정 시냅스 단백질의 시각화를 위해 우수한 기판을 제공. 카르 보디이 미드의 제한으로 인해 발생하는 고정 된 조직이 상대적으로 약해이라고하고 있지만, 이것은지지 막의 사용하여 극복된다. 망막 조직은 이들 기술을 설명하기 위해 사용되지만, 그들은 어떤 깨지기 쉬운 조직에 적용될 수있다.

서론

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섬세하고 손상되지 않은 조직에 면역조직화학을 수행하면 취급 및 이식 중에 손상될 위험이 있습니다. 이것은 뇌 절편이나 퇴행성 망막과 같은 다른 얇은 조직에서 발생할 수 있습니다. 또한 신경 세포의 면역 염색에 유리할 수 있지만 구조적 안정성이 손상되어 사용을 방해할 수 있는 특정 조직 고정 방법이 있습니다. 이에 대한 특별한 예로는 카르보디이미드 기반 고정이 있는데, 이는 수용체와 호르몬1-7을 염색하는 데 우수하지만 고정 조직의 불안정성으로 인해 일반적으로 피합니다.

여기에서는 친수성 PTFE 멤브레인을 사용하여 다양한 염색 기술을 위해 고정 또는 고정되지 않은 섬세한 조직을 구조적으로 지지하는 절차를 설명합니다. 지지 멤브레인은 고정 전후에 섬세한 조직을 조작할 수 있어 조직 손상의 위험을 최소화하면서 여러 단계의 가공을 가능하게 합니다. 전반적으로, 조직의 무결성을 보존하기 위한 이 간단한 방법은 다른 방법으로는 피할 수 있는 기술을 사용할 수 있는 기회를 제공합니다. 따라서 이 접근 방식은 절단 절차에 따라 취약해지는 뇌 절편과 같은 다양한 조직을 준비하는 데에도 성공적으로 사용될 수 있습니다.

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프로토콜

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모든 실험 절차에서 동물은 안과 및 시력 연구에서의 동물 사용에 대한 ARVO 성명서의 규정에 따라 Weill Cornell Medical College에서 승인한 프로토콜에 따라 치료되었습니다. 동물들은 이산화탄소와 그에 따른 자궁경부 탈구에 의해 안락사되었다.

1. 전체산 망막 해부

  1. 쥐를 안락사시킨 후, 눈을 적출하여 산소가 공급된 HEPES 완충 링거 용액에 넣습니다(표 1).
  2. 작은 가위로 ora serrata를 따라 원형을 그리며 자르고 집게로 가장자리에서 눈을 잡아 각막을 제거합니다. 집게로 렌즈를 당겨 빼냅니다.
  3. 뭉툭한 모서리 집게를 사용하여 가능한 한 많은 유리체를 제거하십시오. 이 단계는 볼루스 주사 및 전기생리학적 기록에 중요합니다. 면역조직화학을 단독으로 수행하는 경우에는 필요하지 않습니다.
  4. 망막과 아이컵 사이에 집게를 배치하여 아이컵에서 망막을 분리하고 집게를 둘레를 따라 천천히 움직입니다. 두 번째 집게 세트로 공막을 단단히 잡아 아이컵을 고정합니다. 망막과 아이컵 사이의 시신경을 잘라 아이컵에서 망막이 쉽게 분리
    5. 되는 것을 용이하게 합니다.
  5. 망막은 조각(예: 4등분)으로 해부하거나 전체적으로 사용할 수 있습니다. 조각으로 자르려면 가위를 사용하여 망막 주변부에서 시신경까지 절개합니다. 또는 망막 전체를 사용하려면 주변부에서 시신경의 중간까지 절개합니다. 절개 부위는 평평하게 준비하는 데 도움이 됩니다.

