방법 논문

이미징 및 면역 조직 화학에 대한 망막 Wholemount 준비를 위해 최적화 된 프로토콜

DOI:

10.3791/51018

⸱

2013년 12월 13일

 ,  ,  , 
1Ophthalmology, Weill Medical College of Cornell University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 설명된 프로토콜은 전체산 망막 제제의 구조적 평가를 위한 것입니다. 여기에는 조직 해부에 대한 설명, 친수성 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 멤브레인 삽입물에 장착, 형광 마커를 사용한 볼루스 로딩, 세포 및 시냅스 구성 요소의 면역조직화학 분석을 위한 카르보디이미드 및 파라포름알데히드와의 고정 비교가 포함됩니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

면역 조직 화학적 평가를 수행 할 때 섬세한 조직으로 작업하는 것은 복잡한 요소가 될 수 있습니다. 여기서, 우리는 달리 조직의 손상을 야기 다양한 프로토콜의 사용을 허용 면역 처리 중에 거실 고정 조직 모두에 구조적지지를 제공하는 링 - 지원 수화 PTFE 멤브레인을 이용하는 방법을 제시한다. 첫째, 이것은 망막 조직 생활에 형광 마커의 알약로드와 함께 보여줍니다. 멤브레인 지원을 주입하는 동안 조직의 무결성을 유지하고 추가 영상 또는 처리를위한 준비를 쉽게 전송을 허용하는 동안이 방법은, 대상 구조를 신속하게 시각화 할 수 있습니다.

둘째, 카르 보디이 미드로 고정 조직에서의 항체 염색을위한 절차를 설명한다. 파라 포름 알데히드 고정이 일반적이지만, 카르 보디이 미드 고정 시냅스 단백질의 시각화를 위해 우수한 기판을 제공. 카르 보디이 미드의 제한으로 인해 발생하는 고정 된 조직이 상대적으로 약해이라고하고 있지만, 이것은지지 막의 사용하여 극복된다. 망막 조직은 이들 기술을 설명하기 위해 사용되지만, 그들은 어떤 깨지기 쉬운 조직에 적용될 수있다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

섬세하고 손상되지 않은 조직에 면역조직화학을 수행하면 취급 및 이식 중에 손상될 위험이 있습니다. 이것은 뇌 절편이나 퇴행성 망막과 같은 다른 얇은 조직에서 발생할 수 있습니다. 또한 신경 세포의 면역 염색에 유리할 수 있지만 구조적 안정성이 손상되어 사용을 방해할 수 있는 특정 조직 고정 방법이 있습니다. 이에 대한 특별한 예로는 카르보디이미드 기반 고정이 있는데, 이는 수용체와 호르몬1-7을 염색하는 데 우수하지만 고정 조직의 불안정성으로 인해 일반적으로 피합니다.

여기에서는 친수성 PTFE 멤브레인을 사용하여 다양한 염색 기술을 위해 고정 또는 고정되지 않은 섬세한 조직을 구조적으로 지지하는 절차를 설명합니다. 지지 멤브레인은 고정 전후에 섬세한 조직을 조작할 수 있어 조직 손상의 위험을 최소화하면서 여러 단계의 가공을 가능하게 합니다. 전반적으로, 조직의 무결성을 보존하기 위한 이 간단한 방법은 다른 방법으로는 피할 수 있는 기술을 사용할 수 있는 기회를 제공합니다. 따라서 이 접근 방식은 절단 절차에 따라 취약해지는 뇌 절편과 같은 다양한 조직을 준비하는 데에도 성공적으로 사용될 수 있습니다.

....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 실험 절차에서 동물은 안과 및 시력 연구에서의 동물 사용에 대한 ARVO 성명서의 규정에 따라 Weill Cornell Medical College에서 승인한 프로토콜에 따라 치료되었습니다. 동물들은 이산화탄소와 그에 따른 자궁경부 탈구에 의해 안락사되었다.

1. 전체산 망막 해부

  1. 쥐를 안락사시킨 후, 눈을 적출하여 산소가 공급된 HEPES 완충 링거 용액에 넣습니다(표 1).
  2. 작은 가위로 ora serrata를 따라 원형을 그리며 자르고 집게로 가장자리에서 눈을 잡아 각막을 제거합니다. 집게로 렌즈를 당겨 빼냅니다.
  3. 뭉툭한 모서리 집게를 사용하여 가능한 한 많은 유리체를 제거하십시오. 이 단계는 볼루스 주사 및 전기생리학적 기록에 중요합니다. 면역조직화학을 단독으로 수행하는 경우에는 필요하지 않습니다.
  4. 망막과 아이컵 사이에 집게를 배치하여 아이컵에서 망막을 분리하고 집게를 둘레를 따라 천천히 움직입니다. 두 번째 집게 세트로 공막을 단단히 잡아 아이컵을 고정합니다. 망막과 아이컵 사이의 시신경을 잘라 아이컵에서 망막이 쉽게 분리
    5. 되는 것을 용이하게 합니다.
  5. 망막은 조각(예: 4등분)으....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