2. 친수성 PTFE 멤브레인 인서트에 장착

  1. 아래 설명된 대로 멤브레인을 준비합니다. 생리학적 기록 또는 염료 주입 실험을 수행할 때 선반이나 핸드쏘를 사용하여 홀더의 높이를 줄여 나머지 링의 높이가 1mm가 되도록 합니다.
    참고: 배양 플레이트 인서트는 수정되지 않았거나 수정되었을 수 있습니다(그림 1A). 구성의 선택은 실험의 목적에 따라 결정됩니다. 면역 염색의 경우 변형되지 않은 인서트가 적합합니다.
  2. 미세한(300방 이상) 사포로 거친 표면을 연마합니다.
  3. (선택 사항) 가위로 링 아래의 발을 제거합니다.
  4. 이물질을 제거하려면 멤브레인을 증류수에 2-3분 동안 헹구거나 초음파 처리합니다.
  5. 조직을 멤브레인에 장착합니다(그림 1A). 플라스틱 이송 피펫으로 멤브레인 위에 용액이 든 조직을 놓습니다. 필요한 경우 피펫의 좁은 끝을 잘라 조직 샘플이 이송 중에 피펫에 부착되지 않도록 합니다.
  6. 신경절 세포(GC)가 위로 향하게 망막을 부착합니다: 막에서 망막을 펼치고 집게로 주름을 펴면서 용액을 서서히 제거합니다.
  7. 막의 반대쪽에 빈 주사기(1ml)를 조직 바로 아래에 놓습니다. 플런저를 0.2-0.3ml의 부피로 당겨 흡입을 적용합니다. 사용하기 전에 주사기의 고정 팁을 절단하여 흡입 표면적을 늘리십시오. 조직은 물리적으로 막 내에 얽혀 있기 때문에 접착을 위한 추가 처리가 필요하지 않습니다.

3. Isolectin Alexa 488의 볼루스 주사

  1. 패치 피펫과 염색 용액을 준비합니다. Flaming/Brown 풀러를 사용하여 붕규산 모세관 유리에서 ~1MΩ의 저항으로 패치 피펫을 당깁니다. 피펫의 끝을 부드럽게 부러뜨립니다.
  2. 1.2단계에서 설명한 10μl의 HEPES 완충 링거 용액에 0.3μl의 isolectin Alexa 488 원액을 첨가하여 염색 용액을 만듭니다.
  3. 주입을 위해 샘플을 patch-clamp 설정으로 옮깁니다(그림 1C). 조직이 부착된 멤브레인을 가열된(37°C) 및 산소화된 HEPES 완충 Ringer's 용액으로 관류된 기록 챔버에 놓습니다.
  4. 염료가 포함된 피펫을 내부 제한 멤브레인(ILM, 그림 2A)에 대고 놓습니다. micromanipulator를 사용하여 ILM을 관통할 때까지 피펫을 ILM에 대해 더 전진시킵니다. 피코스프리처를 사용하여 10-20psi의 압력으로 염색 용액을 1초 동안 주입합니다. 단일 또는 여러 위치가 주입 대상이 될 수 있습니다(그림 2B). 피코스프리처를 사용할 수 없는 경우 10ml 주사기를 사용하여 주입을 위한 양압을 전달할 수 있습니다.
  5. 주입된 조직을 10분 동안 배양합니다. 배양 중에 주입된 조직은 상피 형광 조명 아래에서 볼 수 있습니다.
  6. 라벨링 후, 제제는 이미징을 위해 현미경으로 가져갈 수 있습니다. 삽입물을 유리 바닥 배양 접시로 옮기고 망막 면이 아래로 향하게 놓습니다(그림 1C).
  7. 표본을 촉촉하게 유지하기 위해 HEPES 용액 한 방울을 첨가하십시오.
  8. 플라스틱 링의 둘레에 진공 그리스 2-3점을 놓아 인서트를 배양 접시 바닥에 단단히 고정합니다.
  9. 접시를 현미경 스테이지로 옮깁니다.

4. 파라포름알데히드 및 카르보디이미드 고정

  1. 삽입물을 정착액에 15분 동안 옮겨 샘플을 고정합니다. 용도에 따라 더 길거나 더 짧은 고정 시간이 사용될 수 있습니다. 두 고정제 모두 GFP, 이소렉틴 또는 형광 Alexa 히드라지드를 고정하는 데 효과적으로 사용할 수 있습니다(예: 패치 클램프 기록에서 세포를 채우는 데 사용).
    참고: 고정을 위해 4% 카르보디이미드 또는 4% 파라포름알데히드 용액을 사용할 수 있습니다. 순응도를 유지하려면 조직이 이미 멤브레인에 부착된 후에 고정을 수행해야 합니다. 조직은 장착 직후 또는 생리학적 기록 및/또는 볼루스 주입 후에 고정할 수 있습니다.
  2. 조직을 인산염 완충액(PB)으로 30분 동안 헹굽니다. 그 후, 조직을 전체산(5단계)으로 가공하거나 수직 절편으로 절단한 후 가공할 수 있습니다(6단계 및 7단계).

5. 망막 전체산의 면역염색

  1. 24웰 접시(그림 1D)에서 염색 용액으로 멤브레인의 망막 조각을 1시간 동안 차단합니다.
  2. 염색액에 mouse anti-PSD-95 1차 항체를 1:300으로 희석하고 어두운 곳에서 실온에서 48시간 동안 적용합니다. 조직과 함께 각 웰에 ~100-150μl 항체 용액을 추가합니다. 건조를 방지하려면 사용하지 않는 우물에 증류수를 채우십시오.
  3. PB로 20분, 3회 헹굽니다.
  4. 염색 용액에 1:500 분으로 용해된 당나귀 안티 마우스 Alexa 568 2차 항체에서 24시간 동안 배양합니다.
  5. PB로 20분, 3회 헹굽니다.
  6. 염색된 조직이 있는 삽입물을 PB 용액으로 채워진 표준 3cm 페트리 접시에 넣습니다. 작은 가위로 고리에서 망막을 포함하는 막 부분을 잘라냅니다.
  7. 막의 망막을 위로 슬라이드하여 망막으로 옮깁니다. PB를 제거하고 장착 매체를 추가합니다. 망막이 광범위하게 조여지거나 손상되는 것을 방지하기 위해 슬라이드와 커버슬립 유리 사이에 깨진 커버 슬립 유리의 작은 조각을 놓으십시오. 커버슬립을 놓습니다.
  8. 매니큐어로 커버슬립을 제자리에 밀봉합니다. 슬라이드를 어두운 곳, 냉장고에 보관하십시오.

6. 멤브레인 장착 조직의 수직 절편

  1. 고정 후 멤브레인의 조직을 10%, 20% 및 30% 자당 구배 용액에 각각 30분, 1시간, 하룻밤 동안 담그십시오. 하룻밤 단계는 냉장고에서 4°C에서 수행되고 다른 모든 단계는 실온에서 수행됩니다.
  2. 가위를 사용하여 플라스틱 삽입 링에서 조직이 있는 멤브레인을 제거합니다.
  3. 절단된 멤브레인을 망막이 위로 향하게 하여 파라필름에 놓고 Kimwipes로 가능한 한 많은 용액을 제거합니다.
  4. 조직이 있는 파라필름을 저온 유지 챔버에 넣고 OCT 배지 한 방울을 추가합니다. 급속 냉동고 장치를 사용하여 동결을 가속화하십시오.
  5. 얼어붙은 샘플을 분리하고 뒤집습니다.
  6. 여분의 냉동 OCT를 자릅니다.샘플 주위 3면에 약 2mm를 남겨두고 홀더에 부착할 면에서 5-6mm를 남겨둡니다.
  7. 노출된 망막 쪽(멤브레인 쪽)을 OCT 한 방울로 덮습니다. 부착 영역을 비워 둡니다.
  8. 망막 조직으로 막을 동결합니다. 이제 샘플을 절단 홀더에 놓을 준비가 되었습니다.
  9. 콜드 홀더 링에 OCT 한 방울을 떨어뜨립니다. 즉시 얼어붙은 샘플을 드롭에 삽입하십시오.
  10. 절편을 10-20μm 두께로 절단하고 저온 유지 온도를 -19°C로 설정합니다.따뜻한(실온) 폴리신 접착 슬라이드를 사용합니다. 섹션이 부착된 슬라이드를 어두운 곳에서 ~2-3분(41°C) 동안 가열 플랫폼에 그대로 두어 섹션의 견고한 접착을 보장합니다.
  11. 슬라이드를 보관 상자에 넣고 사용할 때까지 -20 °C를 유지하십시오.