염색 절차 중 전체산 망막을 지지하기 위해 친수성 PTFE 멤브레인을 사용하여 이점을 얻을 수 있는 두 가지 대표적인 실험이 여기에 나와 있습니다. 첫 번째 실험은 여러 망막층에 걸쳐 있는 정교한 혈관 네트워크인 망막 혈관 구조를 빠르고 간단하게 특성화하는 방법을 보여줍니다(그림 2). 이 접근법은 이소렉틴의 볼루스 로딩과 SRH를 사용한 침지 라벨링을 결합합니다. 이것은 거의 즉각적으로 시각화하고 스캔할 수 있는 살아있는 조직을 라벨링하는 효율적인 방법입니다. 망막에서 혈관은 표층에서 심층까지 표지할 수 있습니다(그림 2E). 상대적으로 확산성이 높은 SRH와 달리, 이소렉틴은 내제한막(ILM)을 잘 통과하지 않습니다. 이 한계는 ILM 아래에 있는 이소렉틴이 포함된 용액을 유리 피펫으로 주입함으로써 극복할 수 있습니다. SRH 혈관 라벨링의 경우 인서트에 장착하기 전에 조직을 염색하는 것이 좋습니다. SRH는 살아있는 조직만 염색하고 파라포름알데히드 또는 카르보디이.......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

친수성 PTFE 멤브레인의 높은 생체 적합성과 용액의 투명성은 살아있는 조직으로 작업할 때 유리합니다. 이 준비는 빛 반응8-10의 패치 클램프 기록을 위한 이전 작업에서 성공적으로 사용되었습니다. 여기에서는 이 접근법이 전체 망막의 구조 분석에 어떻게 채택될 수 있는지 보여줍니다.

볼루스 로딩 기술은 살아있는 조직을 라벨링하는 데 효과적으로 사용될 수 있습니다. 이 기술은 멤브레인 인서트의 구조적 지지에 의해 도움이 됩니다. 응용 분야에는 칼슘 지시약(9)의 로딩, 형광 마커(11) 또는 표지된 리간드(12)로 조직을 염색하는 것이 포함됩니다.

고정 조직 처리는 지지 멤브레인을 사용하면 이점을 얻을 수도 있습니다. 시냅스 후 밀도 단백질의 모양의 차이는 고정 시간과 고정제의 특성에 따라 다릅니다5. 고정 시간이 길수록 조직 보존은 .......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 NIH 보조금 R01-EY020535(B.T.S), 국제 망막 연구 재단 및 칼 키르히게스너 재단(B.T.S)의 지원을 받았습니다.

....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
밀리셀 세포 배양 인서트, 12mm,
친수성 PTFE(Biopore), 0.4 & m		MilliporePICM01250
인슐린 주사기, 1 mlBeckton Dickinson309659
가위Fine Science Tools15003-08해부
겸자, Dumont # 55, inoxFine Science Tools11255-20해부
저온 유지 장치Leica다양한
컨 포칼 현미경 시스템Nikon다양한
모세관 유리World Precision Instruments1B150F-4
P-97 Flaming/Brown Micropipette PullerSutter Instrument Co.
Picospritzer IIIParker Hannifin
유리 바닥 문화 접시MatTek CorporationP35G-0-14-C
페트리 접시Falcon1008
일회용 눈금 이동 피펫VWR16001-180
Multiwell 플레이트, 24-wellBeckton Dickinson351147
커버 유리, #1전자 현미경 과학72200-30
폴리사인 접착 슬라이드전자 현미경 과학63412-01
현미경 슬라이드글로브1301
액체 차단제전자 현미경 과학71312
VECTASHIELD 장착 매체Vector LaboratoriesH-1000
OCT 미디엄사쿠라4583
파라필름 실험실 필름피셔13-374-10
다우 코닝 고진공 그리스시그마 알드리치Z273554
마우스 안티 PSD95밀리포어MABN68항체
당나귀 안티 마우스 알렉사 568인비트로젠A10037항체
이소렉틴 알렉사 488인비트로겐I21411
케미블로커케미콘2170S
트리톤 X-100시그마-알드리치T9284
설포호다민시그마-알드리치341738
카르보디이미드Thermo Scientific22980EDC
파라포름알데히드시그마-알드리치P6148

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Csaba, G., Kovacs, P., Pallinger, E. EDAC fixation increases the demonstrability of biogenic amines in the unicellular Tetrahymena: a flow cytometric and confocal microscopic comparative analysis. Cell Biol. Int. 30, 345-348 (2006).
  2. Fletcher, E. L., Hack, I., Brandstatter, J. H., Wassle, H.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

Retinal Whlemount PreparationImmunohistochemical StainingCarbodiimide FixationFluorescent Marker LoadingTissue StabilizationMembrane Support TechniqueSynaptic Protein ImagingRetinal Tissue PreparationFluorescence MicroscopyCryostat Sectioning

관련 논문