7. 망막 부분의 면역 염색

  1. 섹션이 있는 슬라이드를 냉동실에서 꺼냅니다. 응축수를 제거하기 위해 1분 동안 실온에 두십시오.
  2. 액체 차단제로 섹션을 둘러싸서 추가 배양을 위한 장벽을 만듭니다.
  3. 슬라이드를 배양 상자에 넣습니다. 항체 용액의 증발을 방지하기 위해 상자 바닥을 물로 덮으십시오.
  4. PB로 5분 동안 헹굽니다.
  5. 동일한 염색 용액을 준비하고 5단계와 같은 단계를 따릅니다. 1차 항체를 사용한 배양은 하룻밤 동안, 2차 항체는 1시간 동안 배양합니다. 커버슬립과 슬라이드 사이에 깨진 유리를 사용하지 마십시오.

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결과

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염색 절차 중 전체산 망막을 지지하기 위해 친수성 PTFE 멤브레인을 사용하여 이점을 얻을 수 있는 두 가지 대표적인 실험이 여기에 나와 있습니다. 첫 번째 실험은 여러 망막층에 걸쳐 있는 정교한 혈관 네트워크인 망막 혈관 구조를 빠르고 간단하게 특성화하는 방법을 보여줍니다(그림 2). 이 접근법은 이소렉틴의 볼루스 로딩과 SRH를 사용한 침지 라벨링을 결합합니다. 이것은 거의 즉각적으로 시각화하고 스캔할 수 있는 살아있는 조직을 라벨링하는 효율적인 방법입니다. 망막에서 혈관은 표층에서 심층까지 표지할 수 있습니다(그림 2E). 상대적으로 확산성이 높은 SRH와 달리, 이소렉틴은 내제한막(ILM)을 잘 통과하지 않습니다. 이 한계는 ILM 아래에 있는 이소렉틴이 포함된 용액을 유리 피펫으로 주입함으로써 극복할 수 있습니다. SRH 혈관 라벨링의 경우 인서트에 장착하기 전에 조직을 염색하는 것이 좋습니다. SRH는 살아있는 조직만 염색하고 파라포름알데히드 또는 카르보디이...

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토론

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친수성 PTFE 멤브레인의 높은 생체 적합성과 용액의 투명성은 살아있는 조직으로 작업할 때 유리합니다. 이 준비는 빛 반응8-10의 패치 클램프 기록을 위한 이전 작업에서 성공적으로 사용되었습니다. 여기에서는 이 접근법이 전체 망막의 구조 분석에 어떻게 채택될 수 있는지 보여줍니다.

볼루스 로딩 기술은 살아있는 조직을 라벨링하는 데 효과적으로 사용될 수 있습니다. 이 기술은 멤브레인 인서트의 구조적 지지에 의해 도움이 됩니다. 응용 분야에는 칼슘 지시약(9)의 로딩, 형광 마커(11) 또는 표지된 리간드(12)로 조직을 염색하는 것이 포함됩니다.

고정 조직 처리는 지지 멤브레인을 사용하면 이점을 얻을 수도 있습니다. 시냅스 후 밀도 단백질의 모양의 차이는 고정 시간과 고정제의 특성에 따라 다릅니다5. 고정 시간이 길수록 조직 보존은 ...

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 NIH 보조금 R01-EY020535(B.T.S), 국제 망막 연구 재단 및 칼 키르히게스너 재단(B.T.S)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
밀리셀 세포 배양 인서트, 12mm,
친수성 PTFE(Biopore), 0.4 & m		MilliporePICM01250
인슐린 주사기, 1 mlBeckton Dickinson309659
가위Fine Science Tools15003-08해부
겸자, Dumont # 55, inoxFine Science Tools11255-20해부
저온 유지 장치Leica다양한
컨 포칼 현미경 시스템Nikon다양한
모세관 유리World Precision Instruments1B150F-4
P-97 Flaming/Brown Micropipette PullerSutter Instrument Co.
Picospritzer IIIParker Hannifin
유리 바닥 문화 접시MatTek CorporationP35G-0-14-C
페트리 접시Falcon1008
일회용 눈금 이동 피펫VWR16001-180
Multiwell 플레이트, 24-wellBeckton Dickinson351147
커버 유리, #1전자 현미경 과학72200-30
폴리사인 접착 슬라이드전자 현미경 과학63412-01
현미경 슬라이드글로브1301
액체 차단제전자 현미경 과학71312
VECTASHIELD 장착 매체Vector LaboratoriesH-1000
OCT 미디엄사쿠라4583
파라필름 실험실 필름피셔13-374-10
다우 코닝 고진공 그리스시그마 알드리치Z273554
마우스 안티 PSD95밀리포어MABN68항체
당나귀 안티 마우스 알렉사 568인비트로젠A10037항체
이소렉틴 알렉사 488인비트로겐I21411
케미블로커케미콘2170S
트리톤 X-100시그마-알드리치T9284
설포호다민시그마-알드리치341738
카르보디이미드Thermo Scientific22980EDC
파라포름알데히드시그마-알드리치P6148

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Csaba, G., Kovacs, P., Pallinger, E. EDAC fixation increases the demonstrability of biogenic amines in the unicellular Tetrahymena: a flow cytometric and confocal microscopic comparative analysis. Cell Biol. Int. 30, 345-348 (2006).
  2. Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstatter, J. H., Wassle, H. Synaptic localization of NMDA receptor subunits in the rat retina. J. Comp. Neurol. 420, 98-112 (2000).
  3. Gastinger, M. J., O'Brien, J. J., Larsen, N. B., Marshak, D. W. Histamine immunoreactive axons in the macaque retina. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 40, 487-495 (1999).
  4. Haverkamp, S., Wassle, H. Immunocytochemical analysis of the mouse retina. J. Comp. Neurol. 424, 1-23 (2000).
  5. Koulen, P., Fletcher, E. L., Craven, S. E., Bredt, D. S., Wassle, H. Immunocytochemical localization of the postsynaptic density protein PSD-95 in the mammalian retina. J. Neurosci. 18, 10136-10149 (1998).
  6. Pena, J. T., et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nat. Methods. 6, 139-141 (2009).
  7. Tymianski, M., et al. A novel use for a carbodiimide compound for the fixation of fluorescent and non-fluorescent calcium indicators in situ following physiological experiments. Cell Calcium. 21, 175-183 (1997).
  8. Sagdullaev, B. T., Eggers, E. D., Purgert, R., Lukasiewicz, P. D. Nonlinear interactions between excitatory and inhibitory retinal synapses control visual output. J. Neurosci. 31, 15102-15112 (2011).
  9. Toychiev, A. H., Sagdullaev, B., Yee, C. W., Ivanova, E., Sagdullaev, B. T. A time and cost efficient approach to functional and structural assessment of living neuronal tissue. J. Neurosci. Methods. 214, 105-112 (2013).
  10. Yee, C. W., Toychiev, A. H., Sagdullaev, B. T. Network deficiency exacerbates impairment in a mouse model of retinal degeneration. Front Syst. Neurosci. 6, 8(2012).
  11. Ivanova, E., Muller, U., Wassle, H. Characterization of the glycinergic input to bipolar cells of the mouse retina. Eur. J. Neurosci. 23, 350-364 (2006).
  12. Dmitrieva, N. A., Strang, C. E., Keyser, K. T. Expression of alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors by bipolar, amacrine, and ganglion cells of the rabbit retina. J. Histochem. Cytochem. 55, 461-476 (2007).

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